Summary
소 난소 피질의 체외 문화와 난소 미세 환경에 대한 영양 계단 단계 식단의 효과가 제시됩니다. 난소 피질 조각7 일 동안 배양 하 고 스테로이드, 사이토 카인, 그리고 여포 단계 평가 되었다. 계단 단계 다이어트 치료는 문화에서 여포 진행의 결과로 증가 스테로이드 발생했다.
Abstract
초보에서 antral 단계로의 여포 발달은 체세포 및 적혈구 세포-oocyte 통신에서 내분비 및 파라크리인을 포함하는 난소 피질 내의 동적 과정입니다. 난소 미세 환경과 주변 밀리에서 생산 된 사이토카인과 스테로이드가 여포 진행 또는 체포에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있습니다. 난소 피질의 체외 배양은 여포가 인접한 스트로마에 의해 지원되는 정규화된 환경에서 발전할 수 있게 합니다. 우리의 목표는 소난소 피질의 체외 문화를 통해 난소 미세 환경 (여포 발달, 스테로이드 및 사이토카인 생산)에 영양 계단 단계 식단의 효과를 결정하는 것이었습니다. 이를 위해 난소 피질 조각은 사춘기 이전에 두 가지 영양학적으로 개발된 두 가지 영양학적 개발 체계를 겪고 있는 하이퍼에서 제거되었습니다: 제어(전통적인 영양 발달) 및 Stair-Step(개발 중 의 먹이 주기 및 제한) 약 0.5-1mm3개로 절단되었습니다. 이 조각들은 이후 일련의 세차를 통과하고 웨이머스의 배양 배지를 잘 포함하는 조직 배양 삽입에 배치되었다. 난소 피질은 매일 문화 매체의 변화와 함께 7 일 동안 배양되었다. 조직학적 단면은 추가 치료 없이 영양의 영향과 문화의 영향을 결정하기 위해 문화 전후의 여포 단계 변화를 결정하기 위해 수행되었다. 피질 배양 배지 스테로이드를 측정 하기 위해 일 동안 풀링 되었다, 스테로이드 대사 산물, 그리고 사이토 카인. 난소 미세 환경에서 증가 된 스테로이드 호르몬에 대 한 경향이 있었다 제어 난소 피 질 배양 대 계단 에서 여포 진행을 허용. 난소 피질 배양 기술은 난소 미세 환경의 더 나은 이해를 허용하고, 내분비 분비의 변경이 생체 및 체외 치료 모두에서 여포 진행과 성장에 영향을 미칠 수있는 방법. 이 문화 방법은 또한 비옥을 승진시키기 위하여 여자에 있는 여포 진행을 향상할 수 있는 잠재적인 치료시험을 위한 유익한 증명할 수 있습니다.
Introduction
난소 피질은 여포 발달이 발생하는 난소의 외부 층을 나타냅니다1. 처음에 개발에서 체포 된 원시 여포는 파라크리네 및 생식샘 호르몬 입력1,2,3,4에기초한 원차, 보조 및 다음 항제 또는 삼차 여포로 활성화됩니다. 난소 내의 생리적 과정을 더 잘 이해하기 위해 조직 배양은 체외 모델로 사용될 수 있으므로 조절된 환경이 실험을 수행할 수 있습니다. 많은 연구가 보조 생식 기술, 불임 보존 및 난소암5,6,7의연구를 위해 난소 조직 문화를이용했습니다. 난소 조직 배양은 또한 난소 건강을 손상시키는 생식 독소를 조사하는 모델로 사용되었으며 다낭성 난소 증후군 (PCOS)8,9,10,11과같은 생식 장애의 병인. 따라서 이 문화 시스템은 다양한 특산품에 적용할 수 있습니다.
설치류에서, 전체 태아 또는 주산기 생식기 생식 실험에 사용 되었습니다12,13,14,15. 그러나, 큰 국내 가축에서 gonads그들의 큰 크기와 잠재적인 변성 때문에 전체 기관으로 배양 될 수 없습니다. 따라서, 소, 및 비인간 영장류 난소 피질은 작은조각으로 절단된다 16,17,18. 많은 연구는 국내 가축및 비인간 영장류에서 원시 여포 개시에서 다양한 성장 인자를 연구하기 위해 작은 난소 피질 조각을배양1,17,18,19. 난소 피질 문화의 사용은 또한 7 일20동안 배양 된 소와 영장류 피질 조각에 대한 혈청이 없는 상태에서 원시 여포 개시를 입증했다. 양과 포춘은 2006년 10일 이상 다양한 테스토스테론 투여량으로 태아 난소 피질 배양 배지를 치료하고,10-7M 의 테스토스테론 농도가 여포 모집, 생존, 초기 단계 여포의 진행 증가등을 관찰하였다 19. 2007년, 소 태아(임신 5-8개월)로부터 난소 피질 배양을 사용하여 양과 포춘은 1차에서 이차 여포전환(21)에혈관 내피 성장 인자 A(VEGFA)의 역할을 보고했다. 더욱이, 당사의 실험실은 VEGFA가16을결합하는 주요 신호 전달 수용체인 키나제 도메인 수용체(KDR)를 통해 VEGFA 이소형성(혈관형성, 항혈관형성 및 조합)이 어떻게 다른 신호 전달 경로를 조절할 수 있는지 를 보여주기 위해 난소 피질 배양을 활용하였다. 이 정보는 다른 VEGFA 동소 형태가 여포 진행 또는 체포를 유도하는 신호 경로에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수 있었습니다. 함께 촬영, 다른 스테로이드 또는 성장 인자와 체외에서 난소 피질 조각의 배양 여 포 여 추 신을 조절 하는 메커니즘에 미치는 영향을 결정 하는 귀중 한 분석 될 수 있습니다. 유사하게, 다른 영양 정권에 개발되는 동물은 여성 생식 성숙에 영향을 미치는 여포 발생을 촉진하거나 억제 할 수있는 난소 미세 환경을 변경했을 수 있습니다. 따라서, 현재 원고에서 우리의 목표는 소 피질 배양 기술을 보고하고이전에설명된 바와 같이 13개월에 수집된 암소 피질로부터 소 피질의 체외 배양 후 난소 미세환경에 차이가 있는지 여부를 결정하는 것입니다.
