Summary
体内显微内窥镜钙成像是一种宝贵的工具，能够实时监测自由行为动物的神经元活动。然而，将这种技术应用于杏仁核是很困难的。该协议旨在为成功瞄准小鼠的杏仁核细胞提供有用的指南。
Abstract
在体内实时监测自由移动动物的神经元活动是将神经元活动与行为联系起来的关键方法之一。为此，利用基因编码的钙指标（GECIs）、微型荧光显微镜和梯度折射指数（GRIN）透镜，开发并成功应用于许多大脑结构1、2、3、4、5、6，检测神经元中的钙瞬态。这种成像技术特别强大，因为它能够长期同时对基因定义的细胞群进行长达几周的成像。虽然有用，这种成像技术不容易应用于大脑结构，位于大脑深处，如杏仁核，情感处理和关联恐惧记忆7的基本大脑结构。有几个因素使得很难将成像技术应用于杏仁核。例如，在更深的大脑区域进行成像时，运动伪影物通常更频繁地发生，因为植入大脑深处的头部安装显微镜相对不稳定。另一个问题是，横向心室位于靠近植入的 GRIN 透镜的位置，其呼吸过程中的运动可能会导致无法轻松校正的高度不规则运动伪影，从而难以形成稳定的成像视图。此外，由于杏仁核中的细胞通常处于静止或麻醉状态，因此很难在碱基板过程中找到并聚焦在杏仁核中表达GECI的目标细胞，以备日后成像之用。该协议为如何用头安装微型显微镜有效定位杏仁核中表达GECI的细胞提供了一个有用的指南，从而成功地在如此深的大脑区域进行体内钙成像。需要注意的是，此协议基于特定系统（例如 Inscopix），但不限于此系统。
Introduction
钙是无处不在的第二信使，在几乎每一个细胞功能中都起着至关重要的作用。在神经元中，动作电位激发和突触输入导致细胞内自由[Ca2]9，10的快速变化。因此，跟踪钙瞬态提供了一个监测神经元活动的机会。GECIs 是一种强大的工具，可以监测 [Ca2+] 在定义的细胞群和细胞内隔间11，12。在许多不同类型的基于蛋白质的钙指标中，基于单个GFP分子13的Ca2+探针GCaMP是最优化的，因此被广泛使用GECI。通过多轮工程，已开发出12、14、15、16等多种GCAMP变型。我们使用最近开发的GCaMP之一，GCaMP7b，在此协议16。GCaMP传感器为研究一些模型生物体的神经回路功能做出了巨大贡献，如17日开发过程中的Ca2+瞬态成像、特定皮质层18的体内成像、运动任务学习19中的电路动力学测量以及与海马和杏仁核20、21中关联恐惧记忆相关的细胞合奏活性的成像。
GECI的光学成像有几个优点。基因编码使 GECIs 能够在由遗传特征或解剖连接特定模式定义的特定细胞子集中长期稳定地表达。光学成像使活体动物中数百到数千个神经元的体内慢性同步监测。一些光学成像系统已经开发出来，用于对大脑内的GECI进行体内的活体成像和分析，这些小鼠的大脑中带有头部安装的微型荧光显微镜21、23、24、25。尽管基于GECIs、GRIN镜头和头坐式微型显微镜的体内光学成像技术是研究神经回路活动和行为之间联系的有力工具，但由于将GLIN透镜瞄准杏仁核中表达GECIs的细胞而未引起运动伪影，从而严重降低了图像采集质量和寻找表达GECIs的细胞，因此将这项技术应用于杏仁核一直存在一些技术问题。该协议旨在为基板附件和 GRIN 镜头植入的外科手术提供一个有用的指南，这是成功在杏仁核体内进行光学钙成像的关键步骤。虽然此协议针对杏仁核，但此处描述的大多数程序通常适用于其他更深的大脑区域。虽然此协议基于特定系统（例如 Inscopix），但与其他替代系统很容易实现相同的目的。
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Protocol
所有程序均得到韩国高等科学技术研究所动物伦理委员会的批准。所有实验均按照机构动物护理和使用委员会的准则进行。
注：此协议包括六个主要步骤：病毒注射手术、GRIN 镜头植入手术、GRIN 镜头植入验证、底板附件、行为测试期间 GCaMP 信号的光学记录以及数据处理（图1A）。除手术外，还使用商业软件包（Inscopix）。
1. 立体反应手术-AAV病毒注射
