Summary
ここでは、ゼブラフィッシュ好中球における化学誘引受容体ダイナミクスのライブイメージングおよび定量分析を実行するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
化学的勾配による白血球誘導は、免疫応答に不可欠である。好中球は、重要な抗菌機能を実行する組織損傷部位にリクルートされる最初の細胞です。これらの遺伝子座への彼らのトラフィッキングは、ケモカインを含むいくつかの炎症性化学誘引物質によって画策されている。分子レベルでは、化学誘引性シグナル伝達は、対応する受容体の細胞内輸送によって調節される。しかし、ケモカイン受容体の細胞内変化が細胞および組織レベルで白血球遊走ダイナミクスにどのように影響するかは不明のままである。ここでは、組織損傷に対する炎症反応中の好中球におけるケモカイン受容体ダイナミクスのライブイメージングおよび定量分析のための方法論を説明する。これらのツールは、ゼブラフィッシュ好中球における示差的ケモカイン受容体トラフィッキングが、組織損傷部位における好中球クラスタリングおよび分散を調整することを明らかにした。これは、炎症反応がどのように自己解決されるかについての我々の理解に意味を持つ。記載されたツールは、様々な生理学的および病理学的設定における好中球移動パターンを理解するために使用でき、方法論は他のシグナル伝達受容体に拡張することができる。
Introduction
白血球の移動は、免疫応答にとって最も重要である。免疫細胞は原型的な遊走細胞であり、組織や血管を横断し、微生物や他の重要な宿主細胞に向かって方向に移動するためのさまざまな化学的誘導の手がかりを感知する能力が非常に高い。正しいガイダンスは化学誘引物質の認識に依存しており、その中でケモカインは最も顕著なカテゴリー1を表す。ケモカインは、高度に特異的な7回膜貫通Gタンパク質共役型受容体によって認識される。ケモカイン結合すると、ケモカイン受容体は立体構造を変化させ、関連する三量体Gタンパク質の活性化および細胞骨格変化および指向性遊走を促進する機能的シグナル伝達サブユニットへのそれらの解離をもたらす1。第二に、ケモカイン受容体はリン酸化され、この修飾は誘引物質に対する脱感作をもたらし、その後、細胞表面からの急速な再感作/リサイクルまたは細胞内分解およびダウンレギュレーションが続くことができる2。これらの受容体ダイナミクスは、細胞が受けるシグナル伝達の持続時間および用量に影響を及ぼすが、それらが白血球遊走挙動にどのように影響するかを生体内で解明することは困難であった。
従来の哺乳類系における生きた白血球における受容体ダイナミクスの追跡は、いくつかの課題に直面している。ライブ研究では、蛍光タンパク質との受容体融合を細胞内で発現させなければならない。これは初代白血球、特に好中球において困難であり、これまでの研究では、ケモカイン受容体を発現するために代理好中球細胞株を使用してきた3,4。白血球が有益なトラフィッキング欠陥5,6を有する蛍光受容体または変異受容体を発現するトランスジェニックマウスモデルの作製には、かなりの時間と資源の投資が伴う。これらの例においても、生きた動物における受容体動態を画像化するための画像化分解能およびコントラストは制限される可能性があり、研究は固定組織切片5で免疫組織化学を用いている。これらの技術的課題を考えると、化学誘引性受容体のダイナミクスが生きた組織環境における細胞挙動にどのように影響するかについての我々の理解は、現在限られている。
ここでは、ゼブラフィッシュ好中球における受容体トラフィッキングを監視するための方法論を提供する。ゼブラフィッシュはマウスと同様に遺伝的に扱いやすいが、効率的なトランスポゾン系と直接受精卵操作の使用により、トランスジェネシスは比較的簡単である7。透明な幼虫は理想的にはイメージングに適している。ケモカイン受容体ダイナミクスは、蛍光レポーター8、9、10との対応する融合体の発現によって始原生殖細胞および側線原基において視覚化されている。ゼブラフィッシュの幼虫は、哺乳類の好中球に関して高度に保存された遺伝的および細胞的特性を有する成熟した好中球を備えている。細胞骨格ダイナミクスおよび極性調節因子などの細胞内シグナル伝達ダイナミクスは、対応するトランスジェニック株11、12、13の生成によってこれらの細胞において視覚化されている。最近、我々は、組織損傷に対する炎症反応の過程で好中球におけるケモカイン受容体動態を可視化し、機能的に解析した14。ここでは、好中球におけるケモカインシグナル伝達のためのトランスジェニックレポーターラインの生成、ライブイメージングのための胚の調製、好中球シグナル伝達を研究するための創傷アッセイ、および画像の取得および分析のためのプロトコルについて説明する。また、候補リガンドに対するケモカイン受容体応答を試験するためのサイドプロトコルも提供しており、これは特徴付けられていない受容体におけるリガンド認識パターンを確立しようとする際に有用である。これらの技術は、内因性ケモカイン発現の阻害またはリガンド誘導性トラフィッキングの変化を伴う変異型受容体の生成などのさらなる遺伝子操作と組み合わせて使用して、特定のシグナル伝達ダイナミクスがインビボでの白血球挙動にどのように影響するかを調査することができる。蛍光標識されたケモカイン受容体を発現するトランスジェニック株は、直接抗体染色では検出が困難な内因性ケモカイン勾配のレポーターとしても使用することができる。記載された方法論は、レポーターの生成を他の免疫シグナル伝達受容体に拡大するための範囲を提供する。
Protocol