따라서, 우리의 다음 단계는 다른 영양 식단으로 개발 된 이 암소에서 난소 미세 환경을 결정하는 것이었습니다. 우리는 계단 단계 또는 제어 규정식으로 공급된 암낭에서 난소 피질을 평가했습니다. 제어 용 heifers는 84 일 동안 97.9 g / kg0.75의 유지 보수 식단을 제공받았다. Stair-Step 규정식은 84 일 동안 67.4 g/kg0.75의 제한된 규정식을 포함하는 8 달에 시작되었습니다. 처음 84일 후, 컨트롤 하이퍼는 97.9 g/kg0.75를계속 받았지만, 계단-스텝 쇠고기 하이퍼는 68일 동안 118.9g/kg0.75를 제공받았으며, 그 후16세의 13개월 동안 모낭 단계와 모폴로지의 변화를 연구하기 위해 16세에 소독화되었다. 우리는 또한 스테로이드에 차이 대 한 분석, 스테로이드 대사 산물, chemokines, 그리고 시토 카인 피 질 매체로 분 비. 스테로이드와 다른 대사 산물 생체 내에서 실시 하는 치료에서 어떤 직접적인 효과 있는지 확인 하기 위해 측정 되었다 및/또는 조직 생존 및 생산성에 시험관 내. 문화 이전과 후 난소 미세 환경의 변화는 문화 전에 내분비 밀리우와 여포 발생의 스냅 샷을 제공하고 문화 동안 문화 또는 치료가 여포 진행 또는 체포에 미치는 영향.
난소는 미국에서 혈관 절제술이 수행 된 후 수집되었다. 육류 동물 연구 센터 (USMARC)는16세의 13 개월에 제어 및 계단 - 스텝 암종의 IACUC 절차에 따라, 혈액 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 0.1 %의 항생제로 세척, 초과 조직을 손질하고 네브래스카 - (UNL 생식 의학) 3°C로 수송 . UNL에서 난소 피질 조각은 작은 사각형 조각으로 절단되었습니다 (~ 0.5-1 mm3; 그림 1) 7 일 동안 배양(그림 2). 조직학은 모낭 단계16,24 (도 3 및 도 4)및 섬유증을 나타낼 수 있는 세포외 매트릭스 단백질(Picro-Sirus Red, PSR; 그림 5). 이것은 여포 단계에 생체 내 영양 정권의 효력의 결정을 허용하고 여포 단계 및 여포 진행에 난소 피질의 7 일 비교를 허용했습니다. 배양 전반에 걸쳐, 배지는 매일 수집 및 변경되었습니다 (약 70%의 미디어가 매일 수집되었다; 250 μL/well) 그래서 매일 호르몬/사이토카인/케모킨을 평가하거나 평균 농도를 얻기 위하여 며칠 동안 풀로 울 수 있습니다. 안드로스텐디온(A4) 및 에스트로겐(E2)과 같은 스테로이드는 3일 이상 풀려나 방사선 면역분석술(RIA;; 그림 6) 및 동물 당 4 일 이상 풀및 고성능 액체 크로마토그래피 질량 분광법 (HPLC-MS)24,25 (표 1)를통해 분석. 사이토카인 어레이는 난소 피질 배양배지(26)에서 사이토카인 및 체모킨 농도를 평가하기 위해 활용되었다(표 2). 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석 플레이트는 이전에16회입증된 바와 같이 특정 신호 트랜스듀션 경로에 대한 유전자 발현을 결정하기 위해 수행되었다. 모든 스테로이드, 사이토카인, 여포 단계 및 조직학적 마커는 난소 미세 환경의 스냅샷과 "정상" 또는 "비정상적인" 여포 발생을 촉진하는 마이크로 환경의 능력에 대한 단서를 제공합니다.
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Protocol
난소는 미국 육류 동물 연구 센터16에서수득하였다. 앞서 언급한 바와같이,농업 연구 및 교육에서 농업 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 미국 육류 동물 연구 센터 (USMARC) 동물 관리 및 사용위원회에 의해 모든 절차가 승인되었습니다. 난소는 네브래스카 링컨 생식 연구소로 옮겨졌으며, 그곳에서 가공되고 배양되었습니다.
1. 필수 미디어 준비
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웨이머스 MB 752/1 매체
- 멸균 수의 900mL로 1 L 티슈 배양 병을 채웁니다. 물이 교반 판에 부드럽게 저어주면서 가루 를 점차적으로 넣습니다. 분말 매체가 용해되면 중탄산나트륨 2.24g을 넣고 소세럼 알부민(BSA)을 1.25g씩 첨가한다. pH 미터를 사용하고 pH를 7.25-7.35로 조정합니다. 멸균 물을 추가하여 최종 부피를 1L로 가져옵니다.
- 생물학적 안전 캐비닛으로 이동하고 배지의 0.1 % v / v의 농도에 페니실린 연쇄 상균 황산염을 추가합니다. 0.22 μm 모공 33.2cm2 500 mL 병 상단 필터로 매체를 필터링합니다.
- 여과된 배지를 여러 50mL 원문 튜브에 붓습니다. 알리인용 배지의 50mL 당 인슐린-트랜스퍼린 셀레늄0.5mL를 추가합니다.
- 알루미늄 호일에 매체의 원물 튜브 및 스톡 병을 감싸고 4 °C에 보관하십시오. 이 매체는 빛에 민감합니다.
