Summary

Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado

Published: August 26, 2020
doi:

Summary

A imagem microendoscópica de cálcio in vivo é uma ferramenta inestimável que permite o monitoramento em tempo real das atividades neuronais em animais de comportamento livre. No entanto, aplicar essa técnica à amígdala tem sido difícil. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para atingir com sucesso células de amígdala com um microscópio miniaturizado em camundongos.

Abstract

O monitoramento in vivo em tempo real das atividades neuronais em animais em movimento livre é uma das principais abordagens para ligar a atividade neuronal ao comportamento. Para isso, uma técnica de imagem in vivo que detecta transitórios de cálcio em neurônios usando indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), um microscópio de fluorescência miniaturizada e uma lente de índice de refração gradiente (GRIN) foi desenvolvida e aplicada com sucesso em muitas estruturas cerebrais1,2,3,4,5,6. Esta técnica de imagem é particularmente poderosa porque permite imagens simultâneas crônicas de populações celulares geneticamente definidas por um período de longo prazo até várias semanas. Embora útil, essa técnica de imagem não tem sido facilmente aplicada às estruturas cerebrais que se localizam profundamente dentro do cérebro, como a amígdala, uma estrutura cerebral essencial para o processamento emocional e a memória do medo associativo7. Existem vários fatores que dificultam a aplicação da técnica de imagem na amígdala. Por exemplo, artefatos de movimento geralmente ocorrem com mais frequência durante a imagem realizada nas regiões cerebrais mais profundas porque um microscópio de montagem de cabeça implantado nas profundezas do cérebro é relativamente instável. Outro problema é que o ventrículo lateral está posicionado perto da lente GRIN implantada e seu movimento durante a respiração pode causar artefatos de movimento altamente irregulares que não podem ser facilmente corrigidos, o que dificulta a formação de uma visão de imagem estável. Além disso, como as células da amígdala são geralmente silenciosas em um estado de repouso ou anestesiado, é difícil encontrar e concentrar as células-alvo expressando GECI na amígdala durante o procedimento de base para imagens posteriores. Este protocolo fornece uma diretriz útil para como direcionar eficientemente as células expressando GECI na amígdala com microscópio miniaturizado de montagem de cabeça para imagens de cálcio in vivo bem sucedidas em uma região cerebral tão profunda. Nota-se que este protocolo é baseado em um sistema específico (por exemplo, Inscopix), mas não restrito a ele.

Introduction

O cálcio é um segundo mensageiro onipresente, desempenhando um papel crucial em quase todas as funções celulares8. Nos neurônios, o potencial de ação de disparo e a entrada sináptica causam rápida mudança de livre intracelular [Ca2+]9,10. Portanto, o rastreamento de transintes de cálcio oferece uma oportunidade de monitorar a atividade neuronal. GeCIs são ferramentas poderosas que permitem o monitoramento [Ca2+] em populações celulares definidas e compartimentos intracelulares11,12. Entre muitos tipos diferentes de indicador de cálcio à base de proteína, o GCaMP, uma sonda Ca2+baseada em uma única molécula de GFP13,é a GECI mais otimizada e, portanto, amplamente utilizada. Através de várias rodadas de engenharia, uma série de variantes de GCaMP foi desenvolvida12,14,15,16. Utilizamos um dos GCaMPs recentemente desenvolvidos, GCaMP7b, neste protocolo16. Os sensores GCaMP contribuíram muito para o estudo das funções do circuito neural em uma série de organismos modelo, como imagens de transientes Ca2+ durante o desenvolvimento17, imagem in vivo em uma camada cortical específica18,medição da dinâmica do circuito no aprendizado de tarefas motoras19 e imagem da atividade do conjunto celular relacionada com memória de medo associativo no hipocampo e amígdala20,21.