注:すべてのゼブラフィッシュは、ARRIVEガイドラインおよび英国内務省の規制、英国動物(科学的手順)法1986に従って飼育されました。
1. 白血球における受容体トラフィッキングをイメージングするためのトランスジェニックレポーターゼブラフィッシュ幼虫の生成
- 目的の蛍光タグ付き受容体の組織特異的発現のためのTol2ベースの構築物を生成する。好中球の場合、リゾチームC15 およびミエロペルオキシダーゼ遺伝子16からのプロモーター配列を使用する。構築物は、単一の蛍光タンパク質(例えばGFP)、タンデム蛍光タイマー(例えば、高速フォールディングGFPおよびより遅い成熟タグRFP8、14、17)、またはレポーターGFPのバイシストロニック発現および制御膜マーカー9 との融合として設計することができる(アプローチを選択する際の考慮事項については 、「議論 」を参照のこと)。
注:この構築物は、内因性レベルの受容体発現を反復しないが、目的の細胞型における高レベルの受容体発現を得るために有用である。類似の受容体3、5、6、8、9、10、14に関する文献を参照して、蛍光タグの位置を決定する。 - 卵産前日に障壁で区切られた標準的な畜産慣行18に従って、野生型の成人男性と女性を含むタンクを設置する。
- 産卵当日に、12.5ng/μLのTol2 DNA構築物および17.5ng/μLのトランスポザーゼmRNAを含むマイクロインジェクション用のトランスジェネシス混合物を調製する7。午前中に明かりがついた直後に水槽から障壁を持ち上げ(これは魚の施設によって異なる場合があります)、mRNA注射のために15分以内に卵を収集します。
注: 混合物中のトランスポザーゼ mRNA の分解を避けるために、DNA 溶液に RNase がないことを確認してください。これを回避する選択肢は、卵にTol2構築物とトランスポザーゼの別々の溶液を注入することです。 - ゼブラフィッシュ卵のトランスジェネシスおよびマイクロインジェクションのための標準的なプロトコルに従う19.
- 1細胞期胚の細胞に1nLの溶液を注入する。
注:発現結果は、細胞内に注入し、細胞内に明確ではないかもしれない注射を破棄すると、より一貫している。1細胞期胚は、2~16細胞期胚を注入する場合の細胞当たりの体積注入のばらつきから対象とされている。選択肢は、1細胞段階の注射を後の注射のバッチから分離することであり、これらは異なる有効性を有する。 - その日の後半に注入された胚をチェックし、クラッチを健康に保つために未受精卵または死んだ卵子を取り除きます。
- 受精後3日目(dpf)に、蛍光顕微鏡下で幼虫をスクリーニングする。このマーカーは、好中球、特にこれらの細胞に富む尾状造血組織(CHT)において見えるであろう。
注:標識された細胞の割合は、異なる構築物によって異なるが、通常、好中球の20〜60%が構築物を発現すると予想される。パーセンテージが低いほど、通常、成人段階でのスクリーニングの増加が予測されます。魚を成長させる前に、これらの胚のサンプルにおいて、より高解像度のイメージングアプローチを用いて、膜における受容体の正しい局在化を検証することも良い習慣である。 - 標準的な飼育慣行に従って陽性の幼虫を育てる20.これらは F0 世代を表します。
- 生後3ヶ月で、創設者のためにF0魚をスクリーニングします。個々の魚を非トランスジェニック野生型と交差させ、解剖範囲で見ることによって受容体の発現について3dpfでその子孫をスクリーニングする。各構築物によって変化するトランスジェネシスの成功に応じて、交配のサブセットにおける陽性の子孫の割合を観察する。
注:良好なトランスジェネシスのために、成人の約3分の1〜5分の1が陽性の子孫を与える。クラッチ内で陽性である子孫の割合は、挿入された導入遺伝子のコピー数によって変化し、10〜60%であり得る。クラッチ内のメンデル比を追跡して、単一挿入トランスジェニックを識別することは有用です(これらは、陽性幼虫の50%の比率を探すことによってF2クラッチでより容易に識別されます)20。 - F1世代を代表するポジティブな子孫を育てる。
- 生後3ヶ月で、安定したF2トランスジェニックラインを確立するために、同じ方法でF1成人をスクリーニングする。
- 導入遺伝子の好中球特異的発現を検証した後、F2幼虫について実験を行う。
注:トランスジェネシスの間、様々なレベルの受容体発現を観察することがあり、生物学的質問に最も適切な発現レベルを得るためには、異なるトランスジェニッククラッチを保持することが推奨される。初期結果は、F0またはF1幼虫において得ることができる。
2. 白血球創傷応答を評価するためのゼブラフィッシュ胚の採取
- 安定したトランスジェニックレポーターラインを確立した後、成魚と雌のトランスジェニック魚の間に交配を設定し、翌朝卵を採取する。
- E3培地(または卵水18)中で28.5°Cで胚を増殖させる。
- 任意選択で、24 hpfで、0.003%漂白剤を添加した50 mLのE3培地を含む遠沈管で胚を5分間インキュベートする。続いて、チューブを数分間放置して胚が底部に沈降し、次いで培地をデカントして交換することによって、E3培地中で3回すすいだ。
注:これは、幼虫の感染曝露に関する制御のレベルを提供し、創傷中の白血球の行動に影響を与える可能性がある。 - 漂白後、メラニン合成を防ぐために0.003%の1-フェニル-2-チオ尿素を添加したE3培地に胚を保管してください。真菌感染を予防するためにしばしば使用されるメチレンブルーは、組織自己蛍光を最小限に抑えるために、ここには添加されない。