참고: 웨이머스 배지는 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
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라이보비츠의 L-15 (LB-15) 매체
참고 : LB-15 배지는 문화에 대비하여 조직을 청소하는 데 사용됩니다.- 멸균 수의 900mL로 1 L 티슈 배양 병을 채웁니다. 멸균물이 교반판에 부드럽게 저어주면서, 준비된 가루 매체를 점진적으로 추가합니다. pH 미터를 사용하고 pH를 7.25-7.35로 조정합니다. 멸균 물을 추가하여 최종 부피를 1L로 가져옵니다.
- 생물학적 안전 캐비닛으로 이동합니다. 0.1%의 항생제로 LB-15 1L을만드십시오(재료표 참조). 0.22 μm 모공 33.2 cm2 500 mL 병 상단 필터를 사용하여 배지를 2 개의 500 mL 조직 배양 병으로 필터링하십시오. LB-15 배지가 빛에 민감하고 4 °C에서 저장으로 알루미늄 호일에 병을 감쌉니다.
참고: LB-15 배지는 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
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인산염 완충식식염수(PBS)
- 실험실에서 PBS를 만들거나 칼슘이나 마그네슘(재료의 표)없이멸균 PBS를 구입합니다. 실험실에서 PBS를 만들려면 증류수 800mL로 시작하여 8 g의 염화 나트륨(NaCl)을 추가하십시오. 그런 다음 염화칼륨(KCl), 인산나트륨 디베이직 1.44g(Na2HPO4),칼륨 인산염 디베이직 0.24g(KH2PO4)을추가합니다. pH를 ~7.4로 조정하고 총 부피를 1L로 조정하여 용액을 소독합니다.
- 생물학적 안전 캐비닛에있는 동안 0.1 %의 항생제 (재료의 표참조)와 1 L PBS를 확인합니다.
2. 난소 피질 배양 프로토콜
참고: 난소는 13개월에 태어난 USMARC 휴퍼로부터 수득되었습니다. 난소는 철저히 헹구었고, 모든 혈액 및 기타 액체는 항생제(0.1%)를 함유하는 PBS로 제거되었고, 37°C23에서 네브래스카-링컨 생식연구소 UNL(1.5h 거리)으로 이송하였다. (운송 중 난소 의 온도에 대한 의견은 토론을참조하십시오)
- 깨끗한 벤치에 난소 조직을 준비(그림 1).
- 70%의 에탄올로 깨끗한 벤치를 소독합니다. 벤치탑에 신선한 흡수 패드를 놓습니다. 깨끗한 벤치 송풍기는 흡수 패드를 포함하여 깨끗한 벤치에서 아무것도 살균하고 적절한 PPE가 사용되는지 확인하기 위해 UV 빛과 함께 해부 반 시간 전에 켜져 있는지 확인합니다.
- 페트리 접시(60 x 15mm)를 조직 세정에 준비합니다. PBS 세척에는 3개의 페트리 요리, 항생제를 가진 PBS의 경우 3개, LB-15 세척용 3개가 필요합니다. 뚜껑이 포함된 추가 LB-15 페트리 접시는 세척 후 조각의 최종 배치에 사용됩니다.
- 각 페트리 접시를 PBS 또는 LB-15 중 약 10mL의 적절한 유체로 채웁니다.
그림 1:깨끗한 벤치에서난소와 피질 조각을 세척하기위한 플레이트의 레이아웃. (A)피질의 섹션이 제거됨에 따라 난소를 세척하는 데 사용되는 PBS. (B)피질 조각이 통과하는 항생제 세동을 가진 PBS. (C)난소 피질 조각은 LB-15에서 최종 세척을 위해 생물 안전 캐비닛으로 이동하기 전에 LB-15에서 4번 세척된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 냉장고에서 준비된 웨이머스 와 LB-15 매체를 제거하고 따뜻한 온도에서 실온으로 제거합니다.
- 사용하기 전에 멸균을 보장하기 위해 모든 도구를 자동 복제합니다.
- 난소 피질이 수집 될 준비가 될 때까지 37 °C에서 난소를 유지합니다.
- 톱니 모양의 턱이 있는 집게를 사용하여 난소를 집어 들고 PBS가 가득한 페트리 접시를 철저히 씻으십시오. 난소를 두 번째 PBS 세척으로 옮기고 다시 한 번 철저히 정화합니다.
참고: 난소 피질 스트립이 제거되는 동안 난소는 두 번째 PBS 세척에 유지됩니다. - 톱니 모양의 턱 집게를 사용하여 난소를 고정하고 반으로 자릅니다. 이 때 난소 피질은 수질에서 절단됩니다. 눈금자를 사용하여 난소 의 표면 깊이의 1-2mm 이상이수질(16)에서제거되지 않도록 하십시오. 수질에서 난소 피질의 횡단 섹션을 제거하고 메스 (#11 메스 블레이드;#3 핸들)로 난소 피질의 3-4 얇은 스트립을 자르고 세 번째 PBS가 채워진 페트리 접시에 스트립을 놓습니다.
참고: 이 때, RNA 추출을 위해 추가 난소 피질 조직을 수집하거나 초기 비배양피질 조각의 조직학을 위해 고정 및 수집될 수 있다. 난소 피질의 스트립을 제거할 때, 눈에 보이는 개미 여포 또는 코포라 루테아가 있는 부위를 피하십시오. 또한 수질 조직을 수집하지 마십시오. 수질의 히스토로지(16)는 이전에표시된 것과 매우 다릅니다. 난소 피질이 1-2mm 깊이 이상으로 절단되지 않으면 수질을 얻을 수 없습니다. 뚜렷한 히스토로지에서는 피질과 수질 사이의 랜드마크가 있습니다. - 세 번째 PBS 워시의 난소 피질 스트립을 #21 메스 블레이드로 작고 사각 조각(~0.5-1mm3)으로자른다. 페트리 접시 아래에 있는 통치자를 사용하여 조각이 비슷한 크기와 두께를 보장하여 일관된 난소 피질 조각을 만듭니다. 메스로 조각을 자르면서 스트립을 고정하려면 집게를 사용합니다.
