Summary

自由に振る舞うマウスの扁桃体の頭部小型顕微鏡による生体内カルシウムイメージングに成功

Published: August 26, 2020
doi:

Summary

生体内の微小内視鏡的カルシウムイメージングは、動物の行動を自由に行う神経活動をリアルタイムで監視できる貴重なツールです。しかし、扁桃体にこの技術を適用することは困難であった。このプロトコルは、マウスの顕微鏡を小型化した扁桃体細胞を標的にするための有用なガイドラインを提供することを目的としています。

Abstract

自由に動く動物の神経活動のリアルタイムモニタリングは、神経活動を行動に結びつける重要なアプローチの1つです。このため、遺伝子組み換えカルシウム指標(GEC)、蛍光顕微鏡の微細化、および勾配屈折率(GRIN)レンズを用いてニューロンのカルシウム過渡症を検出するinvivoイメージング技術が開発され、多くの脳構造1、2、3、4、5、6応用することに成功しました。このイメージング技術は、遺伝的に定義された細胞集団の長期にわたる数週間の慢性同時イメージングを可能にするため、特に強力です。有用であるが、このイメージング技術は、扁桃体、感情処理および連想恐怖記憶7に不可欠な脳構造である扁桃体などの脳内の深部に位置する脳構造に容易に適用されていない。扁桃体にイメージング技術を適用することが困難になるいくつかの要因があります。例えば、運動アーチファクトは、通常、脳の深部に移植されたヘッドマウント顕微鏡が比較的不安定であるため、より深い脳領域で行われるイメージング中により頻繁に発生する。もう一つの問題は、横心室が埋め込まれたGRINレンズの近くに位置し、呼吸中のその動きが、容易に矯正できない非常に不規則な運動アーチファクトを引き起こし、安定したイメージングビューを形成することが困難になることです。さらに、扁桃体の細胞は通常安静状態または麻酔状態で静かであるため、後のイメージングのための基固め手順の間に扁桃体中のGECIを発現する標的細胞を見つけて焦点を合わせるのは難しい。このプロトコルは、扁桃体でGECIを発現する細胞を頭部小型化顕微鏡で効率的に標的化し、このようなより深い脳領域で生体内カルシウムイメージングを成功させる方法に関する有用なガイドラインを提供する。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、それに限定されないことに留意された。

Introduction

カルシウムはユビキタスな第二のメッセンジャーであり、ほぼすべての細胞機能8において重要な役割を果たしている。ニューロンにおいて、作用電位焼成およびシナプス入力は、細胞内遊離の急速な変化を引き起こす [Ca2+]9,10.したがって、カルシウム過渡性を追跡することは、神経活動を監視する機会を提供する。GEC は、定義された細胞集団および細胞内区画11,12で [Ca2+] を監視できる強力なツールです。タンパク質ベースのカルシウム指標の多くの異なるタイプの中で、GCaMPは、単一のGFP分子13に基づくCa2+プローブで、最も最適化され、広く使用されているGECIです。複数のエンジニアリングを通じて、GCaMPの多くのバリエーションが12、14、15、16で開発されました。我々は、このプロトコル16で最近開発されたGCaMPの1、GCaMP7bを使用しています。GCaMPセンサは、開発中のCa2+過渡現象のイメージング、特定皮質層18における生体内イメージング、運動タスク学習19における回路ダイナミクスの測定、海馬および扁桃体20、20の連想恐怖記憶に関連する細胞アンサンブル活動のイメージングなど多くのモデル生物における神経回路機能の研究に大きく貢献してきた。

GECI の光学イメージングには、いくつかの利点があります。遺伝的コード化により、GECは、遺伝的プロファイルまたは解剖学的接続性の特定のパターンによって定義される特定のサブセットの細胞において、長期間安定して発現することが可能になります。光学イメージングは、生きている動物のニューロンの数百から数千の生体内の慢性同時監視を可能にします。脳内でのGECのイメージングおよび解析のために、ヘッドマウント小型蛍光顕微鏡21、23、24、25を用いて、マウスを自由に振る舞う光学イメージングシステムがいくつか開発されている。GECを用いたin vivo光学イメージング技術、GRINレンズ、およびヘッドマウント小型顕微鏡は神経回路活動と行動との関連を研究する強力なツールであるにもかかわらず、この技術を扁桃体に適用することは、扁桃体でGECを発現する細胞に対するいくつかの技術的な問題により困難であった。このプロトコルは、扁桃体における生体内光学カルシウムイメージングを成功させるための重要なステップであるベースプレート付着およびGRINレンズ注入の外科的処置に役立つガイドラインを提供することを目的としている。このプロトコルは扁桃体を標的としますが、ここで説明するほとんどの手順は、一般的に他のより深い脳領域に適用されます。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、他の代替システムでも同じ目的が容易に達成され得る。