注：此外科手术中使用的鼠标菌株为 C57BL6/J。动物的身体在手术过程中被无菌的窗帘覆盖，所有步骤都戴着无菌手套进行。多个手术通常不在同一天进行。但是，如果多个小鼠必须在同一天进行相同的手术，则为每只小鼠使用一套单独的自动切除手术工具和 70% 乙醇来消毒小鼠之间的手术器械。为了在手术过程中保持鼠标温暖，小鼠在固定到立体轴框架后，用定制的手术毯覆盖。
- 用 70% 乙醇消毒所有需要的手术工具，并准备汉密尔顿注射器和玻璃移液器。用蒸馏水填充玻璃移液器。
注：协议中使用的所有手术工具均自动切除。由于 GRIN 透镜和头骨螺钉不能自动封存进行灭菌，70% 的乙醇用作预防炎症的消毒剂。虽然没有尝试过，但可用于其他形式的绝育，例如气体或化学灭菌。 - 通过腹内注射，用五巴比妥麻醉小鼠（83毫克∙公斤-1 体重）。老鼠失去知觉后，剃掉头骨上的毛皮。
- 用 70% 乙醇清洁头骨上方的皮肤，并将鼠标固定在立体轴图框架上。使用棉尖施用器小心地去除皮肤，用 35% 的过氧化氢溶液擦拭头骨表面。涂抹润滑剂眼药膏，防止手术期间角膜干燥。
注：虽然通常使用70%乙醇只用于无菌皮肤制剂没有问题，但建议使用3轮交替消毒剂，如碘酚或叶绿素溶液，以及70%乙醇。 此协议中使用了高浓度的过氧化氢，以确保尽可能完全去除小鼠头骨上的结缔组织，这对于在以后的成像过程中减少运动产物至关重要，因为头骨上的结缔组织会干扰基板与头骨的牢固连接。应当指出，35%的过氧化氢比通常使用的要高得多（3%）。 - 用立体声电子探针支架固定引脚。将布雷格玛和兰姆达的高度与引脚对齐。
- 找到小鼠头骨上的具体位置进行颅骨切除术。
注：用于病毒注射的横向杏仁核（LA）的坐标是（AP、ML、DV）=（-1.6毫米、-3.5毫米、-4.3毫米）来自此协议中的布雷格玛（AP：前后，ML;中后期，DV;多萨尔-文特拉，每个缩写表示相对轴向距离从布雷格玛）26。应针对每个实验条件优化坐标。 - 钻头骨表面（图1B）。用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗头骨分数。使用钳子或 27 G 针将剩余层移除。
- 在钻头骨时，尽量不要触摸最后一层杜拉，以免对脑组织表面造成损伤。受损的大脑表面导致镜头周围发炎，在录制过程中诱发严重运动伪影和高自荧光。颅骨切除术的大小为1.6毫米。钻头速度为 18，000 rpm，位大小为 0.6 mm。
- 要将 GRIN 镜头从钻孔部位的脑组织表面降低到目标杏仁核部位，则通过从透镜植入的 DV 坐标中减去布雷格玛与裸露脑表面之间的 DV 差，计算命名为"价值 A"的距离，该坐标基于 bregma（本例为 4.2 mm，图 1C）。
- 在玻璃移液器中装载 3 μL 矿物油和 0.7 μL 的 AAV 病毒溶液。
注：矿物油有助于将病毒溶液和水分开。0.7 μL 是洛杉矶病毒注射的优化体积，可以完全覆盖 LA。 - 从立体式电子探针支架上取下引脚，并将玻璃移液器固定在该支架上。
- 在步骤 1.5 中提及的注射部位定位玻璃移液器。出血完全停止后，将玻璃移液器插入脑组织。
- 使用注射泵通过玻璃移液器传递病毒。
注：病毒的滴定应高于1 x 1013 vg/mL，以获得足够数量的GCaMP表达细胞。喷射速度为 0.1 μL/min，扩散 10 分钟。如果有出血，用PBS洗脑表面。在此步骤中保持大脑表面湿润。 - 注射完成后，慢慢取出玻璃移液器。
2. 立体声治疗手术-GRIN镜头植入
注：GRIN镜头植入手术是此协议中最关键的一步。由于 GRIN 镜头运动的一致缓慢速度对于成功的 GRIN 镜头植入至关重要，电动手术臂可能很有用。电动手术臂是由计算机软件控制的立体定向战术操纵器。虽然此协议中使用了电动臂，但只要镜头在植入过程中持续缓慢地移动，也可以使用其他方法。有关该设备的详细信息在 材料表中。
- 钻头骨植入两个头骨螺丝。用PBS清洗所有头骨分数。
注意：为了减少以后光学成像中的运动伪影成像，至少需要两个螺丝钉。两个头骨螺丝和 GRIN 镜头植入位置形成一个等边三角形（图 1B）。颅骨切除术的大小应与螺丝的直径紧密配合。如果有出血，用PBS清洗出血表面。钻头速度为 18，000 rpm，位大小为 0.6 mm。 - 用 70% 乙醇消毒螺丝以防止炎症。将螺丝植入尽可能深的螺丝。
注意：螺丝应紧固，不要附加粘附物（如水泥）。 - 在立体轴上安装电动手术臂。将所需的硬件连接到安装控制软件的笔记本电脑（材料表）。
