Summary
Sığır yumurtalık korteksinin in vitro kültürü ve beslenme Merdiven adım diyetinin yumurtalık mikroçevrişi üzerindeki etkisi sunulmuştur. Yumurtalık korteks parçaları yedi gün boyunca kültürlendi ve steroidler, sitokinler ve folikül evreleri değerlendirildi. Merdiven-Adım diyet tedavisi, kültürde folikül ilerlemesine neden olan steroidogenezi artırmıştı.
Abstract
İlkel evreden antral evreye kadar folikül gelişimi, yumurtalık korteksi içinde somatik hücrelerden ve kümülüs hücre-oosit iletişiminden endokrin ve parakrin faktörleri içeren dinamik bir süreçtir. Yumurtalık mikroçevrişi ve çevredeki milieu üretilen sitokinler ve steroidler folikül ilerlemesini veya tutuklanmasını nasıl etkilediği hakkında çok az şey bilinmektedir. Yumurtalık korteksinin in vitro kültürü, foliküllerin bitişik stroma tarafından desteklenen normalleştirilmiş bir ortamda gelişmesini sağlar. Amacımız, sığır yumurtalık korteksinin in vitro kültürü ile beslenme Merdiven-Adım diyetinin yumurtalık mikroçevrişi (folikül gelişimi, steroid ve sitokin üretimi) üzerindeki etkisini belirlemekti. Bunu başarmak için, yumurtalık kortikal parçaları ergenlikten önce iki farklı besinsel olarak geliştirilmiş şemadan geçen düvelerden çıkarıldı: Kontrol (geleneksel beslenme gelişimi) ve Yaklaşık 0.5-1 mm3 parçaya kesilen Merdiven-Adım (gelişim sırasında beslenme ve kısıtlama). Bu parçalar daha sonra bir dizi yıkamadan geçirildi ve Waymouth'un kültür ortamını içeren bir kuyuya yerleştirilmiş bir doku kültürü kesici ucuna yerleştirildi. Yumurtalık korteksi günlük kültür medya değişiklikleri ile 7 gün boyunca kültürlendi. Ek tedavi olmaksızın beslenmenin etkilerini ve kültürün etkisini belirlemek için kültür öncesi ve sonrası folikül evre değişikliklerini belirlemek için histolojik kesitleme yapıldı. Korteks kültür ortamı steroidler, steroid metabolitler ve sitokinleri ölçmek için günlerce birikti. Yumurtalık mikroçevriminde artan steroid hormonları için eğilimler vardı, bu da Merdiven-Adım ve Kontrol yumurtalık korteks kültürlerinde folikül ilerlemesine izin sağladı. Yumurtalık korteks kültürü tekniği, yumurtalık mikroçevrinin daha iyi anlaşılmasını ve endokrin salgıdaki değişikliklerin hem in vivo hem de in vitro tedavilerden folikül ilerlemesini ve büyümesini nasıl etkileyebileceğini sağlar. Bu kültür yöntemi, doğurganlığı teşvik etmek için kadınlarda folikül ilerlemesini artırabilecek potansiyel terapötiklerin test edilmesi için de yararlı olabilir.
Introduction
Yumurtalık korteksi, folikül gelişiminin meydana geldiği yumurtalığın dış tabakasını temsil eder1. Başlangıçta geliştirme aşamasında tutuklanan ilkel foliküller, parakrin ve gonadotropin girişlerine dayanan birincil, ikincil ve daha sonra antral veya üçüncül foliküllerhalinegelecek şekilde etkinleştirilecektir 1,2,3,4. Yumurtalık içindeki fizyolojik süreçleri daha iyi anlamak için doku kültürü in vitro model olarak kullanılabilir, böylece kontrollü bir ortamın deneyler yapmasına izin verir. Birçok çalışma, yardımcı üreme teknolojisi, doğurganlık koruma ve yumurtalık kanseri5,6,7araştırmalarında yumurtalık doku kültürünü kullanmıştır. Yumurtalık doku kültürü, yumurtalık sağlığına ve Polikistik Over Sendromu (PKOS) 8,9,10,11gibi üreme bozukluklarının etiyolojisine zarar veren üreme toksinlerinin araştırılması için de bir model görevi görmüştür. Bu nedenle, bu kültür sistemi çok çeşitli uzmanlıklar için geçerlidir.
Kemirgenlerde, üreme biyolojisi deneylerinde tüm fetal veya perinatal gonadlar kullanılmıştır12,13,14,15. Bununla birlikte, daha büyük evcil hayvancılıktan gelen gonadlar, büyük boyutları ve potansiyel dejenerasyonları nedeniyle tüm organlar olarak kültürlenemez. Bu nedenle, sığır ve insan olmayan primat yumurtalık korteksi daha küçük parçalar halinde kesilir16,17,18. Birçok çalışma, evcil hayvancılıkta ve insan dışı primatlarda ilkel folikül başlatmada çeşitli büyüme faktörlerini (leri) incelemek için küçük yumurtalık korteks parçalarını kültüre 1,17,18,19. Yumurtalık korteks kültürünün kullanımı, 7 gün boyunca kültürlenen sığır ve primat kortikal parçalar için serum yokluğunda ilkel folikül inisiyonu göstermiştir20. Yang ve Fortune 2006 yılında fetal yumurtalık korteks kültür ortamını 10 gün boyunca bir dizi testosteron dozu ile tedavi etti ve testosteronun 10-7 M konsantrasyonunun folikül alımını, sağkalımını ve erken evre foliküllerin ilerlemesini artırdığını gözlemledi19. 2007 yılında, sığır fetüslerinden (5-8 aylık gebelik) yumurtalık korteks kültürlerini kullanan Yang ve Fortune, birincil ila ikincil folikül geçişinde Vasküler Endotel Büyüme Faktörü A (VEGFA) için bir rol bildirmektedir21. Ayrıca laboratuvarımız, VEGFA izoformlarının (anjiyojenik, antianjiyojenik ve bir kombinasyon) VEGFA'nın16'yabağladığı ana sinyal transdüksiyon reseptörü olan Kinaz etki alanı reseptörü (KDR) aracılığıyla farklı sinyal transdüksiyon yollarını nasıl düzenleyebileceğini göstermek için yumurtalık korteks kültürlerini kullanmıştır. Bu bilgiler, farklı VEGFA izoformlarının folikül ilerlemesini veya tutuklanmasını ortaya çıkarmak için sinyal yollarını nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılmasını sağladı. Birlikte ele alındığında, yumurtalık korteks parçalarının farklı steroidler veya büyüme faktörleri ile in vitro kültüring folikülogenezi düzenleyen mekanizmalar üzerindeki etkilerini belirlemek için değerli bir tahlil olabilir. Benzer şekilde, farklı beslenme rejimleri üzerinde geliştirilen hayvanlar, kadın üreme olgunluğunu etkileyen folikülogenezleri teşvik edebilecek veya inhibe edebilecek yumurtalık mikroçevranlıklarını değiştirmiş olabilir. Bu nedenle, mevcut elyazmasındaki amacımız sığır korteksi kültür tekniğini bildirmek ve daha önce açıklandığı gibi 13 aylıkken toplanan Kontrol veya Merdiven-Adım diyetlerinden beslenen düvelerden sığır korteksinin in vitro kültüründen sonra yumurtalık mikroçevrimlerinde farklılıklar olup olmadığınıbelirlemektir 16.
