स्वतंत्र रूप से व्यवहार माउस के Amygdala में एक सिर माउंट Miniaturized माइक्रोस्कोप के साथ वीवो कैल्शियम इमेजिंग में सफल
Summary
वीवो माइक्रोएंडोस्कोपिक कैल्शियम इमेजिंग में एक अमूल्य उपकरण है जो स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों में न्यूरोनल गतिविधियों की वास्तविक समय की निगरानी में सक्षम बनाता है। हालांकि इस तकनीक को एमिग्डाला में लगाना मुश्किल रहा है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों में एक लघुकृत माइक्रोस्कोप के साथ एमिग्डाला कोशिकाओं को सफलतापूर्वक लक्षित करने के लिए एक उपयोगी दिशानिर्देश प्रदान करना है।
Abstract
वीवो में स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में न्यूरोनल गतिविधियों की वास्तविक समय निगरानी व्यवहार के लिए न्यूरोनल गतिविधि को जोड़ने के लिए प्रमुख दृष्टिकोणों में से एक है। इस उद्देश्य के लिए, एक वीवो इमेजिंग तकनीक जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई), एक लघुकृत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, और एक ढाल अपवर्तक सूचकांक (जीआरआई) लेंस का उपयोग करके न्यूरॉन्स में कैल्शियम यात्रियों का पता लगाती है, विकसित किया गया है और कई मस्तिष्क संरचनाओं1,2,3,4,5,6पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है। यह इमेजिंग तकनीक विशेष रूप से शक्तिशाली है क्योंकि यह कई हफ्तों तक दीर्घकालिक अवधि के लिए आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल आबादी की पुरानी एक साथ इमेजिंग को सक्षम बनाता है। हालांकि उपयोगी, इस इमेजिंग तकनीक को आसानी से मस्तिष्क संरचनाओं पर लागू नहीं किया गया है जो मस्तिष्क के भीतर गहरे का पता लगाते हैं जैसे कि एमिग्डाला, भावनात्मक प्रसंस्करण और साहचर्य भय स्मृति7के लिए एक आवश्यक मस्तिष्क संरचना। ऐसे कई कारक हैं जो इमेजिंग तकनीक को एमिग्डाला पर लागू करना मुश्किल बनाते हैं। उदाहरण के लिए, गति कलाकृतियों आमतौर पर गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में आयोजित इमेजिंग के दौरान अधिक बार होते हैं क्योंकि मस्तिष्क में गहरे प्रत्यारोपित एक सिर-माउंट माइक्रोस्कोप अपेक्षाकृत अस्थिर होता है। एक और समस्या यह है कि पार्श्व वेंट्रिकल प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस के करीब तैनात है और श्वसन के दौरान इसके आंदोलन अत्यधिक अनियमित गति कलाकृतियों है कि आसानी से सही नहीं किया जा सकता है, जो यह मुश्किल एक स्थिर इमेजिंग दृश्य बनाने के लिए बनाता है पैदा हो सकता है । इसके अलावा, क्योंकि एमिग्डाला में कोशिकाएं आमतौर पर आराम या एनेस्थेटाइज्ड राज्य में शांत होती हैं, इसलिए बाद में इमेजिंग के लिए बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान एमिग्डाला में जीईसीआई व्यक्त करने वाले लक्ष्य कोशिकाओं को ढूंढना और ध्यान केंद्रित करना मुश्किल है। यह प्रोटोकॉल इस तरह के गहरे मस्तिष्क क्षेत्र में वीवो कैल्शियम इमेजिंग में सफल होने के लिए सिर-माउंट लघुकृत माइक्रोस्कोप के साथ एमिग्डाला में जीईसीआई व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक लक्षित करने के लिए एक उपयोगी दिशानिर्देश प्रदान करता है। यह ध्यान दिया जाता है कि यह प्रोटोकॉल एक विशेष प्रणाली (जैसे, इनस्कोपिक्स) पर आधारित है लेकिन यह करने के लिए प्रतिबंधित नहीं है।
Introduction