- 幼虫が自然に孵化できるようにし、好中球が豊富な場合は3dpfで使用する21。
3.幼虫の腹側ひれ傷
- 幼虫を創傷のために準備する。豊富な好中球が観察される場合は、2.5〜3.5dpfの幼虫を使用してください。幼虫を160-200 mg/LトリカインMS222を添加したE3培地に移す。
注:トリカインの濃縮溶液は、事前にアリコートで調製して凍結し、当日に解凍する必要があります。 - 幼虫をE3 +トリカイン培地に15分間放置して、麻酔をかけていることを確認する。小さな絵筆や同様のツールで優しく触れて、反応を確認します。
- 蛍光解剖範囲下でトランスジェニック受容体発現を有する幼虫を選択する。
- 幼虫をE3 +トリカインの120mmペトリ皿に移して傷つける。滅菌メスを用いて幼虫の腹びれを切断し、解剖スコープ下で観察しながら(図1)。
注:アイデアは、CHTの血管を切断することなく、実質的な好中球の募集を引き起こすのに十分な深さの切断を行うことである。切断は、切開部がCHTの血管にほぼ到達するようにCHT軸に対して垂直に行われる。これにはある程度の練習が必要であり、最初にこの目的のために生成されていない幼虫(例えば、別の実験からの過剰な幼虫)の監督下で実施されるべきである。
4. ライブイメージングのための幼虫の調製
- 加熱により低融点(LMP)アガロースをE3媒体に溶解し、液体2%アガロース溶液を得た。
- この溶液を60°Cまで冷却します。
注:アガロースの入ったフラスコまたはチューブを60°Cのインキュベーターに保管し、異なる幼虫の取り付けの間にアガロースが設定されないようにします。 - 5 mLの液体LMP+E3を顕微鏡画像化用のガラス底皿に入れたピペット。
- 傷ついた麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼虫を、0.5mLのE3 + 2xトリカインとともにガラス底の皿にピペットで留める。
- 2つの溶液を穏やかに混合して1%LMP/1xトリカインアガロース/E3溶液を得、気泡の発生を回避します。胚を横向きにし、魚の尾部がガラスにできるだけ近くなるように静かに押し下げます。
注:倒立顕微鏡でイメージングする場合、イメージングする組織はガラス底にできるだけ近づかなければなりません。幼虫の向きの設定は、幼虫が配置される前にアガロースが設定されないように迅速でなければならない。 - アガロース溶液を冷却し、5〜10分間固化させる。アガロースがセットされているかどうかをテストするには、小さなペイントブラシまたは先端でアガロースゲルに優しく触れます。
- アガロースが固体になったら、0.2 mg/mLのトリカインを添加した2 mLのE3をイメージングプレートに加えます。
5. ライブ共焦点イメージング
注:回転円盤上の胚を共焦点顕微鏡または同等の画像(図2)で画像化する。レーザー走査顕微鏡を使用することもできますが、ダイナミクスの時間分解能はより制限されます。傷ついた幼虫を連れて来る前に画像化設定を準備して、傷ついた後にできるだけ早く反応を画像化できるようにしてください。好中球は5分以内に創傷に到着し、最初に到着した細胞の受容体はこの時間枠内に内在化する可能性がある。練習では、負傷後15分という早さで画像化することが可能です。
- 顕微鏡の電源を入れます:メーカーの指示に従って、レーザー、カメラ、コンピュータ。
- 集録ソフトウェアを使用して、イメージング設定を行います。適切な蛍光色素のレーザーを選択し、以前の実験に基づいておおよその露光時間を設定します(488 nmでGFPを、561 nmレーザーでtagRFPを取得します)。
- アガロースセット後できるだけ早く、取り付けられた胚を含むプレートを共焦点イメージングスピニングディスクプラットフォーム上に移す。
- 顕微鏡のアイピースを使用して、ステージジョイスティックを使用して皿の中の魚を見つけます。
- 焦点を絞ったつまみを使用して、創傷領域に焦点を合わせます。
メモ: 対象エリアを見つけるには、低倍率の対空 (10x) を使用する方が簡単な場合があります。 - 傷の周囲を画像化するフィールドを選択します。十分な解像度を得るために、高い開口数を持つ30x/40x対物レンズを使用してください。
- ソフトウェアボタンを使用して露光時間を調整し、蛍光マーカーを良好なコントラストで、信号を飽和させずに見ることができるようにします。
メモ: 蛍光の露出を最小限に抑え、タイムラプスの時間分解能を最大化するには、露光時間をできるだけ短くする必要があります。レーザー出力はレーザーの状態によって異なりますが、ダイナミックイメージングに十分な露出時間を短縮できるレベルに調整する必要があります。 - ソフトウェアボタンを使用して、Zスタックとしてイメージ化するボリュームを選択します。
- 目的の期間、30 秒ごとにタイム ラプスを設定します。
注:滅菌腹側フィン創傷の場合、最大動員は2〜3時間で観察される。 - タイムラプスを起動する前に、明視野のスナップショットを作成して視野を文書化します。可能であれば、タイムラプスムービー内の明視野を取得します。
6. ゼブラフィッシュ好中球における受容体インターナリゼーションの定量化
- 画像取得の時間間隔と画像のピクセルサイズを記録します。画像化が開始されてから何分後に何分が経過したかを記録しておいてください。
- フィジーを使用して画像データセットを開き、画像をソフトウェアインターフェイスにドラッグし、タイムスライダを使用して各データセットの代表的な対象フレーム(例えば、巻き付け後1〜1.5時間)を選択し、保存します。