Bu nedenle, bir sonraki adımımız farklı beslenme diyetleri ile geliştirilen bu düvelerdeki yumurtalık mikroçevrini belirlemekti. Merdiven-Adım veya Kontrol diyeti ile beslenen düvelerden yumurtalık korteksini değerlendirdik. Kontrol düvelerine 84 gün boyunca 97,9 g/kg0,75 bakım diyeti önerildi. Merdiven-Adım diyeti, 84 gün boyunca 67.4 g / kg0.75 kısıtlı bir beslenme diyeti içeren 8 ayda başlatıldı. İlk 84 günden sonra, Control düveleri 97.9 g/kg0.75almaya devam ederken, Merdiven-Basamak sığır düvelerine 68 gün daha118.9 g/kg 0.75 teklif edildi, daha sonra kültür öncesi ve sonrası foliküler evrelerde ve morfolojide yapılan değişiklikleri inceledikleri için13 aylıkken ovaerektomi yapıldılar. Biz de steroidler, steroid metabolitler, kemokinler ve korteks medya içine salgılanan sitokinler farklılıklar için test. Steroidler ve diğer metabolitler, in vivo ve/veya in vitro olarak yapılan tedavilerden doku canlılığı ve üretkenliği üzerinde doğrudan bir etki olup olmadığını belirlemek için ölçüldü. Kültürden önce ve sonra yumurtalık mikroçevrinde meydana gelen değişiklikler, kültürden önce endokrin milieu ve folikülogenezin bir anlık görüntüsünü ve kültür sırasında kültür veya tedavinin folikül ilerlemesini veya tutuklanmasını nasıl etkilediğini sağladı.
Yumurtalıklar,16yaşında 13 aylık Kontrol ve Merdiven-Basamak düvelerinden IACUC prosedürlerine göre ABD Et Hayvanları Araştırma Merkezi'nde (USMARC) yumurtalıklar yapıldıktan sonra toplandı , kan ve diğer kirleticileri çıkarmak için steril fosfat tampon salin (PBS) ile% 0.1 antibiyotikle temizlendi, fazla doku kesilmiş ve 37°C23'te Nebraska-Lincoln Üniversitesi (UNL) Üreme Fizyolojisi laboratuvarı UNL'ye nakledildi. . UNL'de yumurtalık korteks parçaları küçük kare parçalar halinde kesildi (~0.5-1 mm3; Şekil 1) ve 7 gün kültürlü (Şekil 2). Histoloji, folikül evreleri16,24 (Şekil 3 ve Şekil4 ) ve fibrozis gösterebilecek hücre dışı matris proteinlerini belirlemek için kültürden önce ve sonra korteks kültürü slaytları üzerinde yürütülmüştür (Picro-Sirus Red, PSR; Şekil 5). Bu, in vivo beslenme rejimlerinin folikül evreleri üzerindeki etkisinin belirlenmesine izin verdi ve folikül evreleri ve folikül ilerlemesi üzerinde 7 günlük yumurtalık korteksinin karşılaştırılmasına izin verdi. Kültür boyunca, ortam günlük olarak toplandı ve değiştirildi (her gün medyanın yaklaşık% 70'i toplandı; 250 μL / kuyu) böylece günlük hormonlar / sitokinler / kemokinler günlük olarak değerlendirilebilir veya ortalama konsantrasyonlar elde etmek için gün içinde birikebilir. Androstenedione (A4) ve östrojen (E2) gibi steroidler 3 gün boyunca birikebilir ve radyoimmunoassay (RIA; Şekil 6) ve hayvan başına 4 günden fazla havuzlanmış ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (HPLC-MS)24,25 (Tablo 1)ile test edilir. Sitokin dizileri yumurtalık korteks kültürüortamında sitokin ve kemokin konsantrasyonlarını değerlendirmek için kullanılmıştır (Tablo 2). Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) test plakaları, daha önce gösterildiği gibi belirli sinyal iletim yolları için gen ekspresyonlarını belirlemek için yapılmıştır16. Tüm steroid, sitokin, folikül evresi ve histolojik belirteçler yumurtalık mikroçevroronment bir anlık sağlar ve bu mikroçevrenim "normal" veya "anormal" folikülogenez teşvik yeteneği hakkında ipuçları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yumurtalıklar ABD Et Hayvanları Araştırma Merkezi16.'dan alınmıştır. Daha önce belirtildiği gibi16, tüm prosedürler ABD Et Hayvanları Araştırma Merkezi (USMARC) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından Tarımsal Hayvanların Tarımsal Araştırma ve Öğretimde Bakımı ve Kullanımı kılavuzuna uygun olarak onaylanmıştır. Yumurtalıklar, işlendikleri ve kültürlendikleri Nebraska-Lincoln Üniversitesi Üreme Laboratuvarı'na getirildi.
1. Gerekli ortamın hazırlanması
-
Waymouth MB 752/1 orta
- 1 L doku kültürü şişesi 900 mL steril su ile doldurun. Su bir karıştırma plakası üzerinde hafifçe karıştırırken, yavaş yavaş toz ortamı ekleyin. Toz ortam çözüldükten sonra, 2,24 g sodyum bikarbonat ve ardından 1,25 g sığır serumu albümini (BSA) ekleyin. Bir pH ölçer kullanın ve pH'ı 7,25-7,35 olarak ayarlayın. Son hacmi 1 L'ye çıkarmak için ek steril su ekleyin.