कैल्शियम एक सर्वव्यापी दूसरा दूत है, जो लगभग हर सेलुलर कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है8। न्यूरॉन्स में, एक्शन संभावित फायरिंग और सिनैप्टिक इनपुट के कारण इंट्रासेल्युलर फ्री [सीए2+]9, 10में तेजी से बदलावहोताहै । इसलिए, कैल्शियम यात्रियों को ट्रैक करना न्यूरोनल गतिविधि की निगरानी करने का अवसर प्रदान करता है। जीईसीआई शक्तिशाली उपकरण हैं जो परिभाषित कोशिका आबादी और अंतर-सेलुलर डिब्बों में निगरानी [सीए2 +]की अनुमति देते हैं11,12। प्रोटीन आधारित कैल्शियम संकेतक के कई विभिन्न प्रकार के बीच, GCaMP, एक सीए2 + एक जीएफपी अणु13के आधार पर जांच, सबसे अनुकूलित है और इस तरह व्यापक रूप से इस्तेमाल किया GECI । इंजीनियरिंग के कई दौरों के माध्यम से, जीसीएएमपी के कई वेरिएंट12,14, 15,16विकसित किए गए हैं। हम इस प्रोटोकॉल16में हाल ही में विकसित GCaMPs, GCaMP7b में से एक का उपयोग करें । जीसीएएमपी सेंसर ने कई मॉडल जीवों जैसे विकास17में सीए2 + यात्रियों की इमेजिंग, एक विशिष्ट कॉर्टिकल लेयर 18 में वीवो इमेजिंग में, मोटर टास्क लर्निंग19में सर्किट गतिशीलता की माप और हिप्पोकैम्पस और एमियागला 20मेंअसोसिएटिव डर मेमोरी से संबंधित सेल पहनावा गतिविधि की इमेजिंग जैसे कई मॉडल जीवों में तंत्रिका सर्किट कार्यों के अध्ययन में बहुत योगदान दिया है।
जीईसीआई की ऑप्टिकल इमेजिंग के कई फायदे हैं22. जेनेटिक एन्कोडिंग जीईसीआई को कोशिकाओं के एक विशिष्ट सबसेट में दीर्घकालिक अवधि के लिए स्थिर रूप से व्यक्त करने में सक्षम बनाता है जिसे आनुवंशिक प्रोफ़ाइल या शारीरिक कनेक्टिविटी के विशिष्ट पैटर्न द्वारा परिभाषित किया जाता है। ऑप्टिकल इमेजिंग जीवित जानवरों में सैकड़ों से हजारों न्यूरॉन्स की वीवो क्रोनिक एक साथ निगरानी में सक्षम बनाता है। वीवो इमेजिंग और जीईसीआई के मस्तिष्क के भीतर जीईसीआई के विश्लेषण में कुछ ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम विकसित किए गए हैं, जिनमें सिर-माउंट लघुकृत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप 21,23,24,25केसाथ चूहों का स्वतंत्र रूप से व्यवहार किया जाता है । GECIs, GRIN लेंस पर आधारित वीवो ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक में होने के बावजूद, और एक सिर माउंट लघु माइक्रोस्कोप तंत्रिका सर्किट गतिविधि और व्यवहार के बीच लिंक का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण जा रहा है, एमिग्डाला के लिए इस तकनीक को लागू करने के कई तकनीकी गति कलाकृतियों के कारण बिना amygdala में GECIs व्यक्त कोशिकाओं को जीईसी को लक्षित करने से संबंधित मुद्दों के कारण मुश्किल हो गया है कि छवि अधिग्रहण और खोजने सेल इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बेसप्लेट अटैचमेंट और ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण की शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए एक उपयोगी दिशानिर्देश प्रदान करना है जो एमिग्डाला में वीवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग में सफल के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। यद्यपि यह प्रोटोकॉल एमिग्डाला को लक्षित करता है, यहां वर्णित अधिकांश प्रक्रियाएं आमतौर पर अन्य गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों पर लागू होती हैं। यद्यपि यह प्रोटोकॉल किसी विशेष प्रणाली (जैसे, इनस्कोपिक्स) पर आधारित है, लेकिन अन्य वैकल्पिक प्रणालियों के साथ एक ही उद्देश्य आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमिग्डाला जैसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में सिर-माउंट लघु माइक्रोस्कोपी के साथ वीवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग में सफल प्राप्त करने के लिए कुशल सर्जरी तकनीक आवश्यक है जैसा कि हमने यहां वर्णित किया है। …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सैमसंग साइंस एंड टेक्नोलॉजी फाउंडेशन (प्रोजेक्ट नंबर एसएसटीएफ-BA1801-10) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