- 在降低 GRIN 镜头之前，准备用 26 G 针进行针头跟踪。
注：针头轨道是一种引导轨道，有助于将相对较厚的 GRIN 透镜植入杏仁核等深层大脑区域，而不会导致注射路径沿线大脑结构严重失真。此导轨称为针轨，因为它是由相对薄的 26 G 针的降低和提升过程制成的。 - 将管架固定在立体轴框架上，以稳定地握住针头。
- 用管子支架握住26G针，计算针头插入部位的坐标。
注：在此协议中，针头插入部位的坐标为病毒注射部位（AP、ML、DV） 的 50μm 横向 = （-1.6 毫米、-3.55 mm、-3.7 mm）。 - 访问控制软件并完成操纵针头位置的准备。
- 运行控制软件并选择 "开始"新项目 按钮以开始控制会话。
注意：在控制会话中，有几个空白框和菜单按钮。空白框是坐标的输入空间。在空白框中输入坐标后，电动立体声轴臂通过单击 "转到 "按钮移动。当立体声轴臂移动时，" 转到 "按钮会更改为 "停止 "按钮。在几个菜单按钮中，本协议中仅需要 工具 按钮。 - 单击 工具 按钮。通过单击校 准帧菜单按钮来校准 控制软件。校准是将操纵器的实际位置设置为 立体声驱动器 软件上的值的过程。
- 运行控制软件并选择 "开始"新项目 按钮以开始控制会话。
- 使用立体战术操纵器在颅面裸露的大脑表面找到针尖。
注：针的速度设置使用工具菜单中的微驱动器速度菜单。默认速度为 3.0 mm/s。但是，在此步骤中建议使用 0.5 mm/s 速度。针的移动由箭头键控制。 - 添加 2-3 滴 PBS 以保持大脑表面湿润。使用洛杉矶的相应 DV 坐标填写计算机屏幕上的空白框。如果大脑表面干燥，它阻碍针头渗透到脑组织。
- 通过单击" 转到"按钮来 降低 26 G 针。当针头到达 DV 坐标设置的目标位置时，它会自动停止。针头的速度是100μm/min。如果有出血，请点击 "停止" 按钮停止针头，然后用PBS清洗大脑表面。在此步骤中保持大脑表面湿润。出血停止后，重新开始降低。
- 针完全停止移动后，在计算机屏幕上的空白框中输入 45.00 mm。
注：45.00 mm 是 DV 坐标的值，使针头返回到起始位置。 - 通过单击" 转到"按钮来 提升针头。针头运动的速度是100-200μm/min。
- 针停止移动后，取出大脑表面的PBS。从立体轴框架卸载针头和针管支架。实验者可以在必要时单击 "停止" 按钮手动停止针头。
- 用镜头支架装备立体声轴。将 GRIN 镜头安装到镜头架上。
注：本协议中使用了针对 LA 优化的 GRIN 镜头（直径 0.6 毫米，长度为 7.3 毫米）。如果镜头架未准备好，另一种方法是使用斗牛犬夹来抓握 GRIN 镜头。 - 用 70% 乙醇对镜头进行消毒，并将立体轴杆连接到立体轴框架上。
- 在头骨表面的指定位置定位 GRIN 透镜的尖端（第 2.8 步中描述的方法相同）。
注：GRIN镜头的坐标是（美联社，ML，DV）=（-1.6毫米，-3.55毫米，-4.2毫米）（图1C）。镜头不应触摸头骨，以免其尖端受损。 - 通过从步骤 2.16 中描述的镜头植入的 DV 坐标中减去"值 A"的绝对值来计算 DV 坐标。
- 在大脑表面掉落2-3滴PBS。输入 1000 μm 用于降低，300 μm 用于在计算机屏幕上的空白框中提升镜头。
- 重复降低（向下 1000μm）和向上提升 300μm 的 GRIN 镜头，直到它到达目标位置。这种上下程序用于帮助释放脑组织内产生的压力，由于镜头的降低过程，否则可能导致沿植入路径的大脑结构失真。
注：GRIN镜头运动的速度为100μm/min。即使有出血，也不要停止移动 GRIN 镜头，用 PBS 清洗大脑表面。在此步骤中保持大脑表面湿润。如果脑表面干燥，脑组织会粘在 GRIN 透镜表面，导致大脑结构失真。 - 如果 GRIN 镜头到达目标位置，请取出 PBS 并小心地将树脂牙科水泥涂抹在 GRIN 镜头、螺钉及其侧壁（图 1D）周围。
注意：在头骨上涂上树脂水泥可能会减少运动文物。相反，如果树脂水泥不小心覆盖了连接到头骨的肌肉，它增加了运动文物。 - 树脂牙水泥硬化后，从镜头架上拆下 GRIN 镜头，在头骨上涂抹丙烯酸水泥（图1D）。