- Biyolojik bir güvenlik kabinine geçin ve ortamın% 0.1 v / v konsantrasyonda penisilin-streptomisin sülfat ekleyin. Ortamı 0,22 μm gözenekli 33,2 cm2 500 mL şişe üst filtresi ile filtreleyin.
- Filtrelenmiş ortamı birkaç 50 mL konik tüpe dökün. 50 mL aliquoted ortam başına 0,5 mL İnsülin-Transferrin-Selenyum ekleyin.
- Konik tüpleri ve ortamın stok şişesini alüminyum folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın. Bu ortam ışığa duyarlıdır.
NOT: Waymouth ortamı 1 aya kadar saklanabilir.
-
Leibovitz'in L-15 (LB-15) ortamı
NOT: LB-15 ortamı kültüre hazırlık için dokuyu temizlemek için kullanılır.- 1 L doku kültürü şişesi 900 mL steril su ile doldurun. Steril su bir karıştırma plakası üzerinde hafifçe karıştırılırken, hazırlanan toz ortamı yavaş yavaş ekleyin. Bir pH ölçer kullanın ve pH'ı 7,25-7,35 olarak ayarlayın. Son hacmi 1 L'ye çıkarmak için ek steril su ekleyin.
- Biyolojik güvenlik kabinine geçin. %0,1 antibiyotik ile 1 L LB-15 yapın (bkz. Malzeme Tablosu). Ortamı 0,22 μm gözenek 33,2cm 2 500 mL şişe üst filtresi kullanarak iki adet 500 mL doku kültürü şişesine filtreleyin. LB-15 ortamı ışığa duyarlı olduğu için şişeleri alüminyum folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın.
NOT: LB-15 ortamı 1 aya kadar saklanabilir.
-
Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS)
- Laboratuvarda PBS yapın veya kalsiyum veya magnezyum olmadan steril PBS satın alın(Malzeme Masası). Laboratuvarda PBS yapmak için, 800 mL damıtılmış su ile başlayın ve içine 8 g sodyum klorür (NaCl) ekleyin. Ardından, 0,2 g potasyum klorür (KCl), 1,44 g sodyum fosfat dibasik (Na2HPO4)ve 0,24 g potasyum fosfat dibasik (KH2PO4)ekleyin. pH'ı ~7,4 olarak ayarlayın ve toplam hacmi 1 L'ye ayarlayın.
- Biyolojik güvenlik kabinindeyken % 0,1 antibiyotikle 1 L PBS yapın (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Yumurtalık kortikal kültür protokolü
NOT: Yumurtalıklar 13 aylıkken ilkbaharda doğan USMARC düvelerinden elde edilmiştir. Yumurtalıklar iyice durulandı ve tüm kan ve diğer sıvılar antibiyotik içeren PBS (%0.1) ile çıkarıldı ve 37 °C23'te Nebraska-Lincoln Üniversitesi Üreme Laboratuvarı UNL'ye (1.5 saat uzaklıkta) taşındı. (Taşıma sırasında yumurtalıkların sıcaklığı hakkında yorum için lütfen Tartışma'yabakın)
- Yumurtalık dokusunu temiz bir tezgahta hazırlayın (Şekil 1).
- Temiz bankı% 70 etanol ile dezenfekte edin. Tezgah üstüne taze emici bir ped yerleştirin. Emici ped de dahil olmak üzere temiz tezgahtaki herhangi bir şeyi sterilize etmek ve uygun KKD'nin kullanıldığından emin olmak için temiz tezgah üfleyicinin diseksiyondan yarım saat önce UV ışığı ile birlikte açıldığından emin olun.
- Petri tabaklarını (60 x 15 mm) doku yıkamaları için düzenleyin. PBS yıkama için üç Petri kabı, antibiyotikli PBS için üç ve LB-15 yıkamalar için üç Petri kabı gereklidir. Yıkamadan sonra parçaların son yerleşimi için ek bir LB-15 içeren petri kabı ve beraberindeki kapak kullanılacaktır.
- Her Petri kabına PBS veya LB-15 olmak üzere yaklaşık 10 mL uygun sıvı doldurun.
Şekil 1:Yumurtalıkve korteks parçalarının temiz tezgahta yıkanması için plakaların düzeni. (A) Korteksin bölümleri olarak yumurtalığın yıkanmasında kullanılan PBS çıkarılır. (B) KORTEKs parçalarının taşındığını antibiyotikli yıkamalar ile PBS. (C) Yumurtalık korteks parçaları LB-15'te son yıkama için biyogüvenlik kabinine geçmeden önce LB-15'te dört kez yıkanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Hazırlanan Waymouth ve LB-15 ortamını buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına ısıtın.
- Kullanmadan önce sterilizasyonu sağlamak için tüm araçları otoklavlayın.
- Yumurtalık korteksi toplanmaya hazır olana kadar yumurtalıkları 37 °C'de koruyun.
- Tırtıklı çeneli tokalar kullanarak yumurtalığı alın ve ilk PBS dolu Petri kabında iyice yıkayın. Yumurtalığı ikinci PBS yıkamaya aktarın ve bir kez daha iyice temizleyin.
NOT: Yumurtalık kortikal şeritler çıkarılırken yumurtalık ikinci PBS yıkamada kalacaktır. - Tırtıklı çene toksları kullanarak yumurtalığı sabitleyin ve ikiye bölün. Şu anda, yumurtalık korteksi medulladan kesilecektir. Bir cetvel kullanarak, yumurtalık yüzeyinin en fazla 1-2 mm derinliğinin medulla16'danuzaklaştırıldığından emin olun. Yumurtalık korteksinin enine bölümlerini medulladan çıkarın, 3-4 ince yumurtalık korteksi şeridini (Şekil 2) neşterle (#11 neşter bıçağı; #3 tutamak) kesin ve şeritleri üçüncü PBS dolu Petri kabına yerleştirin.