- MATLAB を続行して、イメージ データセットを処理します。
- 新しいスクリプトを作成し、画像の読み取り( 補足ファイル1の重心定義のための「select_neutrophils.m」と呼ばれるスクリプトの6行目)、開く( 補足ファイル1の11行目)、画像上の点の手動選択( 補足ファイル1の12行目)のための関数を含めます。
- このスクリプト(補足ファイル1)を実行して目的のフレームを開き、目視検査で分析する好中球を特定し、それらをクリックして、腹側ひれ創傷とCHTの両方で重心の推定を記録します。
注:CHT中の非動員好中球は、受容体分布が一定である好中球の内部基準として役立つ。これにより、創傷部における細胞のコントラスト値を内部基準に正規化することができる。 - 以下のステップで説明するように、アクティブ輪郭技術22 を用いて各フレームにおける好中球のセグメンテーションを進める。
- アクティブな輪郭によるセグメンテーションに必要なメタデータ(反復回数、輪郭の偏り、推定重心など)を含める関数を作成します。22(補足ファイル2の「創傷データ.m」を参照)。
- 関数 'wound_data.m' を呼び出して、各好中球のセグメンテーションに必要な情報を入力するスクリプトを作成します ( 補足ファイル 3 の 'calc_contrast.m' というスクリプトの 28 行目)。
- 画像読み取るためのコマンドをスクリプトに含めます ( 補足ファイル 3 の 32 行目)。
- 入力画像に等しいサイズの黒い画像(ピクセル値がゼロの画像)の生成( 補足ファイル3の44行目)と、各好中球の重心の周りの10×10ピクセルの正方形の定義( 補足ファイル3の45行目)を追加します。
- アクティブな輪郭を使用した好中球セグメンテーション(補足ファイル3の48〜49行目)と、小さな誤った検出オブジェクトの除去( 補足ファイル3の52行目)を含めます。
注: 初期セグメンテーション輪郭は重心の周りの正方形で、ピクセル強度、反復回数、輪郭のバイアスに基づいてアクティブな輪郭手法によって進化します。セグメンテーションの結果はバイナリマスクで、ピクセルの値が 1 の好中球領域から離れて、すべてのピクセルの値が 0 になります。 - セグメント化されたバイナリ画像と元の画像の乗算を含めると、好中球のピクセル強度のみを取得し、残りの画像は数値ではないため、計算には貢献しません( 補足ファイル3の56-57行目)。
- 各好中球(GLCM)14,23のグレーレベル共起行列の計算を追加します(補足ファイル3の61行目)。GLCMは、画素強度の観点から画素の相対位置を示す画像の別の表現である。
- GLCMに基づく好中球のコントラストの計算を含める( 補足ファイル3の62,65行目)。コントラスト メトリックは、隣接するピクセル間の強度の違いを測定します。ピクセルは、一定距離離れたピクセルと比較され、強度の局所ピークのサイズに基づいて経験的に調整することができる。指標として、画像については、ピクセルサイズが0.389μmで、受容体が小胞分布を示したとき、各明るい点は5ピクセルの範囲にあった。したがって、強度は、5ピクセル間隔のピクセルで比較された。
- 腹側フィン内の個々の好中球の値を別々に保存するコマンドを追加します( 補足ファイル3の68行目)。
- 創傷における好中球の場合と同じ方法で、すべてのCHT好中球からの平均好中球コントラスト値の計算を含める(補足ファイル3の72〜119行目)。CHT好中球の場合は、関数「cht_data.m」を呼び出します( 補足ファイル4の77行目)。
- 創傷における個々の好中球のコントラスト値をステップ6.16において上記で計算したCHT好中球の平均コントラスト(すなわち、除算)に正規化することを含める( 補足ファイル3の122行目)。これは、対照非応答細胞と比較して、個々の応答細胞における受容体の出現がいかに「点状」であるかを反映する正規化されたコントラストを与える(図3 および 図4)。
- スクリプト(補足ファイル3)を実行するには、ソフトウェアの実行シンボルをクリックします。
- さまざまな条件に対してすべての手順を繰り返します。
- 統計ソフトウェア(材料表を参照)を使用して、列 表を作成してさまざまな条件の結果をインポートし、結果をプロットし、統計検定を実行して平均値の差の有意性を確認します。
注: 分析のコードは、GitHub の https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic でも確認できます。
7. 初期胚におけるケモカイン応答アッセイ
注:これは、候補ケモカインに応答した受容体分布変化の試験を可能にするオプションのサイド実験であり、受容体構築物の好中球発現に関する上述の実験から独立している。リガンドレベルが飽和しているため、受容体間のリガンド誘導性トラフィッキングの違いを確立することは困難です14。しかし、この系で受容体のリガンド内在化が見られる場合、これはリガンドの同一性が不明瞭な場合にリガンドが受容体によって認識されることを示すことができる。これは、HEK293T細胞14 などの樹立細胞株におけるケモカイン受容体の発現が煩雑であり得るので有用である。
- 野生の魚(例えば、AB)の十字架を設置し、分離器を持ち上げた直後に翌朝卵を集める(上記のように)。
- 100 pgの蛍光標識された受容体mRNA(例えば、Cxcr1-FT)を、膜マーカー(例えば、膜CFP)のための100 pgのmRNAと共に注入する。ケモカインリガンドに対するmRNAの様々な用量を混合物中に含める。