A imagem óptica de GECIs tem várias vantagens22. A codificação genética permite que os GECIs sejam expressos por um longo período de tempo em um subconjunto específico de células definidas por perfil genético ou padrões específicos de conectividade anatômica. A imagem óptica permite o monitoramento simultâneo in vivo de centenas a milhares de neurônios em animais vivos. Alguns sistemas ópticos de imagem foram desenvolvidos para imagens in vivo e análise de GECIs dentro do cérebro de camundongos que se comportam livremente com microscópios de fluorescência miniaturizada de montagem da cabeça21,23,24,25. Apesar da técnica de imagem óptica in vivo baseada em GECIs, lente GRIN e um microscópio em miniatura de montagem de cabeça ser uma ferramenta poderosa para estudar a ligação entre a atividade do circuito neural e o comportamento, aplicar essa tecnologia à amígdala tem sido difícil devido a vários problemas técnicos relacionados com o direcionamento da lente GRIN para células expressando GECIs na amígdala sem causar artefatos de movimento que reduzem severamente a qualidade da aquisição de imagens e encontrar células expressas gecIs. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para procedimentos cirúrgicos de fixação de placa base e implantação de lentes GRIN que são etapas críticas para o sucesso da imagem óptica de cálcio in vivo na amígdala. Embora este protocolo tenha como alvo a amígdala, a maioria dos procedimentos descritos aqui são comumente aplicáveis a outras regiões cerebrais mais profundas. Embora este protocolo seja baseado em um sistema específico (por exemplo, Inscopix), o mesmo propósito pode ser facilmente alcançado com outros sistemas alternativos.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coreia. Todos os experimentos foram realizados de acordo com a diretriz do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais. NOTA: Este protocolo consiste em seis etapas principais: cirurgia de injeção de vírus, cirurgia de implante de lente GRIN, validação da implantação da lente GRIN, fixação da placa base, gravação óptica do sinal GCaMP durante um teste de com…

Representative Results

Validação da implantação das lentes GRINAntes de anexar cronicamente a placa base ao cérebro por cimentação, a implantação da lente GRIN precisa ser validada. Em animais com implantação bem sucedida de lentes, tanto células expressas GCaMP quanto vasos sanguíneos foram claramente observados dentro de uma faixa de plano focal determinada pela distância entre lente objetiva de microscópio e lente GRIN implantada(Figura 2A e B</stron…

Discussion

Técnicas de cirurgia habilidosas são essenciais para alcançar imagens de cálcio óptica in vivo bem sucedidas com microscopia em miniatura de montagem de cabeça em regiões cerebrais mais profundas, como a amígdala como descrevemos aqui. Portanto, embora este protocolo forneça uma diretriz para processos cirúrgicos otimizados de fixação de placas base e implantação de lentes GRIN, processos adicionais de otimização podem ser necessários para etapas críticas. Como mencionado na seção de protocolo, amígd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Samsung Science and Technology Foundation (Project Number SSTF-BA1801-10).

Materials

26G needle BD 302002 Surgery
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE Addgene 104493-AAV1 Surgery
AAV2/1-CaMKiiα-GFP custom made Surgery
Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) Lang 1334-pink Surgery & Baseplate Attachment
Air flow manipulator Neurotar NTR000253-04 Baseplate Attachment
Amoxicillin SIGMA A8523-5G Surgery
Baseplate INSCOPIX 1050-002192 Baseplate Attachment
Baseplate cover INSCOPIX 1050-002193 Baseplate Attachment
Behavioral apparatus (chamber) Coulbourn Instrument Testcage Behavior test
Behavioral apparatus (software) Coulbourn Instrument Freeze Frame Behavior test
Carbon cage Neurotar 180mm x 70mm Baseplate Attachment
Carprofen SIGMA PHR1452-1G Surgery
Data processing software INSCOPIX INSCOPIX Data Processing Software Baseplate Attachment & Behavior test
Dexamethasone SIGMA D1756-500MG Surgery
Drill Seyang marathon-4 Surgery
Drill bur ELA US1/2, Shank104 Surgery
Glass needle WPI PG10165-4 Surgery
GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) INSCOPIX 1050-002208 Surgery
Hamilton Syringe Hamilton 84875 Surgery
Head plate Neurotar Model 5 Surgery
Hex-key INSCOPIX 1050-004195 Baseplate Attachment
Laptop computer Samsung NT950XBV Surgery & Baseplate Attachment
Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) INSCOPIX 1050-004223 Surgery
Microscope gripper INSCOPIX 1050-002199 Baseplate Attachment
Microscope, DAQ software, hardware INSCOPIX nVista 3.0 Baseplate Attachment & Behavior test
Mobile homecage Neurotar MHC V5 Baseplate Attachment
Moterized arm Neurostar Customized Surgery
Moterized arm software Neurostar Customized Surgery
NI board National instrument Behavior test
Removable epoxy bond WPI Kwik-Cast Surgery
Resin cement (Super-bond) Sun medical Super bond C&B Surgery
Skull screw Stoelting 51457 Surgery
Stereotaxic electrode holder ASI EH-600 Surgery
Stereotaxic frame Stoelting 51600 Surgery
Stereotaxic manipulator Stoelting 51600 Baseplate Attachment

References

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Cite This Article
Lee, H., Han, J. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (162), e61659, doi:10.3791/61659 (2020).

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