NOT: Şu anda, RNA ekstraksiyonu için ek yumurtalık kortikal dokusu toplanabilir veya kültürsüz ilk korteks parçalarının histolojisi için sabitlenebilir ve toplanabilir. Yumurtalık korteks şeritlerini çıkarırken, görünür antral foliküller veya corpora lutea içeren alanlardan kaçının. Ek olarak, medüller doku toplamaktan kaçının. Medulla histolojisi daha önce gösterildiği gibi çok farklıdır16. Yumurtalık korteksi 1-2 mm'den fazla derinliğe kesilmezse, medulla elde edilmelidir. Farklı histoloji korteks ve medulla arasındaki yer işaretlerine izin verir. - Üçüncü PBS yıkamadaki yumurtalık korteks şeritlerini 21 numaralı neşter bıçağıyla küçük, kare parçalara(~0,5–1 mm 3)kesin. Tutarlı yumurtalık korteks parçaları yapmak için parçaların benzer boyut ve kalınlıklarda olduğundan emin olmak için Petri tabaklarının altında bir cetvel kullanın. Parçaları neşterle keserken şeritleri sabitlemek için önseçim kullanın.
NOT: Kesilen doku parçalarının sayısı deneye bağlıdır. Dört parça yumurtalık korteksi kültür için gerekli minimum doku miktarıdır. Uygun uzunluk ve derinliği sağlamak için diğer yöntemler arasında şablon olarak özel dilimleyiciler26 veya önceden kesilmiş plastik parçaların kullanılması27. - Yumurtalık kortikal parçalarını antibiyotik dolu Petri kapları ile üç PBS'de de yıkayın. Parçaları yıkamalar arasında taşımak için kavisli bir uçlu toka kullanın.
- Korteks parçalarını LB-15 yıkama serisinde hareket ettirin ve son LB-15 dolu Petri kabına yerleştirin. Kapağı hayvan kimliği ve yumurtalık tarafı (sol veya sağ) ile etiketleyin.
NOT: Kapsamlı temizlik için yumurtalık korteks parçalarını her yıkamaya tamamen batırın. - Yumurtalık başına dört yumurtalık korteks parçası toplayın ve sıfırıncı gün histolojisi için sabitleyin. Ek parçalar da RNA için flaş dondurulabilir. Kalan doku parçaları kültür için kullanılacaktır. Her doku toplama işleminden sonra kesme aletlerini % 70 etanol ile silin.
- Son doku yıkama ve kültür hazırlığı için biyolojik bir güvenlik kabini hazırlayın. Biyolojik güvenlik kabinine yerleştirmeden önce malzemeleri% 70 etanol ile sterilize edin. Biyolojik güvenlik kabininde çalışırken aseptik tekniği kullanın.
- Kültüre yönelik tüm yumurtalık korteksini biyolojik güvenlik kabinine taşıyın ve LB-15 dolu petri kabında bir kez daha yıkayın.
- 24 kuyulu doku kültürü plakasında pipet kuyu başına 350 μL Waymouth orta.
- Kaplamasız kültürü, kümes uçlarını kullanarak her kuyuya iyi ekler yerleştirin. Dokunun kurumasını sağlayacağından kesici ucun tabanının altında kabarcık oluşmamasını sağlayın. Ortamın emilmesini ve yumurtalık korteks parçalarını çevrelemesi için ortamın kesici uçlara dokunması gerekir.
- Dört yumurtalık korteks parçasını her kesici ucun örgüsüne dikkatlice yerleştirin (Şekil 2). Doku parçaları hassas bir şekilde yerleştirilmezse, kümesler ağı delebilir. Doku parçaları birbirine veya kesici ucun yanına değmemelidir.
- Dokuyu % 5 CO216ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Diğerleri 38.8 °C28kullanmıştır. Bununla birlikte, dokunun bütünlüğünde veya foliküllerin 37 °C dokuda ilerleme yeteneğinde veya diğerlerinde39,30. Bu nedenle, bu noktada bu sıcaklıklardan herhangi biri başarıyı denemek için elverişli olmalıdır. Diğerleri 400 μL orta kullandı. Her iki miktar da tutarlı olduğu sürece iyidir ve doku kısmen batırılır ve yeterli yüzey geriliminin dokunun nemlendirilmesine izin vermesine izin verir (yumurtalık korteks parçalarını çevreleyen ortam). Diğer kuyulardan buharlaşmayı azaltmaya yardımcı olmak için boş kuyuları 500 μL steril su ile doldurun.
Şekil 2: Yumurtalık korteks parçaları ve kültür plakası. (A) Yumurtalığın korteksinden kesilen bir yumurtalık şeridi. (B) Cetvel ve korteks parçası yan yana gösterilmiştir. (C) Plakadaki kültür ortamında kesici ucun üzerinde dinlenmiş dört korteks parçası(~0,5-1 mm 3). (D) Kültür ortamını kuyudan toplamak için kesici ucun kaldırılması. Uygun pH'ı korumak için tüm kültür ortamını günlük (250 μL) toplayın ve değiştirin.Her kuyudan her gün yaklaşık 250 μL elde edilir (ilk kültür ortamının yaklaşık% 70'i). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Medya koleksiyonu
- Yumurtalık korteks kültürünü 7 gün boyunca her gün orta olarak değiştirin. Orta değişiklikler, ortadaki büyük pH ve renk değişikliklerini önlemek için mümkün olduğunca 24 saate yakın olmalıdır. Orta değişimden önce Sıcak Waymouth orta ila 37 °C. Her kuyudan her gün yaklaşık 250 μL elde edilir (ilk kültür ortamının yaklaşık% 70'i).
- Orta değişiklikler sırasında, kesici ucu kuyudan hafifçe çıkarmak için uzun uçları kullanın. Kültürlü Waymouth ortamını 0,5 mL tüplerde (yaklaşık 250 μL / gün) toplayın. Kesici ucu iyi bir şekilde yerleştirin ve ortamı kesici ucun yan tarafı ile kuyu arasına dağıtarak 350 μL taze kültür ortamı ekleyin.
NOT: Yumurtalık mikroçevrimini belirlemek için gerekli tüm steroidleri, sitokinleri ve kemokinleri ölçmek için yeterli medya elde etmek için medyanın çoğunu günlük olarak değiştirin. Ayrıca, günlük orta değişiklikler, ortamdaki büyük pH değişikliklerini (renk değişimi ile gösterilir) önlemek için önemlidir. Parçaların ıslak kalmasını sağlamak için yumurtalık korteks parçalarını çevreleyen orta damlalar tutuldu. Ortamın %70'inin değişmesi nedeniyle kültürlü dokuda herhangi bir sorun gözlenmedi. - Toplanan ortamı doku kültüründen -20 °C'de saklayın.