- 要连接头板，只需将镜头支架从立体声电杆上拆开，并使用胶带将头板固定在杆尖上。确认头板是否为水平板。
注意：倾斜的头板会导致视图倾斜。将鼠标头固定在移动家庭笼子系统（在底板附件部分）中需要头板。如果实验者不使用系统，请跳过此步骤（步骤 2.22）和以下步骤 2.23。 - 慢慢地降低杆，直到头板位于镜头袖口的顶部。将头板降低 1000μm 以上。移动植入的 GRIN 透镜的头板，以定位在头板内部环的右边缘。
注：头板应定位低于植入的 GRIN 镜头表面：否则，由于丙烯酸水泥，显微镜无法接近植入的 GRIN 透镜，无法调节焦平面。 - 应用丙烯酸水泥将头板连接到水泥层（图 1D）。
- 在植入的 GRIN 镜头表面上安装石蜡膜，以保护镜头表面免受灰尘的影响。然后在石蜡薄膜上涂抹可移动环氧结，使石蜡薄膜保持在镜头表面。
- 注射卡普罗芬，镇痛剂（PBS中0.5毫克/mL）和德萨美松，一种抗炎药物（PBS中的0.02毫克/mL）溶液，在小鼠的腹腔中。
注：药物的剂量取决于体重：卡普罗芬（5毫克∙公斤-1 的体重）和德萨美松（0.2毫克∙公斤-1 的体重）。卡普罗芬和德萨梅松在手术后都施用，手术后每天服用一次，为期7天。 - 混合0.3毫克/mL阿莫西林，一种抗生素，在家里的笼水中施用1周的药物。
- 将鼠标送回家庭笼子，并允许5-8周的恢复和病毒转导。
注：鼠标在电热毯上的预热笼中恢复，直到老鼠从麻醉剂中醒来。
3. 格林镜头植入验证
注：GRIN 镜头植入的验证提供了有关植入的 GRIN 透镜是否对准 GCaMP 表达细胞的信息。基于这些信息，实验者通过排除植入目标外的 GRIN 镜头的动物，从而节省了他们的时间，从而从行为测试和数据处理等耗时流程中节省时间。在验证过程中，具有 GCaMP 表达的细胞应聚焦在录制视域中。在此步骤中使用移动家庭笼。移动家庭笼是一种专门的圆形设备，允许头部固定的小鼠在验证 GRIN 镜头植入和底板附件时自由移动腿部。将头部固定小鼠的腿放在这个装置中的空运台，使腿部能够自由移动，尽管头部是固定的。杏仁核侧核中的细胞通常处于静止或麻醉状态，因此在这些条件下很少检测到GCaMP荧光信号，这使得在G GRIN透镜植入和底板附件验证过程中很难找到表达GCaMP的细胞，有时甚至是不可能的。然而，腿部的运动往往在杏仁核侧核的细胞中产生GCaMP荧光信号，从而有助于定位显微镜。因此，移动家庭笼用于此协议。
- 将立体税操纵器组装到移动家庭笼子系统中。
- 用1.5%的异氟气麻醉小鼠。鼠标完全失去知觉后，将鼠标放在移动家庭笼系统的头条上。
- 将碳笼定位在鼠标下。关闭碳笼，打开气流，使笼子自由移动，没有摩擦。等待几分钟，直到鼠标变得活跃。
注：应针对每个实验条件优化气流速度（这里，100 L/min）。 - 去除植入的 GRIN 透镜表面的石蜡薄膜和环氧树脂，使用镜头纸用 70% 乙醇擦拭镜头表面。
- 准备数据采集 （DAQ） 软件（例如 Inscopix）。设置成像条件。
注：DAQ软件用于控制显微镜（LED电源、镜头对焦等）和数据存储。- 打开 DAQ 框并插入显微镜。然后，直接使用电缆或无线互联网将其连接到笔记本电脑。
注：DAQ 软件安装在称为 DAQ 框的额外硬件中（例如 Inscopix）。通过将 DAQ 框连接到笔记本电脑，DAQ 软件可在笔记本电脑中访问。 - 通过互联网浏览器访问 DAQ 软件（建议使用火狐）。
- 在定义会话中设置所有必要的详细信息（日期、鼠标 ID等）。然后单击"保存并继续"。保存后，访问运行会话。
- 在 运行会话中，设置曝光时间、增益、电子对焦和曝光 LED 功率等成像条件。
注意：增益和曝光 LED 功率可根据实验室条件而变化。电气对焦的推荐值为 500，曝光时间为 50 毫秒。更改 LED 功率和增益没有限制。然而，更高的光强度会导致更多的漂白。录制的曝光时间决定视频录制的帧速率。更高的帧速率将降低信号强度。应针对用于成像的 GECI 优化帧速率。
- 打开 DAQ 框并插入显微镜。然后，直接使用电缆或无线互联网将其连接到笔记本电脑。
- 要将显微镜固定在立体轴操纵器上，将带显微镜抓手的立体轴杆连接到立体轴操纵器上。