참고: 절단된 조직 조각의 수는 실험에 따라 달라집니다. 난소 피질의 4 개는 문화에 필요한 조직의 최소 금액입니다. 적절한 길이와 깊이를 보장하기위한 다른 방법은 템플릿(27)으로특수 슬라이서(26) 또는 미리 절단 플라스틱 조각을 사용하는 것을 포함한다. - 항생제로 채워진 페트리 요리로 세 PBS를 통해 난소 피질 조각을 씻으시다. 곡선 팁 집게를 사용하여 세차 사이에 조각을 이동합니다.
- LB-15 세차재 시리즈를 통해 피질 조각을 이동하고 최종 LB-15 채워진 페트리 접시에 배치합니다. 뚜껑에 동물 ID와 난소 면(왼쪽 또는 오른쪽)으로 라벨을 붙입니다.
참고: 철저한 세척을 위해 각 세척에 난소 피질 조각을 완전히 담급하십시오. - 난소 당 4 개의 난소 피질 조각을 수집하고 하루 제로 히스토로지 수정합니다. 추가 조각은 또한 RNA를 위해 동결플래시될 수 있습니다. 나머지 조직 조각은 문화에 사용됩니다. 각 조직 수집 후 70%의 에탄올로 해부 도구를 닦아냅니다.
- 최종 조직 세척 및 문화 준비를 위한 생물학적 안전 캐비닛을 준비하십시오. 생물학적 안전 캐비닛에 넣기 전에 70%의 에탄올로 소모품을 소독합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서 작업할 때 무균 기술을 사용합니다.
- 문화를 위한 모든 난소 피질을 생물학적 안전 캐비닛으로 옮기고 LB-15가 채워진 페트리 접시에 다시 한 번 씻으실 수 있습니다.
- 24웰 조직 배양 플레이트에서 웨이머스 배지의 파이펫 350 μL은 웰당.
- 코팅되지 않은 배양체를 각 웰에 잘 삽입하여 집게를 사용합니다. 이 조직이 건조 될 것 같은 삽입의 밑에 형성되지 않는 것을 확인합니다. 매체는 매체가 흡수되고 난소 피질 조각을 둘러싸고 있을 수 있도록 인서트를 만져야 합니다.
- 각 인서드의 메쉬에 4개의 난소 피질 조각을 조심스럽게 배치합니다(그림2). 집게는 조직 조각이 섬세하게 배치되지 않으면 메쉬를 펑크 할 수 있습니다. 조직 조각은 서로 또는 삽입의 측면을 만지지 않아야합니다.
- 조직을 37 °C에서5 % CO216으로배양하십시오.
참고 : 다른 사람들은 38.8 °C28을사용했다. 그러나, 조직의 무결성이나 37°C 조직에서 진행되는 여포의 능력에서 차이가 관찰되지 않았으며 다른39,30이있다. 따라서, 이 시점에서 이러한 온도 중 어느 것이 성공 실험에 도움이 되어야 한다. 다른 사람들은 매체의 400 μL을 사용했습니다. 어느 양중 하나는 일관된 한, 조직이 부분적으로 침수되어 조직의 수분을 허용합니다 (난소 피질 조각을 둘러싼 미디어). 다른 우물의 증발을 줄이기 위해 멸균 물의 500 μL로 빈 우물을 채웁니다.
도 2: 난소 피질 조각 및 배양 판. (A)난소 스트립은 난소의 피질에서 절단되는. (B)눈금자와 피질 조각이 나란히 표시됩니다. (C)4개의 피질 조각(~0.5-1 mm3)이플레이트 내의 배양 배지에 삽입에 놓여 있다. (D)우물에서 배양 배지를 수집하는 인서트를 들어 올린다. 적절한 pH를 유지하기 위해 매일 모든 배양 배지(250 μL)를 수집하고 교체합니다.매일 매일 약 250 μL(초기 배양 배지의 약 70%)에서 얻어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 미디어 컬렉션
- 난소 피질 배양 배지를 매일 7일 동안 변경합니다. 중간 변화는 매체의 큰 pH 및 색상 변화를 방지하기 위해 가능한 한 24h 에 가까워야합니다. 중간 변화 전에 37 °C에 따뜻한 웨이머스 중간. 매일 약 250 μL이 매일 우물에서 얻습니다 (초기 배양 매체의 약 70 %).
- 중간 변경 시 집게를 사용하여 삽입을 웰에서 부드럽게 들어 올립니다. 배양 된 웨이머스 배지를 0.5 mL 튜브 (약 250 μL /일)로 수집합니다. 인서트를 다시 잘 설정하고 삽입의 측면 사이에 배지를 분배하여 신선한 배양 배지의 350 μL을 추가합니다.
참고: 모든 스테로이드를 측정 하기 위해 충분 한 미디어를 얻기 위해 매일 미디어의 대부분을 변경, 사이토 카인, 그리고 난소 미세 환경을 결정 하는 데 필요한 chemokines. 또한, 매일 매체의 변화는 매체에서 큰 pH 변화(색상 변화에 의해 표시)를 방지하는 것이 중요하다. 나타리안 피질 조각을 둘러싸고 배지 방울을 유지하여 조각이 젖은 상태로 유지되도록 했습니다. 미디어의 70%를 변경하기 때문에 배양 된 조직에 아무런 문제가 관찰되지 않았습니다. - 조직 배양으로부터 수집된 배지를 -20°C로 저장합니다.
4. 이미징 및 다운스트림 처리
- 37°C에서5%CO2로7일간의 배양 후, 부착된 카메라와 컴퓨터 이미징 소프트웨어 프로그램을 갖춘 해부 현미경을 이용한 난소 피질 조각을 이미지화한다.
참고: 어두운 방은 일반적으로 이미징을위한 최고의 화질을 달성하는 데 가장 좋습니다. - 이미징 후, 부인에서 잘 2개의 난소 피질 조각을 고치고, cDNA에 대한 RNA를 얻기 위해 액체 질소에 두 개의 난소 피질 조각을 동결한다. 조직으로 모든 우물에 대한이 단계를 반복합니다. 7일째부터 배지를 수집하고 -20 °C에보관하십시오.