注:指標として、150pg Cxcl8a mRNAは蛍光Cxcr1-FTの顕著なインターナリゼーションを与えた( 図5参照)。 - E3培地で胚をすすぎ、28°Cでインキュベートする。
- 約7馬力で、蛍光解剖範囲でmRNAの発現をテストし、画像化する胚を選択する。
- 8%LMPアガロースを予め用意し、60°Cのヒートブロック内でガラス管内に保管する。ガラスピペットを使用して胚を操作します。各手に一対の鉗子を用いて胚を穏やかに脱絨毛する。
- 個々の脱経膜胚をガラスピペットで吸引し、先端に気泡がないようにします。胚をアガロースのチューブに静かに放出し、チューブに沈むようにする。
- アガロース管から胚を吸引し、途中で液体アガロースを集める。ガラス底のイメージング皿の中央に胚を静かに放出する。動物のポールが皿の底に向くように胚をすばやく回転させます(倒立顕微鏡を使用する場合、この側は対物に最も近い必要があります)。
注:アガロースがまだ設定されている間に胚の向きを再調整する必要があるかもしれません。 - アガロースをセットした後、2mLのE3培地を補充する。
注:この段階での胚は幼虫と比較して非常に壊れやすく、脱絨毛とマウントにはいくつかの練習が必要です。胚の破裂を避けるために、できるだけ穏やかに吸引して放出することが重要です。 - ディッシュあたり3〜5個の胚をロードすることを目的としたプロセスを繰り返します。
- 胚を倒立共焦点顕微鏡で画像化する( 材料表参照)。40x/1.3 NA オイル対物レンズを使用して、十分な分解能を得ます。スコープ上で、mCFP、sfGFP、および tagRFP をそれぞれ 405、488、および 552 nm で視覚化します。フィルターと設定を調整して、彩度を避けながらコントラストを高くし、チャンネル間の漏れを最小限に抑えます。
- 取り付けとイメージングをさまざまな条件で繰り返します。
Representative Results
腹側フィン創傷に続いて、CHTから腹側フィンへの迅速な好中球動員と、30〜60分以内に創傷縁でのクラスタリングが続く(図1)。我々は、ゼブラフィッシュ好中球24によって発現され、Cxcl8aおよびCxcl8b14を認識する2つのケモカイン受容体Cxcr1およびCxcr2の分布を、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて可視化した。我々は、好中球が受容体の蛍光タイマー(FT)構築物、すなわちsfGFPとtagRFPのタンデムとの融合を発現するTg(lyz:Cxcr1-FT)およびTg(lyz:Cxcr2-FT)の2つの対応するトランスジェニックラインを生成した(図2および参考文献14)。2つの蛍光色素の使用は、新たに合成された受容体が緑色に蛍光を発し、8,14歳になると徐々に赤色になるため、広範囲の受容体運命のモニタリングを可能にし、原形質膜でのタンパク質代謝回転時間の推定値を提供することを目的としていた。しかし、これらの受容体は好中球原形質膜で構成代謝回転が速く、滞留時間がtagRFPの成熟時間よりも短く、sfGFPは膜局在化を示し、tagRFPは定常状態で小胞局在を示すことが見出された(補足ビデオ1および参考文献14)。そこで、組織損傷部位におけるリガンド誘導インターナリゼーションをモニターするために、sfGFPの分布に着目した。受容体分布のパターンは、隣接するピクセル間の強度の違いを報告するコントラスト測定法を用いて定量化した。その根拠は、受容体分布が膜状で滑らかである場合、コントラスト値が低いことである。受容体分布が小胞状でより穿刺性である場合、コントラスト値は高い(図3)。
別の方法は、対照膜マーカー、例えば膜CFP(mCFP)のレベルに対する受容体レベル(sfGFP強度)の比を定量化することである(図3)。どちらの方法も、細胞内の全球的な小胞受容体分布パターン(コントラスト値が高い)または膜での受容体レベルが低い(sfGFP/mCFP比が低い)ことによって示されるように、受容体の内在化を検出することができた。しかし、コントラスト測定は、膜セグメンテーションの精度が低く、適用できない創傷の好中球クラスターにおける受容体インターナリゼーションを検出することもできます(図3)。この測定基準を使用して、創傷における好中球におけるCxcr1とCxcr2のトラフィックの目に見える違いを定量化することができました(図4および補足ビデオ2)。Cxcr1-FTは創傷に位置する細胞にインターナライズされたが、Cxcr2-FTは創傷の好中球において膜性のままであった(図4A-C、補足ビデオ2および補足ビデオ3)。Cxcl8aおよびCxcl8bの抑制は、モルホリノ処置を介して、創傷におけるCxcr1−FTインターナリゼーションに差次的に影響する(図4C、D)。Cxcr1-FTがCxcl8aに応答することをさらに検証するために、我々は初期胚においてケモカイン応答アッセイを実施した。我々は、Cxcr1-FTが、Cxcl8aが共発現した胚において顕著に内在化することを見出した(図5)。全体として、これらの結果は、記載された方法が好中球におけるケモカイン誘発受容体インターナリゼーションを測定し、これらの効果を媒介するリガンドの同一性を確立するために展開され得ることを示している。