4. Görüntüleme ve aşağı akış işleme
- 37 °C'de % 5 CO2ile 7 günlük kültürden sonra, yumurtalık korteks parçalarını ekli bir kamera ve bir bilgisayar görüntüleme yazılımı programı ile diseksiyon mikroskobu kullanarak görüntüleyin.
NOT: Karanlık bir oda genellikle görüntüleme için en iyi görüntü kalitesini elde etmek için en iyisidir. - Görüntülemeden sonra, histoloji için Bouins'te kuyu başına iki yumurtalık korteks parçasını sabitleyin ve cDNA için RNA elde etmek için sıvı nitrojende iki yumurtalık korteksi parçasını flaş dondurun. Doku ile tüm kuyular için bu adımı tekrarlayın. Ortamı 7 günden itibaren toplayın ve -20 °C'de saklayın.
- Yumurtalık korteks parçalarının bouins'e (picrik asit 750 mL, buzul asetik asit 50 mL ve% 37-% 40 formalin 250 mL) üç kez% 70 etanol ile yıkanmadan önce yaklaşık 1,5 saat boyunca daldırmalarına izin verin. Doku% 70 etanolde kalacak ve çözelti artık sarı olmayana kadar günlük olarak temizlenecektir.
NOT: Bouins dışındaki fiksatifler ve paraformaldehit kullanılabilir. Bu deneyimde Bouins, optimal morfolojiyi elde etmek için fiksatif olduğu için kullanılır. Diğer analizler için daha fazla doku gerekiyorsa, her hayvandan ek medya kuyuları ve yumurtalık korteks parçaları elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu sığır korteksi kültürü prosedürü, yumurtalığın küçük parçalarından çok çeşitli hormon, sitokin ve histoloji verilerini belirlemek için kullanılabilir. Hematoksilin ve eozin (H&E) gibi boyama, folikül evreleme yoluyla yumurtalık morfolojisini belirlemek için kullanılabilir16,23,31 (Şekil 3). Kısaca, foliküller, granüloza öncesi hücrelerin tek bir tabakası ile çevrili bir oosit olan ilkel olarak sınıflandırılmıştır (0); çoğunlukla skuamöz pre-granüloza hücreleri ve bazı küboidal granüloza hücreleri ile çevrili bir oosit olan geçiş folikül veya erken primer (1); 1-1,5 kat küboidal granüloza hücre ile çevrili bir oosit olan birincil folikül (2); iki veya daha fazla küboidal granüloza hücre ile çevrili bir oosit olan ikincil folikül (3); çapı 1 mm'den büyük olmayan ve belirgin bir anrum içeren iki veya daha fazla granüloza hücresi tabakası ile çevrili olan antral folikül (4)16,23 (Şekil 3). Folikül evrelemesi folikülogenez değerlendirmek için kültürden önce ve sonra sabitlenen yumurtalık korteksi üzerinde yapılabilir (Şekil 4). H&E ile boyanmış üç farklı slayttan slayt başına üç resim çektik. Daha sonra, foliküller üç kişi tarafından sahnelendi ve sayıldı ve her aşamada folikül sayısını belirlemek için ortalama16,23. 400x büyütmede bir görüntü için görüş alanının alanı (slayt başına üç) 0,4 mm2'dir. Böylece folikül evrelerini belirlemek için yumurtalık korteks parçalarının alanının %30'unun sayımı yapıldı. İlk folikülsayısı (kültürden önce) (Şekil 4A) kültürden sonra sayılan folikülleri normalleştirmek için kullanılır (Şekil 4B).
Ek olarak, kollajen birikimi ile belirlenen morfoloji farklılıkları (Picro Sirus Kırmızı boyama) Merdiven Basamağı veya Kontrol düvelerinden yumurtalık korteksinde fibrozis gösterebilir(Şekil 5). Kültür ortamının günlük toplanması, RIA tarafından çeşitli steroid hormonu üretimini değerlendirmek için 3 gün boyunca birikebilir (hayvan başına 200 μL orta örnek kullanılarak); Şekil 6) veya yüksek performanslı sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanarak steroid metabolitleri (HPLC-MS; hayvan başına 4 gün boyunca havuzlanmış 220 μL orta örnek); Tablo 1) ve sitokin üretimi (Tablo 2). Bu nedenle, istenen tüm tahlilleri yapmak için yeterli korteks ortamını sağlamak için bir hayvanın birkaç çoğaltılması gerekebilir.
Merdiven-Adım düveleri kültürün başlangıcında ilkel folikülleri arttığı için, bunların kültürde ilerlemesini ve sonuçlarda gözlemlediğimiz daha fazla sayıda ikincil folikül elde etmesini bekliyorduk. Ayrıca, ikincil foliküllerde artış nedeniyle, steroid daha fazla konsantrasyonları bekleriz. Androjenlerde, glukokortikoid metabolitlerde ve progesteron metabolitlerinde artış eğilimi gördük, bu da mevcut el yazmasında bunu destekleyecektir. Laboratuvarımız ayrıca farklı VEGFA izoformlarının KDR'deki farklı sinyal transdüksiyon moleküllerinin folikül ilerlemesi, steroidogenez ve aktivasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmektedir (Vasküler Endotel Büyüme Faktörü Reseptörü 2 olarak da bilinir; VEGFR2) sinyal transdüksiyon dizisi plakalarını kullanarak16. Hayvan varyasyonlarını azaltmak için, tedavi başına 4-6 hayvan kullanıyoruz ve güç analizine ve değişkenliğe bağlı olarak diğer deneyler için 11 kadar kullandık.
Sığır yumurtalık korteks kültüründen elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliği en çok yumurtalık korteks parçalarının kirlenmesinden etkilenir. Ayrıca, ortam 24-h süresi içinde düzenli olarak değiştirilmezse negatif veya subpar sonuçları oluşabilir. Başlangıçta eklendiğinde ortam pembe renktedir, ancak ortam toplandığında ve renk turuncu veya parlak sarı gibi göründüğünde, bu pH'da dokuya zarar verebilecek bir değişikliğe işaret edebilir. Ayrıca, çok büyük kesilen doku parçaları, histoloji için doku kesitine kadar gözlenmeyecek şekilde ortada dejenerasyon gelişebilir. Bu dejenerasyon, analiz için dokunun kullanımını sınırlayacaktır. Bu makalede sunulan veriler, istatistiksel bir yazılım programında nonparametrik testler ve genel doğrusal model analizi kullanılarak analiz edilmiştir. Kültürden önce ve sonra bölüm başına ilkel, birincil, ikincil ve antral foliküllerin sayısı genelleştirilmiş doğrusal karma model kullanılarak analiz edilmiştir. Önem P < 0.05'te belirlendi ve 0.14'te P ≥ 0.05'≤ bir eğilim bildirildi.
