Här beskriver vi protokoll för att utföra levande avbildning och kvantitativ analys av kemoattractant receptordynamik i zebrafiskneutrofiler
Leukocytvägledning genom kemiska gradienter är avgörande för immunsvar. Neutrofiler är de första cellerna som rekryteras till platser för vävnadsskador där de utför viktiga antimikrobiella funktioner. Deras handel med dessa loci orkestreras av flera inflammatoriska kemoattractanter, inklusive kemokiner. På molekylär nivå regleras kemoattractant signalering av den intracellulära handeln med motsvarande receptorer. Det är emellertid fortfarande oklart hur subcellulära förändringar i kemokinreceptorer påverkar leukocytmigrationsdynamiken på cell- och vävnadsnivå. Här beskriver vi en metodik för live imaging och kvantitativ analys av kemokinreceptordynamiken hos neutrofiler under inflammatoriska reaktioner på vävnadsskador. Dessa verktyg har avslöjat att differentiell kemokinreceptorhandel i zebrafiskneutrofiler samordnar neutrofila kluster och spridning på platser för vävnadsskada. Detta har konsekvenser för vår förståelse av hur inflammatoriska svar är självupplösta. De beskrivna verktygen kan användas för att förstå neutrofila migrationsmönster i en mängd olika fysiologiska och patologiska inställningar och metodiken kan utvidgas till andra signalreceptorer.
Leukocytmigration är av största vikt för immunsvar. Immunceller är prototypiska migrationsceller, som är anmärkningsvärt kapabla att korsa vävnader och blodkärl och känna av en rad kemiska vägledningssignaler för att migrera riktningsvis mot mikrober eller andra värdceller av betydelse. Korrekt vägledning bygger på erkännande av kemoattractants, bland vilka kemokiner representerar den mest framträdande kategorin1. Kemokiner känns igen av mycket specifika sju-transmembran G-proteinkopplade receptorer. Vid kemokinbindning förändrar kemokinreceptorer konformation vilket leder till aktivering av associerade trimeriska G-proteiner och deras dissociation i funktionella signalunderenheter som främjar cytoskelettförändringar och riktad migration1. För det andra fosforyleras kemokinreceptorer, och denna modifiering leder till desensibilisering för att attrahera, vilket kan följas av snabb återsensibilisering / återvinning eller intracellulär nedbrytning och nedreglering från cellytan2. Dessa receptordynamiker påverkar varaktigheten och dosen av signalering som cellerna mottar, men hur de påverkar leukocytmigrationsbeteendet har varit svårt att belysa in vivo.
Att spåra receptordynamiken i levande leukocyter i traditionella däggdjurssystem står inför flera utmaningar. För levande studier måste receptorfusioner med fluorescerande proteiner uttryckas i cellerna. Detta är utmanande i primära leukocyter, särskilt hos neutrofiler, och studier har hittills använt surrogatneutrofila cellinjer för att uttrycka kemokinreceptorer 3,4. Generering av transgena musmodeller, där leukocyter uttrycker en fluorescerande receptor eller mutantreceptorer med informativa traffickingdefekter 5,6, innebär betydande investeringar i tid och resurser. Även i dessa fall kan bildupplösningen och kontrasten för avbildningsreceptordynamiken hos det levande djuret begränsas och studier har använt immunohistokemi på fasta vävnadssektioner5. Med tanke på dessa tekniska utmaningar är vår förståelse för hur kemoattractant receptordynamik påverkar cellbeteende i en levande vävnadsinställning för närvarande begränsad.
Här tillhandahåller vi en metod för att övervaka receptorhandel med zebrafiskneutrofiler. Zebrafiskar är genetiskt lätthanterliga, som möss, men transgenes är relativt enklare genom användning av effektiva transposonsystem och direkt zygotmanipulation7. Den genomskinliga larven är idealiskt mottaglig för avbildning. Kemokinreceptordynamiken har visualiserats i ursprungliga könsceller och laterallinjen primordium genom uttryck av motsvarande fusioner med fluorescerande reportrar 8,9,10. Zebrafisklarver är utrustade med mogna neutrofiler som har mycket bevarade genetiska och cellulära egenskaper med avseende på däggdjursneutrofiler. Subcellulär signaldynamik såsom cytoskelettdynamik och polaritetsregulatorer har visualiserats i dessa celler genom generering av motsvarande transgena linjer 11,12,13. Nyligen visualiserade och funktionellt analyserade vi kemokinreceptordynamiken hos neutrofiler under inflammatoriska reaktioner på vävnadsskador14. Här beskriver vi genereringen av transgena reporterlinjer för kemokinsignalering i neutrofiler, beredning av embryon för levande avbildning, en såranalys för att studera neutrofilsignalering och protokollet för förvärv och analys av bilder. Vi tillhandahåller också ett sidoprotokoll för att testa kemokinreceptorsvar på kandidatligander, vilket är användbart när man försöker fastställa ligandigenkänningsmönster i okarakteriserade receptorer. Dessa tekniker kan användas i kombination med ytterligare genetiska manipulationer, såsom hämning av endogent kemokinuttryck eller generering av mutantreceptorer med förändrad ligandinducerad handel, för att undersöka hur specifik signaldynamik påverkar leukocytbeteende in vivo. De transgena linjerna som uttrycker fluorescerande märkta kemokinreceptorer kan också användas som reportrar för endogena kemokingradienter, som annars är svåra att detektera genom direkt antikroppsfärgning. Den beskrivna metoden ger utrymme för att utöka genereringen av reportrar till andra immunsignalreceptorer.