図1:腹側ひれ傷への好中球移動。 (A)(左)尾側造血組織(CHT)、金星循環(VC、青)、腹びれ(VF)および創傷部位の位置を示す3dpf幼虫の漫画。(右)好中球がCHTから動員され、創傷に集結する創傷の領域(W)を描いた漫画。CHT組織の尾静脈神経叢(CVP)は青色で描かれている。(B)腹側ひれ創傷とTg(mpx:GFP)幼虫の好中球分布を示す明視野画像(左)と共焦点投影(右)。破線は VF と CHT のアウトラインを示します。スケールバー = 25 μm。漫画と蛍光画像は、ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:好中球におけるケモカイン受容体トラフィッキングのライブイメージング。 (a)Cxcr1-FT(蛍光タイマー)およびCxcr2-FTの好中球特異的トランスジェニック発現に使用される構築物。Tg(lyz:Cxcr2-FT)、下)は、tRFP(マゼンタ)とsfGFP(緑)チャンネルを示しています。(B)図1Aのような3dpf幼虫の解剖学的スキーム。幼虫の下には、好中球がCHTから動員される(上)または腹びれに入るときに走化を行う(下)創傷(W)の領域を描いたスキームがある。破線の四角形は、右側のスナップショットでイメージ化された領域を示します。(C)CHT(上部パネル)または創傷(下部パネル)に向かって走化性に動員されたTg(lyz:Cxcr1-FT)幼虫(sfGFPが示されている)中の好中球。矢印は、時間の経過と共に同じセルを示します。右の画像上の時点は、左側の画像から分が経過した分である。(D)ケモカイン受容体トラフィッキングのライブイメージングのための実験的アプローチの概略図。パネルA-Cは、ref.14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:受容体ダイナミクスの定量化例 単一(青)またはクラスター化好中球(緑)の創傷またはCHT中の非動員好中球(赤、オレンジ)をセグメント化し、異なる方法によって分析して結果を比較した。示されているのと同じ例の細胞を2つの方法で分析し、画像に見られるものを抽出された値の範囲に関連付ける。(a)選択された、例えば細胞の表面を、sfGFPチャネルにおける輪郭定義に基づいてセグメント化した。(B)コントラストは、Aに示す例の細胞から計算した。その後、sfGFP/CFPのレシオメトリック分析を行った。(D) sfGFP/CFPの比率は、Cに示す例の細胞で計算された。エラーバーは個々の細胞からのS.E..Mを表し、n>1の場合、ここでの値は統計分析には使用されず、異なる定量方法で得られた測定値を例示するためにのみ使用された。スケールバー = 10 μm。図はref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から変更した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:創傷に応答したCxcr1およびCxcr2の微分ダイナミクス。 (A)創傷後80分における創傷におけるTg(lyz:Cxcr1-FT)またはTg(lyz:Cxcr2-FT)幼虫における好中球の共焦点投影(sfGFPチャネルを示す)。スケールバー = 10 μm。 (B)創傷におけるCxcr1-FT好中球(左)およびCxcr2-FT(右)の拡大。緑色の受容体は灰色で示されている。(C)正規化されたコントラスト(CHT中の非動員細胞の平均コントラストに正規化された個々の好中球当たりのコントラスト)。cxcl8aは、cxcl8aに対する平行移動ブロッキングモルホリノと共にスプライスブロッキングの注入を指す。cxcl8bは、cxcl8bに対するスプライスブロッキングモルホリノによる注入を指す。Tg(lyz:Cxcr1-FT)の場合:8匹の幼虫由来のn=24細胞(CHT)、n=47細胞(創傷)。モルホリノを有するTg(lyz:Cxcr1-FT)の場合:5匹の幼虫からn = 28細胞(Cxcl8a-MO)、5匹の幼虫からn = 16細胞(Cxcl8b-MO)。Tg(lyz:Cxcr2-FT)の場合:3匹の幼虫からn=10細胞(CHT)およびn=20細胞(創傷)である。データは、1〜5回の画像化セッションで獲得した独立した幼虫からプールした。Tg(lyz:Cxcr1-FT)に対するダンの多重比較検定によるクラスカル-ウォリス検定、Tg(lyz:Cxcr2-FT)に対する両側不対マン-ホイットニー検定。(D)フィン創傷に応答するcxcl8aモルホリノ(MO)(左)およびcxcl8b MO(右)で処置されたTg(lyz:Cxcr1-FT)トランスジェニック幼虫における好中球の共焦点投影(緑色で示すsfGFPチャネル)。同等の好中球蓄積の時点で撮影されたスナップショット(左の画像では創傷後85分、右の画像では創傷後45分)。スケールバー = 10 μm。図は、ref.14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から変更されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:初期胚におけるケモカイン応答アッセイ。 100pgのCxcr1-FT mRNAの発現および分布を示す胃胚のレーザー走査共焦点スライスを、150pgのCxcl8a mRNAの有無にかかわらず1つの細胞期卵子に注入した。緑色および赤色の受容体は、別々のチャネルに示されている。コントロール膜CFPマーカー(mCFP)は、シアンチャネルで示されている。スケールバー = 20 μm。ref.14( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から修正した図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ムービー1:3dpfのTg(lyz:Cxcr1-FT)(左)およびTg(lyz:Cxcr2-FT)(右)幼虫の頭部におけるトランスジェニック好中球。