- 난소 피질 조각이 부인(picric acid 750mL, 빙하 아세트산 50mL, 37%-40% 포르말린 250mL)에 잠그고 약 1.5시간 동안 에탄올을 3회 세척합니다. 조직은 70% 에탄올에 남아 용액이 더 이상 노랗지 않을 때까지 매일 지워질 것입니다.
참고: 부인 이외의 고정물뿐만 아니라 파라포름알데히드를 사용할 수 있습니다. 이 체험부에서 부인은 최적의 형태를 달성하기 위한 고정성으로서 사용된다. 다른 분석에 더 많은 조직이 필요한 경우, 각 동물에서 미디어 와 난소 피질의 조각의 추가 우물을 얻을 수 있습니다.
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Representative Results
이 소 피질 배양 절차는 난소의 작은 조각에서 호르몬, 사이토카인 및 작사학 데이터의 다양한 을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 헤마톡시린 및 에오신(H&E)과 같은 염색은 여포 스테이징16,23,31(도 3)을통해 난소 형태를 결정하는 데 사용될 수 있다. 간략하게, 여포는 원형으로 분류되었다, 이는 편평상피 전 과립 세포의 단일 층으로 둘러싸인 난모세포 (0); 과도기 여포 또는 초기 1 차, 주로 편평상피 전 과립 세포와 일부 입체 과립 세포에 의해 포위 된 난모세포 (1); 1 차포, 1-1.5 층의 입체 과립 세포 (2)에 둘러싸인 난모입니다; 이차 여포는 두 개 이상의 입체 과립 세포 (3)에 둘러싸여 있는 난모세포입니다. 직경 이 1mm 이하이며 뚜렷한 antrum(4)16,23(도 3)을포함하는 과립세포 의 2층 이상의 층으로 둘러싸여 있는 개미 여포. 여포 스테이징은 모낭 발생을 평가하기 위해 문화 전에 고정된 난소 피질에 대해 수행될 수있다(도 4). 우리는 H&E로 얼룩진 세 가지 슬라이드에서 슬라이드 당 세 개의 이미지를 찍었습니다. 이어서, 여포는 3명의 개인에 의해 준비되고 계산되고 각 단계16,23에서여포의 수를 결정하기 위하여 평균되었습니다. 400x 배율에서 이미지(슬라이드당 3개)에 대한 시야 영역은 0.4mm2이다. 따라서 난소 피질 조각 영역의 30%가 여포 단계를 결정하기 위해 계산되었다. 초기 여포번호(문화 전)(도4A)는문화(도4B)에따라 계산된 여포를 정상화하는 데 사용된다.
또한, 콜라겐 증착(Picro Sirus Red 염색)에 의해 결정된 형태학의 차이는 계단 단계 또는 제어 암종으로부터 난소 피질에서 섬유증을 나타낼 수있다(도 5). 리아(동물당 200 μL 배지 샘플을 사용하여) 다양한 스테로이드 호르몬 생산을 평가하기 위해 3일 이상 배양 배지를 수집할 수 있습니다. 그림 6) 또는 고성능 액체 크로마토그래피 질량 분광법을 이용한 스테로이드 대사산물(HPLC-MS; 220 μL 배지 샘플은 동물당 4일 이상 풀림) 표 1) 및 사이토카인 생성(표 2). 따라서, 하나의 동물의 여러 복제는 원하는 모든 방법을 수행하기에 충분한 피질 매체를 보장하기 위해 필요할 수 있습니다.
계단-단계 heifers 문화의 시작 부분에 원시 여포증가 했기 때문에 우리는 문화에서 진보하 고 우리가 결과에서 관찰 하는 보조 여포의 더 많은 수를 얻을 것으로 예상. 또한, 보조 여포의 증가로 인해, 우리는 스테로이드의 더 큰 농도 를 기대할 것 이다. 우리는 안드로겐, 글루코코르티코이드 대사 산물, 및 황체 호르몬 대사 산물의 증가에 대한 경향을 보았으며, 이는 현재 원고에서 이를 뒷받침할 것입니다. 우리의 실험실은 또한 여포 진행에 다른 VEGFA 동위 원소형태의 효과 평가 했다, 스테로이드 발생, 그리고 KDR에서 다른 신호 전이 분자의 활성화 (또한 혈관 내 피 성장 인자 수용체로 알려진 2; VEGFR2) 신호 전도 어레이플레이트(16)를사용 한다. 동물 변화를 줄이기 위해, 우리는 치료 당 4-6 동물을 사용하고 전력 분석 및 가변성에 따라 다른 실험을 위해 우리는 11만큼 사용했다.
소 난소 피질 배양에서 결과의 반복성은 난소 피질 조각의 오염에 의해 가장 영향을 받습니다. 또한 24-h 기간 내에 매체가 정기적으로 변경되지 않는 경우 음수 또는 하위 파 결과가 발생할 수 있습니다. 원래 첨가된 매체는 분홍색으로 되어 있지만, 배지가 수집되고 색상이 주황색 또는 밝은 노란색으로 나타나면 조직에 해로울 수 있는 pH의 변화를 나타낼 수 있다. 또한, 너무 큰 절단 조직 조각 은 조직학을 위한 조직 단면까지 관찰 되지 않을 것 이다 중간에 변성을 개발할 수 있습니다. 이러한 변성은 분석을 위한 조직의 사용을 제한할 것이다. 이 백서에 제시된 데이터는 통계 소프트웨어 프로그램에서 비파라메트릭 테스트 및 일반 선형 모델 분석을 사용하여 분석되었습니다. 문화 전후의 원초, 기본, 이차 및 개미 여포의 수는 일반화된 선형 혼합 모델을 사용하여 분석되었다. 의의는 p < 0.05에서 결정되었고 경향은 0.14 ≤ p ≥ 0.05로 보고되었다.