Den beskrivna metoden möjliggör levande avbildning av receptordynamiken som svar på endogena ligander in situ under ett inflammatoriskt svar på vävnadsskada. Användningen av Cxcr1 / Cxcr2 neutrofila reportrar kan utvidgas till andra fysiologiska inställningar, såsom infektion, tumörmodeller eller andra typer av vävnadsskador 14,25,26,27. Dessutom kan transgena räddningslinjer, där den endogena receptorn undertrycks och räddas av en exogen mutantreceptor, ge användbara verktyg för att dissekera vikten av specifika neutrofila migrationsmönster i immunsvar. Till exempel orsakar Cxcr1-receptormutanter som har nedsatt desensibilisering mer framträdande neutrofila kluster vid inflammatoriska platser14. Denna förstärkning av funktionsfenotyp kan användas för att förstå rollen som neutrofil församling i olika fysiologiska processer, t.ex. sårreparation, infektionssjukdom eller tumörutveckling och komplettera receptor knockdown / knockout-experiment. Metoden ger också en grund för att utöka utbudet av tillgängliga reportrar. Valet av fluorescerande reporter är viktigt att överväga och beror på den biologiska frågan. Vi fann att den konstitutiva omsättningen av dessa kemokinreceptorer i neutrofiler var hög, jämfört med epitelceller, och att reportrar med snabb mognad (t.ex. sfGFP) var skyldiga att rapportera membrannivåer vid steady state och lösa skillnader vid neutrofilstimulering 8,14. Således är membranförhållanden för sfGFP / tagRFP inte tillämpliga för mätning av ligandinducerad internalisering i denna celltyp, men mönstret för tagRFP möjliggör spårning av receptorns intracellulära öden, vilket kan vara användbart i vissa studier. Vi fann också att den mer koncentrerade intracellulära signalen av tagRFP är användbar för screening av enskilda larver. Ett alternativt tillvägagångssätt för att mäta receptornivåer vid plasmamembranet skulle vara att samuttrycka en fluorescerande membranmarkör hos neutrofiler antingen i samma transgen9 eller i en oberoende transgen14. I det förra scenariot skulle transgenen ge ytterligare ett sätt att screena fisken och uttrycksnivåerna skulle vara jämförbara mellan markören och receptorn. Det senare tillvägagångssättet skulle vara mer modulärt, eftersom en zebrafisklinje med en receptorreporter kunde kombineras med olika reporterlinjer. I båda fallen är det värt att notera att membrankvantifiering av receptornivåerna är utmanande i klusterade neutrofiler (se nedan). Slutligen noterar vi att en möjlig förlängning av detta protokoll skulle vara att följa upp den levande avbildningen genom immunohistokemi för mer detaljerade lokaliseringsanalyser.
Tol2-transgenessystemet är väl etablerat7 och lysozym C-promotorn har använts i stor utsträckning för neutrofila uttryck11,15. Transgenesmetoden är därför relativt enkel och uttrycksnivån som uppnås med denna promotor är tillräckligt hög för att ge tillräcklig kontrast för analys av receptordynamik. En möjlig begränsning är att uttrycksnivån inte rekapitulerar endogena receptoruttrycksnivåer. Ny CRISPR-teknik skulle kunna användas för att upprätta knock-in-linjer för receptorer av särskilt intresse28. Dessa tekniker är fortfarande besvärliga och kanske inte garanterar de nödvändiga uttrycksnivåerna för subcellulär avbildning, men deras framgångsrika utveckling skulle vara ett viktigt genombrott för att förstå endogen signaldynamik. Funktionella valideringar är viktiga för att tolka data med transgena receptorkonstruktioner. Till exempel kan ligandigenkänningsanalyser användas för att fastställa att det fluorescerande fusionsproteinet är funktionellt och räddning av knockout-fenotyper kan användas för att fastställa att de transgena neutrofila uttrycksnivåerna är kompatibla med funktionalitet14. Slutligen skulle ett mer direkt sätt att validera receptorfusionen vara att använda en in vitro-funktionell analys med märkt receptor tillsammans med icke-märkta versioner14.