sfGFP(緑)、タグRFP (マゼンタ)。フレーム間隔は 30 秒、フレームレートは 5 fps です。スケールバー = 20 μm。ビデオはref.14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から発信されています。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー2:Tg(lyz:Cxcr1-FT)(左)およびTg(lyz:Cxcr2-FT)(右)の好中球は、ひれの傷に応答するトランスジェニック幼虫である。映画は負傷後10分以内に始まり、60分続きます。フレーム間隔は 30 秒、フレームレートは 10 fps です。CHT = 尾側造血組織。VF = 腹びれ。スケールバー = 25 μm。ビデオはref.14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から発信されています。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 3. 傷ついたTg(lyz:Cxcr1-FT)トランスジェニック幼虫(ビデオ2に示されているものとは異なる幼虫)からの好中球のさらなる例は、より高い解像度で取得され、CHTへの動員時または腹鰭における侵入および走化性時に受容体内在化(緑色で示すsfGFPチャネル)を示す。フレーム間隔は 30 秒、フレームレートは 2 fps です。スケールバー = 10 μm。ビデオはref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から発信されています。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載された方法は、組織損傷に対する炎症反応の間にその場で内因性リガンドに応答した受容体動態のライブ画像化を可能にする。Cxcr1/Cxcr2好中球レポーターの使用は、感染、腫瘍モデルまたは他のタイプの組織損傷などの他の生理学的設定に拡大することができる14,25,26,27。さらに、内因性受容体が外因性変異受容体によって抑制およびレスキューされるトランスジェニックレスキューラインは、免疫応答における特定の好中球遊走パターンの重要性を解剖するための有用なツールを提供する可能性がある。例えば、脱感作障害を有するCxcr1受容体変異体は、炎症部位14においてより顕著な好中球クラスタリングを引き起こす。この機能表現型の獲得は、創傷修復、感染症、腫瘍の進化などのさまざまな生理学的プロセスにおける好中球会衆の役割を理解し、受容体ノックダウン/ノックアウト実験を補完するために使用することができる。この方法論はまた、利用可能なレポーターの範囲を拡大するための基礎を提供する。蛍光レポーターの選択は考慮することが重要であり、生物学的な問題に依存する。我々は、好中球におけるこれらのケモカイン受容体の構成代謝回転が上皮細胞と比較して高く、成熟の速いレポーター(例えば、sfGFP)が定常状態で膜レベルを報告し、好中球刺激時に差異を解決するために必要とされることを見出した8,14。したがって、sfGFP/tagRFPの膜比は、この細胞型におけるリガンド誘導インターナリゼーションの測定には適用できないが、tagRFPのパターンは受容体の細胞内運命の追跡を可能にし、いくつかの研究において有用であり得る。また、tagRFPの細胞内シグナルがより集中していることが、個々の幼虫のスクリーニングに有用であることも見出した。原形質膜における受容体レベルを測定するための代替アプローチは、同じ導入遺伝子9または独立した導入遺伝子14のいずれかにおいて好中球において蛍光膜マーカーを共発現させることであろう。前者のシナリオでは、導入遺伝子は魚をスクリーニングするための追加の手段を提供し、発現レベルはマーカーと受容体の間で同等であろう。後者のアプローチは、受容体レポーターを有するゼブラフィッシュ系統を異なるレポーター系統と組み合わせることができるという点で、よりモジュール化されるであろう。いずれの場合も、受容体レベルの膜定量化がクラスター化好中球において困難であることは注目に値します(下記参照)。最後に、このプロトコルの拡張の可能性は、より詳細な局在化分析のために免疫組織化学によるライブイメージングをフォローアップすることであることに留意する。
Tol2トランスジェネシス系は十分に確立されており7 、リゾチームCプロモーターは好中球発現11、15に広く使用されている。したがって、トランスジェネシスアプローチは比較的単純であり、このプロモーターで達成される発現レベルは、受容体ダイナミクスの分析に十分なコントラストを提供するのに十分高い。可能な制限は、発現レベルが内因性受容体発現レベルを反復しないことである。新しいCRISPR技術を導入して、特に関心のある受容体に対するノックインラインを確立することができる28。これらの技術はまだ煩雑であり、細胞内イメージングに必要な発現レベルを保証するものではないかもしれないが、それらの成功した開発は、内因性シグナル伝達ダイナミクスを理解するための重要なブレークスルーとなるであろう。機能検証は、トランスジェニック受容体構築物を用いてデータを解釈するために重要である。例えば、リガンド認識アッセイを使用して、蛍光融合タンパク質が機能的であることを立証することができ、ノックアウト表現型のレスキューを使用して、トランスジェニック好中球発現レベルが機能性14と適合性であることを立証することができる。最後に、受容体融合を検証するより直接的な方法は、標識受容体を非標識バージョン14とともに有するin vitro機能アッセイを利用することである。