注：抓手是一个小配件，可以连接到立体轴设备，以举行显微镜身体放置到目标大脑的位置。 - 用显微镜握住显微镜。打开连接到显微镜的 LED 灯，垂直对齐显微镜。降低显微镜，同时观察图像，直到植入的 GRIN 镜头表面出现。
- 将植入的 GRIN 镜头的中心与视图中心对齐。
注：可以在此步骤中对 GRIN 镜头植入进行验证（在结果部分中提及，图2B、图 2D、图 2F）。 - 捕获植入的 GRIN 镜头表面的图像（单击键盘上的 Prt Sc 按钮）。在以后的数据处理过程中，需要植入的 GRIN 镜头表面的图像来取消选择非神经元组件（步骤 6.8）。
- 找到显微镜的适当位置。在观察图像以搜索具有GCaMP7b表达的细胞时，慢慢提升显微镜的客观透镜。
注意：可能需要调整图像采集或曝光 LED 功率的收益。GRIN 镜头植入验证可在此步骤中进行（在结果部分中提及，图 2A、图 2C、图 2E）。
4. 底板附件
注：底板附件步骤遵循 GRIN 镜头植入验证。底板是将显微镜安装到小鼠头部的平台。如上一节所述，本协议中使用了移动家庭笼。
- 验证 GRIN 镜头植入后，从显微镜抓手中拆卸微型显微镜。
- 将底板连接到显微镜上。使用六键拧紧螺丝，使底板稳定地附着在显微镜上。
- 用显微镜握住显微镜。打开连接到显微镜的 LED 灯，垂直对齐显微镜。降低显微镜，直到观察到植入的 GRIN 透镜表面。将植入的 GRIN 镜头的中心与视图中心对齐。
- 找到显微镜的适当位置。慢慢提升显微镜的客观透镜，直到找到一个焦平面，提供与GCaMP7b表达细胞的最佳图像（图2A）。
注：在此步骤中，可能需要调整图像采集或曝光 LED 功率的收益。 - 应用丙烯酸水泥将底板稳定地固定在头板（图2G）上。在底板和头板之间用丙烯酸水泥建立侧壁。
注意：丙烯酸水泥变硬后会收缩。因此，在水泥完全变硬之前，不要取出显微镜（此步骤至少需要 30 分钟）。应非常小心地进行水泥处理，以避免显微镜及其目标透镜与丙烯酸水泥进行不必要的凝固。 - 丙烯酸水泥完全硬化后，松开螺丝，缓慢提升显微镜体。
- 如果侧壁有间隙，请重做额外的固固，以保护植入的 GRIN 透镜免受灰尘的伤害。
- 盖上底板，保护植入的 GRIN 透镜免受灰尘的灰尘，并拧紧底板的螺丝。
- 从头条上释放头板。将鼠标返回家庭笼子，直到将来进行光学成像。
5. 行为测试期间GCaMP信号的光学记录
注：根据用于光学成像、实验设计和实验室环境的系统，GCaMP信号记录过程可能非常不同。因此，在此部分中以简单的方式描述它。
- 在行为测试前进行几天的处理。
- 准备行为设备（例如，恐惧调节室、行为软件和库尔伯恩仪器）和笔记本电脑。
- 将显微镜插入 DAQ 框，然后打开 DAQ 框。
- 通过无线互联网连接将 DAQ 框连接到笔记本电脑。
- 在笔记本电脑上启动 DAQ 软件（建议使用火狐浏览器）。单击 "文件管理器" 按钮并检查 DAQ 框的剩余存储容量以保存记录的数据。
注：30 分钟录制的数据大小约为 80 GB。 - 在定义会话中输入必要的信息（日期、鼠标 ID等），然后输入运行会话。
- 轻轻抓住鼠标，取下头上的底板盖。将显微镜放置在底板平台上。
- 拧紧底板螺丝，用头安装显微镜将动物放入行为室。
注意：如果处理不够，鼠标会尝试在此步骤中逃脱。 - 使用 BNC 电缆将 NI 板连接到 DAQ 框的 TRIG 端口。NI 板接收来自行为软件（例如冻结帧）的 TTL 信号，并协调 GCaMP 信号和动物行为的同步记录过程。
- 调整焦距平面。
注：焦点平面由显微镜的客观透镜与植入大脑的 GRIN 透镜之间的距离决定。为了调整焦距平面，在观察图像时对目标镜头位置进行操纵。显示细胞和血管清晰形态的这两个透镜之间的距离被设定为成像的焦点平面。在此协议中，DAQ 软件用于控制调整期间目标透镜的运动。 - 在 运行会话中设置优化的曝光时间、增益、LED 电源。
注：一般来说，50毫秒用于曝光时间。增益和 LED 功率基于图像直方图设置。直方图表示像素荧光强度的分布。根据目视检查，直方图的右边缘在 GCaMP7b 的情况下应具有 40% 到 60% 的值。它的变化取决于用于成像的全球环境和变革。 - 将录制选项更改为 触发录制。单击 "记录 "并启动行为。