그림 3: 난소 피질의 여포 준비에 대한 헤마톡린과 에오신 염색. 여포의 다른 단계는 화살표로 표시됩니다. (A)원시 여포 (단계 0); (B)초기 1차 여포(1단계); (C)1차 여포(2단계); (D)이차 여포(3단계); (E)개미 여포 (4단계). 400x 배율에서 이미지에 대한 시야 영역은 0.4 mm2입니다. 우리는 여포 단계를 결정하기 위하여 난소 피질 조각의 지역의 30%를 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대조군(n=6) 및 계단-스텝(n=6) 하이퍼의 상이한 여포 스테이지에서의 평균 여포 수. (A)배양 프리모다이얼 P = 0.001, 초차 P = 0.12, 초등P = 0.31, 보조 P = 0.22. (B)7일간의 배양 후, 원시 P = 0.37, 초기 기본 P = 0.84, 기본 P = 0.69, 보조 P = 0.02. 오류 막대는 SEM을 대표합니다.
그림 5: 콜라겐 (피크로 시리우스 레드; PSR) 난소 피질에 염색. PSR(A)제어 및 계단 -단계 휴퍼 에서 일 0 과 7 일. (B)난소 피질 필드당 PSR 양성 염색의 평균 면적(픽셀/μm2)을 대조군(n=4) 및 계단-스텝(n=4) 암캐 사이의 그래프. 오류 막대는 SEM을 대표하며, 400x 배율에서 이미지에 대한 시야 영역은 0.4mm2이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: A4 및 E2의 농도 A4 및 E2의 농도 (A)농도 A4 및(B)농도는 RIA에 의해 측정된 바와 같이 제어 및 계단-단계 암종의 난소 피질 배지에서 3일간의 배양에 모여 있다. n = 각 그룹에 대해 4. 오류 막대는 SEM을 대표합니다.
| 호르몬 | 제어 | 계단 단계 | P-값 | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| ng/mL | 의미하다 | SEM ± | 의미하다 | SEM ± | ||
| 문서 | 0.33 | 0.28 | 0.72 | 0.48 | 0.15 | |
| 여관 | 0.61 | 0.60 | 4.93 | 3.99 | 0.08 | |
| 코르트 () | 0.003 | 0.003 | 0.01 | 0.01 | 0.85 | |
| 17OHP | 0.59 | 0.53 | 1.88 | 0.99 | 0.08 | |
| A4 | 1.46 | 1.43 | 5.74 | 3.27 | 0.08 | |
| AN | 0.15 | 0.09 | 0.54 | 0.32 | 0.08 | |
| 디하스 | 4.50 | 2.60 | 7.59 | 0.85 | 0.56 | |
| E2 | 0.05 | 0.05 | 0.13 | 0.08 | 0.32 | |
| P4 | 5.05 | 2.78 | 6.52 | 1.66 | 0.39 | |
| T | 0.33 | 0.33 | 1.33 | 0.96 | 0.14 | |
| DHT | 0.07 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.09 | |
| DOC - 11-데옥시코르티코스테론, INN - 11-데옥시코르티솔, 코르트 – 코르티코스테론, 17OHP – 17-하이드록시프로게스테론, A4-안드로스텐데디오네, AN – 안드로론, DHEAS – dehydroepiandrosterone 황산염, E2 - 데슬라디오, P4 프로테스토스테론 – 프로테스토스테론 | ||||||
표 1: 스테로이드와 스테로이드 대사 산물 난소 피 질 배양 배지각 동물에 대 한 하나의 잘 에서 측정 4 문화의 일. 평균 ± SEM. Blue로 제공되는 데이터는 P < 0.1을 나타내며 다른 경향이 있습니다.
| 사이토카인 | 제어 | 계단 단계 | P-값 | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| pg/mL | 의미하다 | SEM ± | 의미하다 | SEM ± | ||
| ANG1 | 27.29 | 11.71 | 63.66 | 25.06 | 0.39 | |
| CD40L | 4527.01 | 2986.34 | 3537.59 | 3537.59 | 0.74 | |
| DCN | 1307.68 | 320.87 | 996.54 | 282.96 | 0.77 | |
| 인프β | 0.36 | 0.36 | 0.002 | 0.002 | 0.85 | |
| IL18 | 0.00 | 0.00 | 1832.89 | 1265.33 | 0.13 | |
| LIF | 97.45 | 88.12 | 337.58 | 231.25 | 0.54 | |
| 랜츠 | 698.06 | 322.59 | 1254.13 | 811.19 | 0.56 | |
| 인파그라지 | 4.49 | 1.37 | 3.68 | 0.65 | 0.77 | |
| IL13 | 501.21 | 285.07 | 810.81 | 159.67 | 0.25 | |
| IL21 | 24.38 | 9.51 | 18.52 | 6.17 | 0.56 | |
| IL1F5 | 5.07 | 3.85 | 5.40 | 1.70 | 0.56 | |
| TNFα | 61.45 | 35.00 | 44.91 | 13.41 | 0.77 | |
| ANG1 – 안지오포이에틴 1, CD40L – CD40 리간드, DCN – 데코린, IFNβ – 인터플루언티콘 베타 1, IL18 – 인터류키인-18, LIF – 백혈병 억제 공장, 란테스 – 활성화에 규제, 정상 T 세포 발현 및 분비, IFNγ – 인터루콘 감마, IL13 – 인터류키 13, IL21 – 인터류키 21, IL1F5 – 인터루키인 1, IL1F5 - 인터류크인 1, Il1F5 - 인터루크인 1, 인터루크인 1 | ||||||
표 2: 4일 동안 배양한 각 동물에 대해 하나의 우물에서 난소 피질 배양 배지로 측정된 사이토카인과 케모킨. 평균 ± SEM. Blue로 제공되는 데이터는 P < 0.1-0.14를 나타내며 다른 경향이 있습니다.