定量化アプローチは、インビボでの好中球における正確な膜セグメンテーションにおける特定の困難に対処する。上皮性の細胞では、膜受容体レベルを制御マーカーに正規化することによって受容体レベルの定量を自動的に実行することができ、これはタンデムまたは別々に発現させることができる9。実際、我々は、このようなアプローチを、胃胚14においてリガンド認識アッセイを使用する場合に適用した。しかし、好中球はインビボで細胞形状の複雑で急速な変化を受け、2Dおよび3D14の両方で膜セグメンテーションを困難にする。これは、好中球がクラスター化するとさらに困難であり、これは多くの生理学的設定で起こる29。コントラスト測定は、膜セグメンテーションを必要とせず、代わりに細胞内の受容体分布の全体的な状態(膜状/滑らか対小胞性/点状)を反映するため、この制限を克服します。コントラストメトリックは画像の全体的なコントラストの影響を受ける可能性があるため、異なる胚/サンプルにおけるシグナルの変動性を考慮するには、個々の細胞値を内部参照に正規化する必要があることに注意することが重要です。例えば、CHT中の非応答性好中球(すなわち、静止したままで腹側フィンに移行しない好中球)の平均細胞コントラスト値を使用した14。追加の可能性は、同じセル内の対照マーカーのコントラスト値で正規化することです。これは、非応答細胞の内部参照が利用できない場合に解決策を提供し、異なる条件間の受容体ダイナミクスのより細かい定量的差異を解決する可能性がある。
イメージングの位置は、考慮すべきもう 1 つの変数です。ここで腹鰭創傷を選択する理由は、より一般的に使用される尾びれ創傷モデル16,30とは対照的に、創傷部位が好中球居住/遊走起源の部位の近くにあるためである。これにより、好中球が到着するのに比較的短い時間がかかるため、アッセイのタイムラインが加速されます。さらに、遊走起点(CHT)と標的の関心位置(創傷)の両方で細胞の挙動をキャプチャする機会を提供します。これは、細胞内イメージングに必要な空間的および時間的分解能が、大きな視野またはマルチポジションスキャンと組み合わせることが困難であるため、ここで関連しています。したがって、腹側ひれ創傷アッセイは、遊走起源からの遊走応答の進化の追跡および応答しない細胞における非特異的受容体変動の同時捕捉を可能にする。前述のように、後者は、不特定のダイナミクスの内部基準を提供するため、定量化の目的に有用である。他の系では、そのような内部基準を有することができない場合があり、その場合、共発現膜マーカーのコントラスト値は、代替制御を提供するであろう。
要約すると、この方法論は他のシステムにも適用可能であり、さまざまな目的に展開できると期待しています。例えば、同じレポーターを、感染設定または他の疾患モデルなどの他の炎症性設定において利用することができる。ゼブラフィッシュ受容体レポーターラインのレパートリーは、他のシグナル伝達受容体に拡張して、シグナル伝達機構を理解したり、インビボでのリガンドダイナミクスを報告したりすることができる。このアプローチをノックダウン/ノックアウト技術と組み合わせて、観測されたダイナミクスの機構的基礎を調査することができます。例えば、リガンド発現の摂動は、観察された受容体ダイナミクスに対するリガンド依存性を示すことができる。将来的には、レポーターのノックイン挿入を取り入れるために、システムをさらに洗練させることができると想定しています。究極的には、この方法論を用いた知見は、哺乳類におけるこれらのシグナル伝達受容体の保存と、より大きな生物でこれらの研究を実施することの相対的な課題を考えると、ゼブラフィッシュコミュニティを超えて価値のある新しい洞察を提供するであろう。
Disclosures
著者は利益相反がないと宣言しています
Acknowledgments
共焦点顕微鏡の協力をしてくれたクリスティーン・ホルトとビル・ハリスに感謝します。蛍光タイマーバックボーン構築物のDarren GilmourとTol2-LyzバックボーンベクトルのAnna Huttenlocherに感謝します。Steve Renshaw さんの Tg(mpx:GFP)i114 ラインに感謝します。この作業はMRC(MR/L019523/1)、ウェルカム・トラスト[204845/Z/16/Z]によって支援された。アイザック・ニュートン・トラスト[12.21(a)i]とアイザック・ニュートン・トラストは19.23(n)を認可します。C.C.はMRC DTPの学生として、また一部はWellcome Trust [204845/Z/16/Z]によって支援された。アイザック・ニュートン・トラスト [12.21(a)i] 助成金H.W.はMRC DTPスチューデントシップによって支援されました。H.P.はウェルカム・トラストの博士号助成金(105391/Z/14/Z)とウェルカム・トラスト[204845/Z/16/Z]の支援を受けた。アイザック・ニュートン・トラスト [12.21(a)i] 助成金と MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
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