注：触发的录制选项提供了录制会话和行为会话的匹配时间线。如果收到 TTL 信号，TRIG 端口上方的红灯将打开。 - 完成行为测试后，分离显微镜并连接底板盖。
- 把老鼠送回家里的笼子里。然后，从 DAQ 框中选择 文件管理器 和导出数据。
- 行为测试后，牺牲鼠标进行验尸分理验证。
6. 数据处理
注：数据处理过程因数据处理软件和用于成像实验的 GECI 而异。因此，在此部分中以简单的方式描述它。此协议使用商业数据处理软件（见 材料表）。或者，讨论部分中提到的其他开源软件也可以毫无问题地使用。此协议中使用的变量列在表 1中。
- 将录制的视频数据文件（1280 像素 x 800 像素）从 DAQ 框导入台式计算机以进行数据处理。启动数据处理软件。
注：数据处理软件不同于DAQ软件在以前的步骤。在数据处理软件中，有 6 个步骤：下采样、裁剪、空间滤清器、运动校正、ΔF/F 计算、事件检测，这些步骤是从录制的视频中提取单细胞钙瞬态数据所必需的。 - 向下和裁剪视频。
注意：为了提高数据处理速度，需要向下采样和裁剪。作物区域，但观察到 GCaMP 信号的感兴趣区域除外。 - 应用空间过滤器。应用空间滤镜后，创建平均强度投影图像。
注：空间滤镜区分录制的视频图像中的每个像素，并提供高对比度图像。有两种类型的截断过滤器，低和高切断过滤器。低截止滤镜的较高值增加了图像的对比度，但总体灰噪声也会增加。高截断滤镜的低值使图像变得模糊不清。 - 应用运动校正。使用平均强度投影图像作为运动校正的参考图像。
- 使用第一帧的图像作为参考图像再次应用运动校正。
注：运动校正的两个步骤显著减少运动伪影。 - 应用ΔF/F 计算来可视化显示亮度变化的像素。
注：像素的亮度变化是由GCaMP的荧光强度变化引起的，它表示钙瞬态。 - 应用 PCA/ICA 算法可视化每个细胞的钙瞬态曲线。
注：PCA/ICA 是将一组数据分入一组单个组件数据的算法。应针对每个实验室条件优化变量。在此协议中，除 ICA 时间权重（本协议中使用 0.4）27外，所有变量均为默认值。 - 根据以下说明中描述的标准，在已识别的组件中手动选择非神经元组件。
注：为此目的使用了两个主要标准。首先，GCaMP信号源自神经元，看起来像一个清晰的球形。因此，只有具有清晰球形的信号被选为神经元。其次，鉴于杏仁核金字塔细胞的细胞体直径已知约为20μm28，29，30，只有与这个大小大致匹配的信号被选为神经元。为了确定 GCaMP 信号的大小，根据镜头表面捕获的图像（步骤 3.9）计算单个像素的实际大小，并计算单个球形的最大宽度。例如，在此协议中，植入的 GRIN 透镜的直径为 600μm。因此，如果镜头的直径为 800 像素，则单个像素的实际大小为 1.5 μm（20 μm 约为 7 像素）。 - 应用事件检测功能来检测钙瞬态（钙事件）的显著增加。
注：在此步骤中，需要称为事件最小衰减时间（τ）的变量。在此协议中，1.18s 被用作 GCaMP7b 的优化变量。平均半衰变时间（t1+2=0.82s）是根据细胞自发活动期间的ΔF/F曲线计算的。由于GCaMP遵循指数衰减
，τ=。
，τ=。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
格林 镜头植入验证
在通过粘固将底板长期连接到大脑之前，GRIN 镜头植入需要经过验证。在成功植入镜片的动物中，GCaMP表达细胞和血管都清晰地观察到由显微镜客观透镜与植入的G GRIN透镜（图2A和B）之间的距离决定的焦点平面范围内。相比之下，在进行脱靶植入的动物中，在焦点平面范围内（无论是失焦的还是失视的）没有观察到GCaMP表达细胞的清晰图像。在注意力不集中的情况下，可以观察到聚焦良好的血管，但只能观察焦点平面范围内细胞的模糊图像（图2C和D）。在视线外的情况下，大多数情况下没有观察到血管，在焦点平面范围内没有检测到荧光信号（图2E）。此外，与其他情况不同，植入的 GRIN 镜头显示出明亮的边缘（图 2F）。底板附件仅在目标 GRIN 镜头植入的验证动物身上进行。
洛杉矶神经元中 GCaMP 信号的记录，以响应听觉刺激