Kvantifieringsmetoden behandlar specifika svårigheter vid exakt membransegmentering hos neutrofiler in vivo. I celler av epitelial natur kan kvantifiering av receptornivåer utföras automatiskt genom normalisering av membranreceptornivåer till en kontrollmarkör, som kan uttryckas i tandem eller separat9. Vi har faktiskt tillämpat ett sådant tillvägagångssätt när vi använder ligandigenkänningsanalysen i gastrulerande embryon14. Neutrofiler genomgår emellertid komplexa, snabba förändringar i cellform in vivo, vilket gör membransegmenteringen svår både i 2D och 3D14. Detta är ännu mer utmanande när neutrofiler kluster, vilket förekommer i många fysiologiska miljöer29. Kontrastmåttet övervinner denna begränsning eftersom det inte kräver membransegmentering utan istället återspeglar det övergripande tillståndet för receptorfördelning i cellen (membranös / slät vs vesikulär / prickig). Det är viktigt att notera att kontrastmått kan påverkas av bildens totala kontrast, så normalisering av enskilda cellvärden till en intern referens krävs för att ta hänsyn till signalens variabilitet i olika embryon / prover. Till exempel använde vi det genomsnittliga cellkontrastvärdet för icke-responsiva neutrofiler i CHT (dvs. neutrofiler som förblir stationära och inte migrerar in i ventralfenan)14. En ytterligare möjlighet skulle vara att normalisera med kontrastvärden för en kontrollmarkör i samma cell. Detta skulle ge en lösning när en intern referens av icke-svarande celler inte är tillgänglig och sannolikt kan lösa finare kvantitativa skillnader i receptordynamik mellan olika tillstånd.
Placeringen av avbildning är en annan variabel att tänka på. Anledningen till att välja det ventrala fensåret här, i motsats till den vanligare svansfensårmodellen 16,30, beror på att sårplatsen ligger i närheten av platsen för neutrofil bostad / migrerande ursprung. Detta påskyndar analysens tidslinje, eftersom det tar relativt lite tid för neutrofiler att komma fram. Dessutom ger det möjlighet att fånga cellbeteende både vid migrationens ursprung (CHT) och målplatsen av intresse (sår). Detta är relevant här, eftersom den rumsliga och tidsmässiga upplösningen som krävs för subcellulär avbildning är svår att kombinera med ett stort synfält eller skanning med flera positioner. Således tillåter den ventrala fensåranalysen spårning av utvecklingen av det migrerande svaret från migrationsursprunget och samtidig infångning av ospecifika receptorfluktuationer i celler som inte svarar. Som nämnts ovan är det senare användbart för kvantifieringsändamål eftersom det ger en intern referens för ospecifik dynamik. I andra system kanske det inte är möjligt att ha en sådan intern referens, i vilket fall kontrastvärdena för en samuttryckt membranmarkör skulle ge en alternativ kontroll.
Sammanfattningsvis räknar vi med att metoden är tillämplig på andra system och kan användas för en mängd olika ändamål. Till exempel kan samma reportrar användas i andra inflammatoriska inställningar, såsom infektionsinställningar eller andra sjukdomsmodeller. Repertoaren av zebrafiskreceptorreporterlinjer kan utvidgas till andra signalreceptorer, för att förstå signalmekanismer eller rapportera liganddynamik in vivo. Tillvägagångssättet kan kombineras med knockdown / knockout-tekniker för att förhöra den mekanistiska grunden för observerad dynamik. Exempelvis kan störning av liganduttryck indikera ligandberoendet för observerad receptordynamik. I framtiden ser vi framför oss att systemet skulle kunna förfinas ytterligare för att inkludera knock-in-insättning av reportrar. I slutändan skulle fynd som använder denna metod ge nya insikter som är värdefulla bortom zebrafisksamhället, med tanke på bevarandet av dessa signalreceptorer hos däggdjur och den relativa utmaningen att genomföra dessa studier i större organismer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Christine Holt och Bill Harris för hjälp med konfokalmikroskopi. Vi tackar Darren Gilmour för de fluorescerande timerryggradskonstruktionerna och Anna Huttenlocher för Tol2-Lyz ryggradsvektor. Vi tackar Steve Renshaw för Tg(mpx:GFP)i114-linjen . Detta arbete stöddes av MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] och ett Isaac Newton Trust-bidrag 19.23(n). C.C. stöddes av en MRC DTP-studentskap och delvis av Wellcome Trust [204845 /Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] bidrag. H.W. stöddes av en MRC DTP Studentship. H.P. stöddes av ett Wellcome Trust-doktorandbidrag (105391/Z/14/Z) och delvis av ett Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] bidrag och MRC (MR/L019523/1).
1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
Prism | GraphPad Software | ||
Small paintbrush | N/A | ||
Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Volocity software | N/A | ||
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |