Summary

Özgürce Davranan Farenin Amigdalasında Kafaya Monte Minyatür Mikroskop ile Başarılı In vivo Kalsiyum Görüntüleme

Published: August 26, 2020
doi:

Summary

In vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntüleme, özgürce davranan hayvanlarda nöronal aktivitelerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan paha biçilmez bir araçtır. Ancak bu tekniği amigdalaya uygulamak zor olmuştur. Bu protokol, farelerde minyatürleştirilmiş bir mikroskopla amigdala hücrelerini başarıyla hedeflemek için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.

Abstract

In vivo serbestçe hareket eden hayvanlarda nöronal aktivitelerin gerçek zamanlı izlenmesi, nöronal aktiviteyi davranışa bağlamak için temel yaklaşımlardan biridir. Bu amaçla, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI’ler), minyatürleştirilmiş bir floresan mikroskobu ve gradyan refraktif indeks (GRIN) lensi kullanarak nöronlardaki kalsiyum geçicilerini tespit eden bir in vivo görüntüleme tekniği geliştirilmiş ve birçok beyinyapısına 1, 2,3,4,5,6başarıyla uygulanmıştır. Bu görüntüleme tekniği özellikle güçlüdür, çünkü genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarının birkaç haftaya kadar uzun süreli kronik eşzamanlı görüntülenmesini sağlar. Yararlı olmasına rağmen, bu görüntüleme tekniği, duygusal işlem ve ilişkilendirilebilir korku hafızası için gerekli bir beyin yapısı olan amigdala gibi beynin derinliklerine yer alan beyin yapılarına kolayca uygulanmamıştır7. Görüntüleme tekniğinin amigdalaya uygulanmasını zorlaştırıcı birkaç faktör vardır. Örneğin, hareket eserleri genellikle daha derin beyin bölgelerinde yapılan görüntüleme sırasında daha sık ortaya çıkar, çünkü beynin derinliklerine yerleştirilen bir kafaya monte mikroskop nispeten kararsızdır. Diğer bir sorun ise lateral ventrikülün implante grin lense yakın konumlandırılması ve solunum sırasındaki hareketinin kolayca düzeltilemeyen son derece düzensiz hareket yapıtlarına neden olmasıdır, bu da kararlı bir görüntüleme görünümü oluşturmayı zorlaştırır. Ayrıca, amigdaladaki hücreler genellikle dinlenme veya uyuşturulma durumunda sessiz olduğundan, daha sonraki görüntüleme için temelleme prosedürü sırasında amigdalada GECI’yi ifade eden hedef hücreleri bulmak ve odaklamak zordur. Bu protokol, bu kadar derin bir beyin bölgesinde başarılı in vivo kalsiyum görüntüleme için kafa montajlı minyatür mikroskop ile amigdaladaki GECI’yi ifade eden hücrelerin nasıl verimli bir şekilde hedeflenerek hedeflendirılacağına dair yararlı bir kılavuz sağlar. Bu protokolün belirli bir sisteme (örneğin, Inscopix) dayandığı, ancak bununla sınırlı olmadığı belirtilmiştir.

Introduction

Kalsiyum her yerde bulunan ikinci bir habercidir, hemen hemen her hücresel işlevde çok önemli bir rol oynar8. Nöronlarda, eylem potansiyeli ateşleme ve sinaptik giriş hücre içi serbest [Ca2+]9,10’unhızlıdeğişmesineneden olur. Bu nedenle, kalsiyum geçicilerini izlemek nöronal aktiviteyi izlemek için bir fırsat sağlar. GECI’ler, tanımlanmış hücre popülasyonlarında ve hücre içi bölmelerde[Ca 2+] izlenmesine izin veren güçlü araçlardır11,12. Protein bazlı kalsiyum göstergesinin birçok farklı türü arasında, tek bir GFP molekülü13’edayanan bir Ca2+ probu olan GCaMP, en optimize edilmiş ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan GECI’dir. Birden fazla mühendislik turu sayesinde, GCaMP’nin bir dizi çeşidigeliştirilmiştir 12,14,15,16. Son geliştirilen GCaMPP’lerden birini kullanıyoruz, GCaMP7b, bu protokolde16. GCaMP sensörleri, geliştirme sırasında Ca2+ geçicilerinin görüntülenmesi, belirli bir kortikal tabakada in vivo görüntüleme18, motor görev öğreniminde devre dinamiklerinin ölçümü19ve hipokampus ve amigdala 20,21’deki ilişkisel korku hafızası ile ilgili hücre topluluğu aktivitesinin görüntülenmesi gibi bir dizi model organizmadanöraldevre fonksiyonlarının incelenmesine büyük katkıda bulunmuştur.