Şekil 3: Yumurtalık korteksinin folikül evrelemesi için hematoksilin ve Eosin lekelenmesi. Foliküllerin farklı aşamaları oklarla gösterilir. (A) İlkel foliküller (aşama 0); (B) Erken primer foliküller (evre 1); (C) Birincil foliküller (aşama 2); (D) İkincil folikül (aşama 3); (E) Antral folikül (evre 4). 400x büyütmede bir görüntü için görüş alanının alanı 0,4 mm2'dir. Folikül evrelerini belirlemek için yumurtalık korteks parçalarının alanının % 30'unu sayıyoruz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Control (n=6) ve Merdiven-Basamak (n=6) düvelerinde farklı folikül aşamalarındaki ortalama folikül sayısı. (A) Kültürden önce İlkel P = 0.001, Erken Birincil P = 0.12, Birincil P = 0.31, İkincil P = 0.22. (B) 7 günlük kültürden sonra, İlkel P = 0,37, Erken Birincil P = 0,84, Birincil P = 0,69, İkincil P = 0,02. Hata çubukları SEM'i temsil ediyor.
Şekil 5: Kollajen (Picro Sirius Kırmızı; PSR) yumurtalık korteksinde lekeleme. PSR in (A) 0 ve 7. (B) Kontrol (n = 4) ve Merdiven-Adım (n = 4) düveleri arasında yumurtalık korteks alanı başına ORTALAMA PSR pozitif boyama alanını (piksel/μm2) karşılaştıran grafik. Hata çubukları SEM'i temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: A4 ve E2 konsantrasyonları. (A) A4 konsantrasyonu ve (B) E2 konsantrasyonu, RIA'lar tarafından ölçülen Kontrol ve Merdiven Adım düvelerinin yumurtalık korteks ortamlarında 3 günlük kültür üzerinde bir araya geldi. n = Her grup için 4. Hata çubukları SEM'i temsil ediyor.
| Hormon | Kontrol | Merdiven Adımı | P-Değeri | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| ng/mL | Demek | SEM ± | Demek | SEM ± | ||
| DOKTOR | 0.33 | 0.28 | 0.72 | 0.48 | 0.15 | |
| HAN | 0.61 | 0.60 | 4.93 | 3.99 | 0.08 | |
| CORT | 0.003 | 0.003 | 0.01 | 0.01 | 0.85 | |
| 17OHP | 0.59 | 0.53 | 1.88 | 0.99 | 0.08 | |
| A4 | 1.46 | 1.43 | 5.74 | 3.27 | 0.08 | |
| BİR | 0.15 | 0.09 | 0.54 | 0.32 | 0.08 | |
| DHEAS | 4.50 | 2.60 | 7.59 | 0.85 | 0.56 | |
| E2 | 0.05 | 0.05 | 0.13 | 0.08 | 0.32 | |
| P4 | 5.05 | 2.78 | 6.52 | 1.66 | 0.39 | |
| T | 0.33 | 0.33 | 1.33 | 0.96 | 0.14 | |
| DHT | 0.07 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.09 | |
| DOC - 11-Deoksikorticosteron, INN - 11-Deoxycortisol, CORT – Kortikosteron, 17OHP – 17-Hydroxyprogesterone, A4- Androstenedione, AN – Androsterone, DHEAS – dehidroepiandrosteron sülfat, E2 - Estradiol, P4 – Progesteron, T – Testosteron, DHT – Dihydrotestosterone | ||||||
Tablo 1: Steroid ve steroid metabolitler yumurtalık korteks kültür ortamında ölçülen her hayvan için bir kuyudan kültür 4 gün boyunca havuza. Ortalama SEM. Blue ± sunulan veriler P < 0.1'i gösterir ve farklı olma eğilimine sahiptir.
| Sitokinler | Kontrol | Merdiven Adımı | P-Değeri | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| pg/mL | Demek | SEM ± | Demek | SEM ± | ||
| ANG1 | 27.29 | 11.71 | 63.66 | 25.06 | 0.39 | |
| CD40L | 4527.01 | 2986.34 | 3537.59 | 3537.59 | 0.74 | |
| DCN | 1307.68 | 320.87 | 996.54 | 282.96 | 0.77 | |
| INFβ | 0.36 | 0.36 | 0.002 | 0.002 | 0.85 | |
| IL18 | 0.00 | 0.00 | 1832.89 | 1265.33 | 0.13 | |
| LIF | 97.45 | 88.12 | 337.58 | 231.25 | 0.54 | |
| RANTES | 698.06 | 322.59 | 1254.13 | 811.19 | 0.56 | |
| INFφ | 4.49 | 1.37 | 3.68 | 0.65 | 0.77 | |
| IL13 | 501.21 | 285.07 | 810.81 | 159.67 | 0.25 | |
| IL21 | 24.38 | 9.51 | 18.52 | 6.17 | 0.56 | |
| IL1F5 | 5.07 | 3.85 | 5.40 | 1.70 | 0.56 | |
| TNFα | 61.45 | 35.00 | 44.91 | 13.41 | 0.77 | |
| ANG1 – Anjiyopoietin 1, CD40L – CD40 Ligand, DCN – Dekorin, IFNβ – Interferon Beta 1, IL18 – Interlökin-18, LIF – Lösemi inhibitör fabrikası, RANTES – Aktivasyon üzerine düzenlenmiş, Normal T Hücresi Eksprese edilmiş ve Salgılanmış, IFNφ – Interferon Gama, IL13 – Interlökin 13, IL21 – Interlökin 21, IL1F5 – Interlökin 1 aile üyesi 5, TNFα – Tümör Nekroz Faktörü alfa | ||||||
Tablo 2: Yumurtalık korteks kültürü ortamında ölçülen sitokin ve kemokinler, 4 günlük kültür boyunca havuza alınan her hayvan için bir kuyudan ölçülür. Ortalama ± SEM ile sunulan veriler. Mavi P < 0.1-0.14'e işaret eder ve farklı olma eğilimi gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda açıklandığı gibi in vitro over korteks kültürünün faydası, foliküllerin folikülleri çevreleyen bitişik stroma ile normalleştirilmiş bir ortamda gelişmesidir. Somatik hücreler ve oosit bozulmadan kalır ve in vivo model olarak uygun hücreden hücreye iletişim vardır. Laboratuvarımız, 7 günlük bir kültür sisteminin yumurtalık korteksinin tedavisi için temsili folikülogenez ve steroidogenez verileri sağladığını tespit etti. Diğer yumurtalık doku kültürü protokolleri ya nispeten kısa kültür dönemlerine sahiptir 1-6 gün7,32 veya uzun kültür süreleri 10-15 gün5,6,10. Bununla birlikte, 7 günden fazla kültlemenin doku bozulmasına, steroidogenezi azaltmasına ve potansiyel olarak kontaminasyon olasılığının artmasına yol açtığını gözlemledik (veriler gösterilmedi). Yumurtalık kortektomisini takiben kültleme, aynı zamanda belirli bir hayvandaki yumurtalık mikroçevrişimi hakkında doğrudan fikir sağlar. Sütten kesilen ve düvelerde ergenliğe yol açan beslenme rejimleri uygulandıktan sonra foliküler gelişimde değişiklikler tespit ettiğimiz için bu araştırma laboratuvarımızın ilgisini çekmektedir16.