在此协议中，向小鼠展示了4个伪多语调实例（2.8 kHz，200毫秒持续时间，25个脉冲），并且用头安装显微镜在小鼠的LA细胞中光学记录了GCaMP信号。在单侧侧杏仁核中注射AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE的小鼠用于成像。在成功植入 GRIN 透镜的动物中，在焦点平面范围内清楚地观察到病毒表达细胞和血管（图 3A）。在行为条件下，大约 50-150 个细胞通常在洛杉矶的视野中显示显著的荧光变化，即使没有ΔF/F 图像中显示的音调，可能是自发活跃的细胞（图 3B）。在音调演示时，只有少数单元显示由ΔF/F 图像分析（ 图 3C 中的 6 个单元和图 3D中的 6 个单元）确定的 GCaMP 信号的色调特定变化。在注射AAV2/1-卡姆基奇-GFP作为对照的小鼠身上也进行了同样的手术。虽然在焦点平面范围内检测到GFP表达细胞，但根据ΔF/F图像分析（图3E 和 图3F），没有细胞显示有或没有音调的重大荧光变化。
为了对GCaMP表达和G GRIN透镜的靶向进行组织验证，在荧光显微镜下检查死后大脑的冠状部分（图4A和图4B）。DAPI染色用于确认完整的细胞和没有组织损伤的迹象，由于格林镜头周围的脑组织炎症（图4C）。
图1：洛杉矶体内显微内窥镜钙成像立体法手术的示意图工作流程和图表（A）洛杉矶体内显微内窥镜钙成像的示意图工作流程。（B）显示病毒注射和 GRIN 镜头植入手术颅骨切除部位的二维坐标的微观图片。两个头骨螺丝和镜头形成一个等边三角形。（C）病毒注射部位与植入的 GRIN 透镜之间的相对位置图，以及计算"值 A"的示意图解释。（D）手术最后阶段从头骨表面到头板的水泥层的横截面。树脂牙水泥应覆盖螺丝壁和植入的 GRIN 透镜。丙烯酸水泥应用于树脂牙科水泥上。头板附着在水泥层上。石蜡薄膜覆盖植入的 GRIN 透镜表面，并保护其免受灰尘的覆盖。可拆卸环氧树脂可防止石蜡薄膜分离。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：底板附着后磨镜头植入和水泥层配置的验证。（A） 成功植入 GRIN 镜头的动物的代表性内窥镜快照图像。清楚地观察到GCaMP表达细胞和血管。 （B） 植入的 GRIN 镜头表面的快照图像，来自成功植入 GRIN 镜头的动物。 （C） 具有代表性的内窥镜快照图像，来自无焦 GRIN 镜头植入的动物。 （D） 植入的 GRIN 镜头表面的快照图像，来自无焦 GRIN 镜头植入的动物。在注意力不集中的情况下，血管有时被清楚地观察到，但只对焦点平面范围内的细胞模糊图像。 （E） 具有代表性的内窥镜快照图像，来自植入视线的动物 GRIN 镜头。在视线外的情况下，大多数情况下不观察到血管，在焦点平面范围内也未检测到荧光信号。 （F） 植入的 GRIN 镜头表面的快照图像，来自植入视图的动物 GRIN 镜头。与其他情况不同，在这种情况下可以观察到明亮的边缘。 （G） 基板附件的水泥层配置。底板和车头板由丙烯酸水泥连接。底板和 GRIN 镜头之间应有一个未填充丙烯酸水泥的空间。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：洛杉矶神经元中GCaMP信号的记录。（A 到 C） 从注射 AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE 的鼠标获得的数据。 （A） 行为测试期间具有代表性的内窥镜快照图像。GCaMP7b表达细胞和血管在焦点平面范围内被清楚地观察到。 （B） 显示Δ F/F 信号 的代表性快照图像。白线表示在行为测试期间在感兴趣区域显示显著荧光变化的细胞。比例尺条 = 50μm. （C） 最大强度投影图像。总共 6 个单元格显示 GCaMP 信号的色调特定变化。比例尺条 = 50μm. （D） 代表 Δ音响应细胞的 F/F 痕迹。每种颜色对应于面板 （C） 中颜色相同的每个单元格。 （E 和 F） 从注射 AAV2/1-卡姆基奇-GFP 的鼠标获得的数据。（E） 行为测试期间具有代表性的内窥镜快照图像。在焦点平面范围内清楚地检测到GFP表达细胞。 （F） 显示Δ F/F 信号 的代表性快照图像。缩放栏 = 50μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