Protocol

すべての手続きは、韓国科学技術院の動物倫理委員会によって承認されました。すべての実験は、制度的動物の世話と使用委員会のガイドラインに従って行われました。 注:このプロトコルは、ウイルス注入手術、GRINレンズインプラント手術、GRINレンズ注入の検証、ベースプレートアタッチメント、行動テスト中のGCaMP信号の光学記録、およびデータ処理の6つの主要な?…

Representative Results

GRINレンズ注入の検証セメンテーションによってベースプレートを脳に慢性的に取り付ける前に、GRINレンズの注入を検証する必要があります。レンズの移植に成功した動物では、GCaMP発現細胞と血管の両方が、顕微鏡の対物レンズと埋め込まれたGRINレンズとの距離によって決定される焦点面範囲内で明確に観察された(図2AおよびB)。</s…

Discussion

ここで述べたような扁桃体のような深部脳領域における頭部取付小型顕微鏡による生体内光学的カルシウムイメージングの成功を達成するためには、巧みな手術技術が不可欠である。したがって、このプロトコルは、ベースプレートアタッチメントとGRINレンズの移植の最適化された外科プロセスのためのガイドラインを提供しますが、重要なステップのために追加の最適化プロセスが必要な…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、サムスン科学技術財団(プロジェクト番号SSTF-BA1801-10)からの助成金によって支えられました。

Materials

26G needle BD 302002 Surgery
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE Addgene 104493-AAV1 Surgery
AAV2/1-CaMKiiα-GFP custom made Surgery
Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) Lang 1334-pink Surgery & Baseplate Attachment
Air flow manipulator Neurotar NTR000253-04 Baseplate Attachment
Amoxicillin SIGMA A8523-5G Surgery
Baseplate INSCOPIX 1050-002192 Baseplate Attachment
Baseplate cover INSCOPIX 1050-002193 Baseplate Attachment
Behavioral apparatus (chamber) Coulbourn Instrument Testcage Behavior test
Behavioral apparatus (software) Coulbourn Instrument Freeze Frame Behavior test
Carbon cage Neurotar 180mm x 70mm Baseplate Attachment
Carprofen SIGMA PHR1452-1G Surgery
Data processing software INSCOPIX INSCOPIX Data Processing Software Baseplate Attachment & Behavior test
Dexamethasone SIGMA D1756-500MG Surgery
Drill Seyang marathon-4 Surgery
Drill bur ELA US1/2, Shank104 Surgery
Glass needle WPI PG10165-4 Surgery
GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) INSCOPIX 1050-002208 Surgery
Hamilton Syringe Hamilton 84875 Surgery
Head plate Neurotar Model 5 Surgery
Hex-key INSCOPIX 1050-004195 Baseplate Attachment
Laptop computer Samsung NT950XBV Surgery & Baseplate Attachment
Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) INSCOPIX 1050-004223 Surgery
Microscope gripper INSCOPIX 1050-002199 Baseplate Attachment
Microscope, DAQ software, hardware INSCOPIX nVista 3.0 Baseplate Attachment & Behavior test
Mobile homecage Neurotar MHC V5 Baseplate Attachment
Moterized arm Neurostar Customized Surgery
Moterized arm software Neurostar Customized Surgery
NI board National instrument Behavior test
Removable epoxy bond WPI Kwik-Cast Surgery
Resin cement (Super-bond) Sun medical Super bond C&B Surgery
Skull screw Stoelting 51457 Surgery
Stereotaxic electrode holder ASI EH-600 Surgery
Stereotaxic frame Stoelting 51600 Surgery
Stereotaxic manipulator Stoelting 51600 Baseplate Attachment

References

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Lee, H., Han, J. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (162), e61659, doi:10.3791/61659 (2020).

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