GECI’lerin optik görüntülemesinin çeşitli avantajları vardır22. Genetik kodlama, GECI’lerin genetik profil veya belirli anatomik bağlantı kalıpları ile tanımlanan belirli bir hücre alt kümesinde uzun süreli bir süre boyunca saptanmasını sağlar. Optik görüntüleme, canlı hayvanlarda yüzlerce ila binlerce nöronun in vivo kronik eşzamanlı izlenmesini sağlar. Kafa montajlı minyatür floresan mikroskoplar21, 23,24,25ile serbestçe davranan farelerin beynindeki GECI’lerin in vivo görüntüleme ve analizi için birkaç optik görüntüleme sistemi geliştirilmiştir. GECI’lere dayanan in vivo optik görüntüleme tekniğine, GRIN lense ve kafaya monte minyatür mikroskobun nöral devre aktivitesi ve davranışı arasındaki bağlantıyı incelemek için güçlü bir araç olmasına rağmen, bu teknolojinin amigdalaya uygulanması, GÖRÜNTÜ alma kalitesini ciddi şekilde azaltan hareket yapıtlarına neden olmadan amigdaladaki GECI’leri ifade eden hücrelere GRIN lensin hedef alınmasıyla ilgili çeşitli teknik sorunlar nedeniyle zor olmuştur. Bu protokol, amigdalada başarılı in vivo optik kalsiyum görüntüleme için kritik adımlar olan baseplate eki ve GRIN lens implantasyonunun cerrahi prosedürleri için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol amigdalayı hedeflemesine rağmen, burada açıklanan çoğu prosedür genellikle diğer derin beyin bölgeleri için geçerlidir. Bu protokol belirli bir sisteme (örneğin Inscopix) dayansa da, aynı amaca diğer alternatif sistemlerle kolayca ulaşılabilir.

Protocol

Tüm prosedürler Kore İleri Bilim ve Teknoloji Enstitüsü Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı. Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi’nin kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirildi. NOT: Bu protokol altı ana adımdan oluşur: virüs enjeksiyon cerrahisi, GRIN lens implant cerrahisi, GRIN lens implantasyonunun doğrulanması, taban plakası eki, davranış testi sırasında GCaMP sinyalinin optik kaydı ve veri işleme (Şekil 1A). Am…

Representative Results

GRIN lens implantasyonunun doğrulanmasıTaban plakasını çimentolama ile beyne kronik olarak takmadan önce, GRIN lens implantasyonunun doğrulanması gerekir. Başarılı lens implantasyonu olan hayvanlarda, hem GCaMP ekspresyasyon hücreleri hem de kan damarları, mikroskopun objektif lensi ile implante grin lens arasındaki mesafe ile belirlenen bir odak düzlemi aralığında açıkça gözlenmiştir (Şekil 2A ve B). Buna karş…

Discussion

Burada anlattığımız gibi amigdala gibi daha derin beyin bölgelerinde kafaya monte minyatür mikroskopi ile in vivo optik kalsiyum görüntülemede başarılı olmak için ustaca cerrahi teknikleri şarttır. Bu nedenle, bu protokol temel ataşman ve GRIN lens implantasyonunun optimize edilmiş cerrahi süreçleri için bir kılavuz sağlasa da, kritik adımlar için ek optimizasyon süreçleri gerekebilir. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, cerrahide amigdala koordinatları, taban plakası ek adımında hava …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Samsung Bilim ve Teknoloji Vakfı’nın (Proje Numarası SSTF-BA1801-10) hibeleri ile desteklendi.

Materials

26G needle BD 302002 Surgery
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE Addgene 104493-AAV1 Surgery
AAV2/1-CaMKiiα-GFP custom made Surgery
Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) Lang 1334-pink Surgery & Baseplate Attachment
Air flow manipulator Neurotar NTR000253-04 Baseplate Attachment
Amoxicillin SIGMA A8523-5G Surgery
Baseplate INSCOPIX 1050-002192 Baseplate Attachment
Baseplate cover INSCOPIX 1050-002193 Baseplate Attachment
Behavioral apparatus (chamber) Coulbourn Instrument Testcage Behavior test
Behavioral apparatus (software) Coulbourn Instrument Freeze Frame Behavior test
Carbon cage Neurotar 180mm x 70mm Baseplate Attachment
Carprofen SIGMA PHR1452-1G Surgery
Data processing software INSCOPIX INSCOPIX Data Processing Software Baseplate Attachment & Behavior test
Dexamethasone SIGMA D1756-500MG Surgery
Drill Seyang marathon-4 Surgery
Drill bur ELA US1/2, Shank104 Surgery
Glass needle WPI PG10165-4 Surgery
GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) INSCOPIX 1050-002208 Surgery
Hamilton Syringe Hamilton 84875 Surgery
Head plate Neurotar Model 5 Surgery
Hex-key INSCOPIX 1050-004195 Baseplate Attachment
Laptop computer Samsung NT950XBV Surgery & Baseplate Attachment
Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) INSCOPIX 1050-004223 Surgery
Microscope gripper INSCOPIX 1050-002199 Baseplate Attachment
Microscope, DAQ software, hardware INSCOPIX nVista 3.0 Baseplate Attachment & Behavior test
Mobile homecage Neurotar MHC V5 Baseplate Attachment
Moterized arm Neurostar Customized Surgery
Moterized arm software Neurostar Customized Surgery
NI board National instrument Behavior test
Removable epoxy bond WPI Kwik-Cast Surgery
Resin cement (Super-bond) Sun medical Super bond C&B Surgery
Skull screw Stoelting 51457 Surgery
Stereotaxic electrode holder ASI EH-600 Surgery
Stereotaxic frame Stoelting 51600 Surgery
Stereotaxic manipulator Stoelting 51600 Baseplate Attachment

References

  1. Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
  2. Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
  3. Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
  4. Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
  5. Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
  6. Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
  7. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
  8. Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
  9. Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
  10. Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
  11. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  12. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  14. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  17. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  18. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  19. Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
  20. Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
  21. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  22. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  23. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  24. Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
  25. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  26. Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
  27. Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
  28. Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
  29. McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
  30. McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).

Play Video

Cite This Article
Lee, H., Han, J. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (162), e61659, doi:10.3791/61659 (2020).

View Video