İlkel evreden antral evreye kadar folikül gelişimi, yumurtalık korteksi içinde somatik hücrelerden endokrin ve parakrin faktörleri ve kümülüs hücre-oosit iletişimini içeren dinamik bir süreçtir33. Yumurtalık korteks kültürü gibi doku kültürü, bu faktörlerin mekanistik rolünü ve yumurtalık mikroçevrimindeki endokrin milieu araştırmak için kontrollü bir ortam sunar. Yumurtalıklar in vivo tedaviden geçmiş veya folikül ilerlemesi üzerindeki etkilerini belirlemek için genetik olarak değiştirilmiş hayvanlardan toplanabilir.
Yumurtalıklar ayrıca lokal bir medytoirden (1 saat uzaklıkta) toplanabilir ve 37 °C'de antibiyotikli PBS içeren bir termosta taşınabilir. Taşıma daha uzunsa (örneğin, bir gecede), yumurtalıklar buz üzerinde sevk edilir veya taşınır22. Yumurtalıkların taşınmasının bir gecede buz üzerinde mi yoksa bir termosta kısa süreli taşıma ile 37 °C'de mi gerçekleştiği benzer sonuçlar gözlenmiştir. Termos taşımalı 37 °C, in vitro olgunlaşma (IVM) veya in vitro fertilizasyon (IVF)34için bu dokudan oositlerin toplanmasına izin verir. Diğer çalışmalar, 2-8 ° C arasındaki sıcaklıklarda doku taşımanın üreme dokularında doğurganlığın korunması için de kullanıldığını bulmuşlardır35,36,37. Yine de diğer çalışmalar 34-37 ° C'de ve buz üzerinde taşınan yumurtalıkları kullanmıştır ve sığır doku kültüründe farklılıklargözlemlememiştir 38.
Yumurtalık korteksi kültür dokusu kültürden sonra sağlıklı görünmüyorsa, bunun nedeni yumurtalık korteksi parçalarının çok büyük olması olabilir. Protokolde kritik bir adım, yumurtalık korteks parçalarının 0,5-1 mm3'tenbüyük olmadığından emin olmaktır. Parçaları ölçmek için bir cetvel kullanıyoruz ve yumurtalık korteks parçalarının boyutunu belirlemek için diseksiyon mikroskobu içinde bir ölçek kullanıyoruz (Şekil 2C). Diğerleri, sırasıyla26,tekdüze kalınlık ve uzunluk / genişlik için belirli ekipman kullanır (bkz. Malzeme Tablosu). Bu ekipman parçaları mevcut değilse, plastik kareler tek tip kalınlık elde etmek ve benzer boyut parçalarını sağlamak için şablon olarak kullanılabilir27.
Sadece korteksten gelen ve yumurtalığı yıkadıktan sonra medulla olmayan parçaların kesilmesini sağlamak için 60 mm'lik kaba yerleştirip ikiye böleceğiz. Korteks ve medulla daha önce Abedal-Majed, 202016'dagörüldüğü gibi histolojik olarak çok farklıdır. Yumurtalığın her yarısı, yumurtalıktan sadece korteksin çıkarılmasını ve medullanın kalmasını sağlamak için bıçak ile filetolanır. Bireyler bu kesme tekniğini mükemmelleştirmeye yeni başlıyorlarsa, yumurtalığın her yarısının histolojisini yakından görmek için nötr kırmızı da kullanabilirler39. Bu, kesme teknikleri geliştikçe yer işaretlerinin geliştirilmesine izin verecektir. Ayrıca, yukarıda belirtildiği gibi düzgün kalınlığı kesebilen aletler kullanabilirler (bkz. Malzeme Tablosu)26,27.
Yumurtalık korteks ortamı açık pembe olmalıdır. Yumurtalık korteks kültürünün pH'ının bazı hayvanlarda hızlı bir şekilde değiştiğini gözlemledik, bu nedenle kültür sağlığını teşvik etmek için yumurtalık korteks ortamının çoğunluğu (%70) her 24 saat değiştirilmelidir. Önceki makalelerde orta günlük40'ınyarısının değiştirilmesi tartışıldı. Mevcut makaledeki medyanın çoğunluğunu değiştirme nedenimiz yumurtalık korteks kültürlerinin sağlığını teşvik etmekti. Yumurtalık korteks parçalarını çevreleyen damlalar kalır ve orta değişimin kültür üzerinde olumsuz bir etkisi yoktur. Ayrıca, bu, yumurtalık mikroçevrim hakkında fikir üretmek için her hayvan için daha fazla hormon, sitokin ve kemokin analiz etmemizi sağladı.
