在自由行为鼠标的杏仁核中，使用头山小型显微镜成功进行体内钙成像

使用小型化显微镜对杏仁核进行体内钙成像时，可能会出现许多挑战。该协议为成功实现体内钙成像提供了节省时间的指南。体内钙成像允许在长达数周的时间内对遗传定义的细胞群进行连续同步成像，这在以前是不可能的。

对于 AAV 注射，将麻醉小鼠固定在立体定位框架中，将前囟和 lambda 的高度与针对齐，并确定暴露和消毒的颅骨上用于开颅手术的特定位置。使用配备 0.6 毫米钻头的钻头以每分钟 18， 000 转的钻孔速度小心地进行 1.6 毫米开颅手术，并用无菌 PBS 清洗颅骨。从 4.2 毫米减去前囟和暴露的大脑表面之间的背腹差，基于前囟的晶状体植入的背腹坐标，计算出值 A 距离，并将每毫升 AAV 溶液中 3 微升矿物油和 0.7 微升大于 10 倍的 13 至 13 病毒基因组加载到玻璃移液器中。

从立体定位探针支架上取下针脚，以便将移液器固定在框架上，并将移液器放在准备好的注射部位上。当出血完全停止后，将玻璃移液器吸头从背腹前囟坐标插入脑组织 4.3 毫米，并使用注射泵输送整个体积的病毒，然后慢慢取出移液器。注射完所有病毒后，如图所示在颅骨上再钻两次，以允许植入两个颅骨螺钉并用 PBS 清洗颅骨部分。

接下来，将 70% 乙醇灭菌的螺钉尽可能深地植入，并在立体定位框架上安装电动手术臂。将所需的硬件连接到安装了控制软件的笔记本电脑，并使用套管支架将 26 号针头稳定地固定到立体定向框架上。计算出针头插入部位的坐标后，使用立体定位机械手将针尖定位在大脑的暴露表面，并用两到三滴 PBS 水化脑组织。

在软件中输入适当的背腹和外侧杏仁核坐标，然后单击 GoTo 降低针头。当针完全停止时，在起始位置框中输入 45 毫米，然后单击 GoTo 以升高针。当针头停止移动时，从大脑表面取出 PBS，并从立体定位框架上卸下针头和套管支架。

将镜头支架安装到立体定位杆上，并将 GRIN 镜头固定到镜头支架上。用 70% 乙醇对晶状体进行消毒，并将立体定位杆连接到立体定位框架上。将 GRIN 晶状体的尖端放在脑表面的指定位置，并从脑表面的背腹坐标中减去 A 的绝对值，以确定晶状体植入的背腹坐标。

再滴两到三滴 PBS 水合脑组织，并使用电动臂将下降深度设置为 1， 000 微米，将升高高度设置为 300 微米。当 GRIN 镜片到达目标部位时，取出 PBS 并小心地在 GRIN 镜片、螺钉和螺钉侧壁周围涂抹树脂牙科水泥。当牙科粘结剂变硬时，从镜片上取下镜片支架，并将丙烯酸粘结剂涂抹在颅骨表面。

接下来，将镜头支架更换为水平方向贴在杆尖端的头板。慢慢降低杆，直到头板位于镜头袖口的顶部，然后将头板降低 1， 000 微米，直到镜头位于头板内环的右边缘。使用丙烯酸水泥将头板连接到水泥层上，并使用石蜡膜保护植入的 GRIN 镜片表面免受灰尘的影响，然后在石蜡薄膜上涂上可去除的环氧树脂粘合剂，将薄膜固定到镜片表面，并将动物放回笼子并进行监测，直到完全卧躺。

为了评估 GRIN 镜片植入的质量，将碳笼放在移动房屋笼系统头杆上的麻醉鼠标下方并打开气流，使笼子自由移动而没有摩擦。使用显微镜夹具和立体定位机械手将微型显微镜垂直对准框架，然后降低显微镜，直到植入的 GRIN 镜头的表面出现在软件的像场中。将植入的 GRIN 镜头的中心与视野中心对齐并捕获植入的 GRIN 镜头表面的图像，然后慢慢抬起显微镜的物镜，同时观察表达 GCaMP 细胞的外观图像。

在成功植入晶状体的动物中，可以在单个焦平面范围内清楚地观察到表达 GCaMP 的细胞和血管。相反，在脱靶植入的动物中，在焦平面范围内没有观察到表达 GCaMP 的细胞的清晰图像，尽管可以难以观察到血管。在视外晶状体的情况下，血管和表达 GCaMP 的细胞都无法看到，并且可以在植入的 GRIN 晶状体上观察到亮边。

在成功植入 GRIN 晶状体的动物中，即使没有音调，大约 50 到 150 个可能自发活跃的细胞通常在外侧杏仁核的视野内显示显着的荧光变化。在色调呈现时，只有少数细胞显示 GCaMP 信号的色调特异性变化，由 delta F 图像分析确定。当对注射表达 GFP 的 AAV 作为对照的小鼠进行相同的分析时，在焦平面范围内检测到表达 GFP 的细胞，并且没有细胞显示有或没有色调的显着荧光变化。

GCaMP 表达和 GRIN 晶状体靶向的组织学验证显示，GRIN 晶状体周围的脑组织炎症没有导致组织损伤的迹象。如果针或镜头的速度不一致，可能会导致运动伪影和图像质量不佳。使用电动手术臂会有所帮助。

如果在底板连接步骤中移动家庭护理系统没有准备好，则可以在底板连接过程中使用低浓度的异氟醚气体来麻醉鼠标。