图4：对G GRIN镜头位置和GCaMP7b表达的实证验证。（A） 在洛杉矶显示 GCaMP7b 表情的代表性日冕部分图像。比例尺条 = 200μm. （B） 放大图像。比例尺条 = 50μm. （C） 荧光微观图像，显示 DAPI 染色信号。缩放栏 = 200μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
| 因素 | 价值 |
| 空间向下采样因子 | 2 |
| 时间下降采样因子 | 2 |
| 空间过滤器：高截止 | 0.5 |
| 空间过滤器：低截止 | 0.005 |
| 运动校正：高截止 | 0.016 |
| 运动校正：低截止 | 0.004 |
| 运动校正：最大翻译 | 20 |
| ΔF/F 参考框架 | 平均帧 |
| PCA/ICA：块大小 | 1000 |
| PCA/ICA：收敛 | 1x10^-5 |
| PCA/ICA：伊卡时体重 | 0.4 |
| PCA/ICA：数字 | 120 |
| PCA/ICA：数字公司 | 150 |
| PCA/ICA：未混合类型 | 时间 |
| 事件检测：衰减恒定 | 1.18 |
| 事件检测：阈值 | 4 |
表1：数据处理变量列表
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Discussion
熟练的手术技术对于在更深的大脑区域（如杏仁核）中成功实现体内光学钙成像至关重要，正如我们在这里描述的那样。因此，尽管此协议为基板附件和 GRIN 镜头植入的优化手术过程提供了指导，但关键步骤可能需要额外的优化过程。如协议部分所述，手术中的杏仁核坐标、基板附件步骤中的气流速度、钙记录中的图像采集设置（帧速率、LED功率等）和数据处理中的变量（ICA时间重量、事件最小衰变时间等）需要优化。
可以修改底板附件步骤。头板是必要的，因为它有助于修复清醒的小鼠的头在基板附件在移动家庭笼进行。但是，如果实验室没有准备移动家庭笼，异氟气麻醉系统是一种替代选择。对于这种替代方法，异氟气的浓度可能至关重要。我们观察到，在1.5%以下的异氟化小鼠的杏仁核中很少检测到GCaMP信号。相反，GCaMP信号在0.8%的异位素条件下被检测到，小鼠处于几乎清醒的状态，但在这种情况下没有实质性的头部运动。因此，这种麻醉条件允许进行底板附件，而无需使用额外的设备，如头板和移动家庭笼。
头骨螺钉、水泥、底板和显微镜的不稳定附件可导致运动伪影，可使用运动校正软件算法进行校正。横向心室的运动被认为会导致一种不规则类型的运动伪影，使用当前可用的运动校正软件无法轻松更正。这种不规则的运动神器在大多数肤浅的大脑区域，如海马和皮层中是最小的。然而，在杏仁核的光学成像过程中经常检测到它。为了克服这个问题，本协议建议将 GRIN 镜头从病毒注射部位植入 50μm 的横向侧面（图 1C），通过减少来自侧心室的潜在运动伪影物，从而极大地改善图像采集过程。虽然我们设置了50μm相对于病毒注射部位，镜头植入的目标坐标也可以设置相对于横向心室。在此协议中，我们推断，更关键的是精确定位病毒表达站点，以成功实现成像性能。因此，我们使用病毒注射坐标作为参考，以设置镜头植入的目标坐标。通过反复试验，我们建立了一个最佳条件，允许 GRIN 镜头有效地瞄准病毒表达站点，同时避免横向心室运动引起的运动文物。最终，能够有效和准确地纠正任何运动伪影物的方法将有很大的帮助，获得光学成像到更深的大脑区域在未来。
虽然带头安装微型显微镜的体内光学钙成像是一种强大的工具，并已得到优化，但在许多方面仍有改进的余地。该协议将促进旨在调查自由行为动物杏仁核中实时神经活动的研究。
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Disclosures
提交人没有什么可透露的
Acknowledgments
这项工作得到了三星科技基金会（项目编号SSTF-BA1801-10）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
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