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Discussion
이 원고에 설명된 바와 같이 체외 난소 피질 문화의 장점은 여포를 둘러싼 인접한 기질이 있는 정상화된 환경에서 여포가 발전한다는 것입니다. 체세포 및 난소세포는 그대로 유지되며 생체 내 모델으로서 적절한 세포 간 통신이 있다. 우리의 실험실은 7 일 문화 시스템이 난소 피질의 처리를 위한 대표적인 여포 신생 및 스테로이드 발생 데이터를 제공한다는 것을 것을을 발견했습니다. 다른 난소 조직 배양 프로토콜은 10-15일5,6,10의문화권 기간이 1-6일7,32일 또는 긴 배양 기간을 갖는다. 그러나, 우리는 7 일 이상 배양 조직 저하에 이르게 관찰, 감소 된 스테로이드 발생, 그리고 잠재적으로 오염의 증가 가능성 (데이터 표시 되지 않음). 난소 피질을 배양하는 것은 또한 그 특정 동물 내의 난소 미세 환경에 직접적인 통찰력을 제공합니다. 이것은 우리가 영양 정권이 weaning및 heifers에 사춘기로 이끌어 낸 후에 부과된 후에 여포 발달에 있는 변경을 확인한 으로 우리의 실험실에 관심사입니다16.
초보에서 antral 단계로의 여포 발달은 체세포 및 적혈구 세포-oocyte통신(33)으로부터내분비 및 파라크리인인을 포함하는 난소 피질 내의 동적 과정이다. 난소 피질 문화와 같은 조직 배양은 난소 미세 환경에서 이러한 요인과 내분비 밀리우의 기계론적 역할을 조사하는 통제 된 환경을 제공합니다. 난소는 생체 내 치료를 거쳤거나 여포 진행에 미치는 영향을 결정하기 위해 유전적으로 변경된 동물로부터 수집될 수 있습니다.
난소는 또한 국소 아바토이르 (1 h away)에서 수집되고 항생제로 PBS를 포함하는 보온병에서 37 °C에서 수송될 수 있습니다. 수송이 길어지면(예: 하룻밤), 난소는 얼음22에서배송되거나 운반됩니다. 유사한 결과는 난소의 수송이 밤새 얼음에서 또는 보온병에 있는 단기 수송을 가진 37°C에서 일어나는지 관찰되었습니다. 보온병 수송을 가진 37°C는 체외 성숙(IVM) 또는 체외 수정(IVF)34에대한 이 조직으로부터 난모세포의 수확을 허용한다. 다른 연구는 2-8 °C 사이의 온도에서 조직을 운반하는 것도 생식 조직에서 불임 보존을 위해 사용된 것으로 나타났습니다35,36,37. 그러나 다른 연구는 34-37 °C와 얼음에 수송 난소를 사용하고 소 조직 배양(38)의차이를 관찰하지 않았습니다.
난소 피질 배양 조직이 배양 후에 건강하게 보이지 않는 경우에, 이것은 난소 피질의 조각이 너무 커서 때문일 수 있었습니다. 프로토콜의 중요한 단계는 난소 피질 조각이 0.5-1 mm3보다크지 않도록하는 것입니다. 우리는 조각을 측정하고 난소 피질 조각(도 2C)의크기를 결정하기 위해 해부 현미경 내에서 스케일을 사용하는 눈자를 사용합니다. 다른 장비는 균일한 두께와 길이/너비를 각각26에대해 특정 장비(재료 표참조)를 사용합니다. 이러한 장비 조각을 사용할 수 없는 경우 플라스틱 사각형을 템플릿으로 사용하여 균일한 두께를 얻고 유사한 크기의조각(27)을보장할 수 있습니다.
피질에서만 절단 된 조각을 보장하 고 난소를 세척 한 후 수질이 없는 우리는 60 mm 접시에 배치 하 고 반으로 잘라. 피질과 수질은 2020년 16년 아베달 마제드에서 이전에 본 바와 같이 매우 다른 조직학적으로 매우 다릅니다. 난소의 각 절반은 난소에서 피질만 제거되고 수질이 남아 있는지 확인하기 위해 블레이드로 채워집니다. 개인이 이 절단 기술을 완성하기 시작하면 중립 빨간색을 사용하여 난소39의각 절반의 히스토로지를 밀접하게 볼 수 있습니다. 이를 통해 절삭 기술이 향상됨에 따라 랜드마크를 개발할 수 있습니다. 또한,26, 27위에 명시된 바와 같이 균일한 두께(재료표참조)를 자를 수 있는 계측기를 사용할 수있다.
난소 피질 매체는 밝은 분홍색이어야 합니다. 우리는 난소 피질 배양 배지의 pH가 일부 동물에서 빠르게 변화하므로 난소 피질 배지의 대다수 (70 %)가 배양 건강을 증진하기 위해 24 시간마다 변경되어야한다는 것을 관찰했습니다. 이전 논문은 매체 의 절반을 변경 논의했다40. 현재 원고에서 대부분의 미디어를 변경하는 우리의 이유는 난소 피질 문화의 건강을 증진하기 위한 것이었습니다. 난소 피질 조각을 둘러싼 방울은 남아 있으며 문화에 중간 변화의 부정적인 영향은 없었다. 또한, 이것은 우리가 난소 미세 환경에 대한 통찰력을 생성하기 위해 각 동물에 대한 더 많은 호르몬, 사이토카인 및 화학을 분석 할 수 있었습니다.