Bu doku kültürü protokolü çeşitli avantajlar sunar. Kültleme yumurtalık korteksi, foliküllerin in vivoya benzer bir ortamda gelişmesini sağlar. Foliküller çevredeki stroma tarafından desteklenmeye devam eder ve somatik hücreler ile kümülüs hücre-oosit arasındaki iletişim devam eder. Kültür kuyu kesici uçlarının kullanımı, yumurtalık korteksinin suya batırılmadan kültür ortamına dayanmasını sağlar, böylece dokunun kuyu plakasının plastik tabanına bağlanmasını önler. Diğer bir avantaj kültür penceresidir. Protokolde açıklanan 7 günlük kültür penceresi temsili hormon ve büyüme faktörü verileri sağlar. Ek olarak, folikülogenez, 7 günlük kültürden sonra daha az erken sahnelenmiş folikül (ilkel) ve daha geç sahnelenmiş foliküller (ikincil, antral) saydığımız için bu in vitro ortamda ilerlemeye devam eder16. Önceki yumurtalık doku kültürü protokolleri nispeten kısa (1-6 gün7,32) veya uzun (10-15 gün 5,6,10) kültür dönemlerini kullanmıştır. Fetal sığır yumurtalık korteksinde ilkel folikül aktivasyonunu araştırmak için daha kısa kültür pencereleri kullanılmıştır41. İnsan olmayan primatlarda, primat ilkel foliküllerin hayatta kalma yeteneğini değerlendirmek ve serumsuz ortamda in vitro büyümeyi başlatmak için 20 günlük bir kültür süresi kullanılmıştır18. Bununla birlikte, serumsuz ortamda 7 günden uzun süre yumurtalık sığır korteksini kültlü hale alırken doku bozulmasının arttığını gözlemledik. Biz de günlük örneklerin analizinde steroid konsantrasyonları kültür 4 gün sonra azalır tespit ettik (veri gösterilmez). Daha uzun bir kültür penceresi, yumurtalık korteks kültürlerinde kontaminasyon olasılığını da artırabilir. Bu nedenle, büyük etkiler 7 günlük kültür15 ile ölçülebilir ve kültür zamanı ele alınan hayvan modeline ve bilimsel soruya bağlı olabilir.
Bu sığır yumurtalık korteks protokolünün çeşitli avantajları olsa da, birkaç sınırlama vardır. Bir sınırlama, yumurtalık kortikal kültürü sırasında toplanan yumurtalık kortikal doku ve kültür orta hacim miktarıdır. Yumurtalık korteks parçalarının küçük boyutu, boyama amacıyla sınırlı sayıda doku bölümünün kullanılmasına izin verir (H&E, immünoresans vb.). RT-PCR gerçekleştirmek için en az dört korteks parçası gerekir16. Ayrıca, toplanan kültür ortamının düşük hacmi, yapılan analizlerin miktarını sınırlayabilir. Bu sınırlamalarla mücadele etmek için, histoloji, tahliller ve PCR için yeterli kültür ortamı ve dokusu sağlamak için yumurtalık başına birkaç çoğaltmayı kültleme öneriyoruz. Oldukça sık, daha fazla analiz için daha fazla doku elde etmek ve hormonların / sitokinlerin / kemokinlerin korteks salgısını ölçmek için artan kültür ortamı elde etmek için her yumurtalığın birkaç parçasını bir / düveden kültürlüyoruz. Preantral foliküller yaşlı yumurtalıklarında genç dişilere (düvelere) göre daha yaygındır. Bu nedenle, kültürlü tüm yumurtalık korteks parçalarında preantral foliküller elde etmek potansiyel bir sınırlamadır. Bu sınırlamayı azaltmanın birkaç yolu, daha fazla yumurtalık korteks parçası elde etmek ve her hayvan için ek kuyular kültürü yapmak veya folikülleri görselleştirmek ve tüm korteks parçalarının erken preantral foliküller içermesini sağlamak için nötr kırmızı kullanmaktır. Yumurtalık korteks kültürünün üçüncü bir sınırlaması, kültür sisteminin herhangi bir kirlenmesinin medya ve korteks parçalarını analiz için kullanılamaz hale getirmiş olmasıdır. Bu nedenle, steril bir ortamı korumanın birkaç yolu, kültürde kullanılan ortamı filtrelemektir. Yumurtalık korteks parçalarını işlemeden ve kesmeden önce temiz tezgahın% 70 etanol ile sterilize edildiğinden ve hava akışının diseksiyonlardan önce en az 30 dakika boyunca çalıştığından emin olun. Ayrıca, daha kolay temizleme sağlamak için emici bir ped kullanıyorsanız (Şekil 1), pedi sterilize etmek ve tezgahı temizlemek için temiz tezgaha herhangi bir doku yerleştirmeden önce UV ışığının 30 dakika boyunca açık olduğundan emin olun. Son olarak, tüm medya değişiklikleri, yumurtalık korteks kültürü için kuyulara yerleştirilecek ortama sadece steril uçların girmesini sağlamak için yeterli hava akışı, steril aletler ve değişen pipet uçları ile bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
Bu tekniğin uygulanması yumurtalık mikroçevrinimini anlamaya yardımcı olacak ve foliküler gelişimin değiştirilmesini içeren kadın üreme bozukluklarında yer alan mekanizmaları çözmeye başlayabilir. Örneğin, polikistik over sendromunun (PKOS) etiyolojisi ve prematüre yumurtalık yetmezliğinin (POF) yönleri belirsizliğini koruyor. İnekler mono-yumurtlama olduğundan, diğer mono-yumurtlama türlerinde (örneğin, insanlar ve insan olmayan primatlar) folikül ilerlemesini ve tutuklanmasını etkileyen faktörleri anlamak için mükemmel bir model oluştururlar. Ayrıca, bu yumurtalık korteks kültürü yöntemi, kadınlarda kısırlıkla sonuçlanan folikül aracılı bozuklukları iyileştirebilecek potansiyel terapötiklerin test etmek için de yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü 2013-67015-20965 tarafından ASC'ye, Nebraska Gıda Gıda Üniversitesi ASC'ye Rekabetçi Hibeler için desteklendi. Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı Hatch, ASC'ye NEB26-202/W3112 Katılım #1011127, Hatch-NEB ANHL Katılım #1002234 ASC'ye hibe. Nicel Yaşam Bilimleri Girişimi Yaz Doktora Sonrası Akademik Destek – CMS için yaz finansmanı için COVID-19 Ödülü.
Yazarlar, daha sonra mevcut makalede bu tekniğin doğruluğunda bir kavram kanıtı olarak kullanılan önceki bir yayında yumurtalıkları sağladığı için dr. Robert Cushman, ABD Et Hayvanları Araştırma Merkezi, Clay Center, NE'ye teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
References
- Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
- Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
- Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
- McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
- Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
- Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
- Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
- Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
- Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
- Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
- Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
- Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
- Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
- Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
- Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
- Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
- Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
- Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
- Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
- Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
- Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
- Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
- Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
- Mohammed, B. T., Donadeu, F. X.
- Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).