이 조직 배양 프로토콜은 몇 가지 장점을 제공합니다. 난소 피질을 배양하면 모낭이 생체 내에서 와 유사한 환경에서 발전할 수 있습니다. 여포는 주변 기질과 체세포와 적수 세포 오푸스 사이의 통신에 의해 지원되고 계속된다. 배양 웰 인서트의 사용은 난소 피질이 침수되지 않고 배양 배지에 놓일 수 있게 하여 조직이 웰 플레이트의 플라스틱 베이스에 결합되는 것을 방지합니다. 또 다른 장점은 문화 창입니다. 프로토콜에 설명된 7일 배양 창은 대표적인 호르몬 및 성장 인자 데이터를 제공한다. 또한, 7일간의 문화16일후에 조기 단계의 여포(원시) 및 더 늦은 단계의 여포(secondary, antral)를 계산함에 따라, 여포 발생은 시험관 내 환경에서 계속 진행되고 있다. 이전 난소 조직 배양 프로토콜은 상대적으로 짧은(1-6 일7,32)또는 긴 (10-15 일5,6,10)배양 기간을 이용하였다. 더 짧은 배양 창 태아 소 난소 피질(41)에서원시 여포 활성화를 조사하는 데 사용되었습니다. 비인간 영장류에서는, 20일 의 배양 기간이 혈청 없는매체에서생존하고 시험관내 성장을 개시하기 위해 영장류 원시 여포의 능력을 평가하는 데 사용되었다. 그러나, 우리는 혈청 없는 매체에서 7 일 이상 난소 피질을 배양할 때 증가한 조직 분해를 관찰했습니다. 우리는 또한 스테로이드 농도 후 감소 매일 샘플의 분석에서 결정 했다 4 문화의 일 (데이터 표시 되지 않음). 더 긴 배양 창 은 난소 피질 배양에 오염의 가능성을 높일 수 있습니다. 따라서, 주요 효과는 7일간의문화15일까지 측정될 수 있으며, 문화의 시간은 동물 모델 및 과학적 질문에 의존할 수 있다.
이 소 난소 피질 프로토콜의 몇 가지 장점이 존재하지만, 몇 가지 제한이 있습니다. 한 가지 제한은 난소 피질 배양 중에 수집된 난소 피질 조직 및 배양 배지 량의 양입니다. 난소 피질 조각의 작은 크기는 염색 목적 (H&E, 면역 불경등)에 사용되는 조직 섹션의 제한된 수를 허용합니다. RT-PCR을 수행하려면 최소 4개의 피질 조각이16개가필요합니다. 더욱이, 수집된 배양 배지의 양이 적을수록 수행된 분석의 양이 제한될 수 있다. 이러한 한계에 대처하기 위해, 우리는 조직학, 분석 및 PCR에 대한 배양 배지 및 조직의 적절한 공급을 제공하기 위해 난소 당 여러 복제를 배양하는 것이 좋습니다. 종종 우리는 한 소/하이퍼에서 각 난소의 여러 조각을 배양하여 추가 분석을 위해 더 많은 조직을 확보하고 호르몬/사이토카인/케모킨의 피질 분비를 측정하기 위해 증가된 배양 배지를 얻습니다. Preantral 여포는 젊은 여성 (heifers)보다 더 오래된 암소 난소에서 더 확산됩니다. 따라서, 잠재적인 한계는 배양되는 모든 난소 피질 조각에 preantral 여포를 얻는 것입니다. 이 한계를 완화하는 몇몇 쪽은 각 동물에 대한 더 많은 난소 피질 조각을 얻고 각 동물에 대한 추가 우물을 문화하거나 여포를 시각화하고 모든 피질 조각이 초기 preantral 여포를 포함하는지 확인하기 위해 중립 적색을 사용하는 것입니다. 난소 피질 배양의 세 번째 제한은 배양 시스템의 오염으로 인해 미디어와 피질 조각을 분석할 수 없게 만든다는 것입니다. 따라서, 멸균 환경을 유지하는 여러 가지 방법은 배양에 사용되는 매체를 필터링하는 것입니다. 난소 피질 조각을 가공하고 절단하기 전에 깨끗한 벤치가 70 % 에탄올로 살균되었는지 확인하고, 공기 흐름은 해부 전에 적어도 30 분 동안 실행되었습니다. 또한 흡수 패드를 사용하여 쉽게 청소할 수있도록(그림 1)을사용하는 경우, 깨끗한 벤치에 조직을 배치하기 전에 30분 동안 UV 광이 켜져 있는지 확인하여 패드를 살균하고 깨끗한 벤치를 청소합니다. 마지막으로, 모든 미디어 변화는 적절한 공기 흐름, 멸균 기기 및 바펫 팁변경이 있는 생물안전 캐비닛에서 수행되어야 하며, 멸균 팁만 배지에 도입되어 난소 피질 배양을 위한 우물에 배치되어야 합니다.
이 기술의 적용은 난소 미세 환경을 이해하는 데 도움이 되며 변경된 여포 발달을 수반하는 여성 생식 장애와 관련된 메커니즘을 풀기 시작할 수 있습니다. 예를 들면, 다낭성 난소 증후군의 병인학 (PCOS) 및 조기 난소 실패의 양상 (POF)는 불분명한 남아 있습니다. 소는 단배기이기 때문에, 그밖 단간 배란 종 (예를 들면, 인간 및 비 인간 영장류)에 있는 여포 진행 및 체포에 영향을 미치는 요인을 이해하는 훌륭한 모형을 합니다. 더욱이, 이 난소 피질 배양 방법은 또한 여자에 있는 불모의 결과로 여포 매개 무질서를 향상할 수 있는 잠재적인 치료 시험을 위해 유익할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 ASC에 국립 식품 농업 연구소에 의해 지원 되었다 2013-67015-20965 ASC에, 건강 경쟁 보조금에 대 한 네브래스카 식품 대학. 미국 농무부 보조금 NEB26-202/W3112 가입 #1011127 ASC, 해치-NEB ANHL 가입 #1002234 ASC에. 양적 생명 과학 이니셔티브 여름 박사 후 학자 지원 – CMS에 대한 여름 자금에 대한 COVID-19 상.
저자는 로버트 쿠시먼 박사, 미국 육류 동물 연구 센터, 클레이 센터, NE박사에게 감사를 표하고 싶습니다 이전 출판물에서 난소를 제공 한 그에게 감사, 이는 다음이 기술을 검증하는 개념의 증거로 현재 논문에 사용된.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
References
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