Summary
Здесь мы описываем протоколы для выполнения живой визуализации и количественного анализа динамики рецепторов хемоаттрактантов у нейтрофилов рыбок данио
Abstract
Руководство лейкоцитами по химическим градиентам имеет важное значение для иммунных реакций. Нейтрофилы являются первыми клетками, которые будут рекрутированы в места повреждения тканей, где они выполняют важнейшие антимикробные функции. Их перемещение в эти локусы организуется несколькими воспалительными химиоаттрактантантами, включая хемокины. На молекулярном уровне передача сигналов хемоаттрактанта регулируется внутриклеточным трафиком соответствующих рецепторов. Однако остается неясным, как субклеточные изменения в хемокиновых рецепторах влияют на динамику миграции лейкоцитов на клеточном и тканевом уровне. Здесь описана методология живой визуализации и количественного анализа динамики хемокиновых рецепторов у нейтрофилов при воспалительных реакциях на повреждение тканей. Эти инструменты показали, что дифференциальный трафик хемокиновых рецепторов у нейтрофилов рыбок данио координирует кластеризацию и рассеивание нейтрофилов в местах повреждения тканей. Это имеет значение для нашего понимания того, как воспалительные реакции саморазрешаются. Описанные инструменты могут быть использованы для понимания моделей миграции нейтрофилов в различных физиологических и патологических условиях, и методология может быть расширена на другие сигнальные рецепторы.
Introduction
Миграция лейкоцитов имеет первостепенное значение для иммунных реакций. Иммунные клетки являются прототипами мигрирующих клеток, которые удивительно способны пересекать ткани и кровеносные сосуды и ощущать ряд химических ориентиров для направленной миграции к микробам или другим важным клеткам-хозяевам. Правильное руководство опирается на распознавание химиоаттрактантантов, среди которых хемокины представляют собой наиболее заметную категорию1. Хемокины распознаются высокоспецифичными семитрансмембранными рецепторами, связанными с G-белком. При связывании хемокина хемокиновые рецепторы изменяют конформацию, что приводит к активации ассоциированных тримерных G-белков и их диссоциации в функциональные сигнальные субъединицы, способствующие цитоскелетным изменениям и направленной миграции1. Во-вторых, хемокиновые рецепторы фосфорилируются, и эта модификация приводит к десенсибилизации к аттрактанту, за которой может последовать быстрая ресенсибилизация/рециркуляция или внутриклеточная деградация и понижение регуляции с поверхности клетки2. Динамика этих рецепторов влияет на продолжительность и дозу передачи сигналов, получаемых клетками, но как они влияют на поведение миграции лейкоцитов, было трудно выяснить in vivo.
Отслеживание динамики рецепторов в живых лейкоцитах в традиционных системах млекопитающих сталкивается с несколькими проблемами. Для живых исследований слияния рецепторов с флуоресцентными белками должны быть экспрессированы в клетках. Это является сложной задачей в первичных лейкоцитах, особенно в нейтрофилах, и исследования до сих пор использовали суррогатные клеточные линии нейтрофилов для экспрессии хемокиновых рецепторов 3,4. Генерация трансгенных мышиных моделей, в которых лейкоциты экспрессируют флуоресцентный рецептор или мутантные рецепторы с информативными дефектами трафика 5,6, влечет за собой значительные затраты времени и ресурсов. Даже в этих случаях разрешение изображения и контраст для визуализации динамики рецепторов у живого животного могут быть ограничены, и в исследованиях использовалась иммуногистохимия на фиксированных участкахткани 5. Учитывая эти технические проблемы, наше понимание того, как динамика рецепторов хемоаттрактанта влияет на поведение клеток в условиях живой ткани, в настоящее время ограничено.
Здесь мы приводим методологию мониторинга трафика рецепторов у нейтрофилов рыбок данио. Рыбки данио генетически поддаются обработке, как и мыши, но трансгенез относительно более прост благодаря использованию эффективных транспозонных систем и прямых манипуляций с зиготами7. Прозрачная личинка идеально поддается визуализации. Динамика хемокиновых рецепторов была визуализирована в первичных половых клетках и примордии боковой линии путем экспрессии соответствующих слияний с флуоресцентными репортерами 8,9,10. Личинки рыбок данио оснащены зрелыми нейтрофилами, которые обладают высококонсервативными генетическими и клеточными свойствами по отношению к нейтрофилам млекопитающих. Субклеточная динамика передачи сигналов, такая как динамика цитоскелета и регуляторы полярности, была визуализирована в этих клетках путем генерации соответствующих трансгенных линий 11,12,13. Недавно мы визуализировали и функционально проанализировали динамику хемокиновых рецепторов в нейтрофилах в ходе воспалительных реакций на повреждение тканей14. Здесь мы описываем генерацию трансгенных репортерных линий для передачи сигналов хемокинам в нейтрофилах, подготовку эмбрионов к живой визуализации, раневой анализ для изучения сигналов нейтрофилов и протокол получения и анализа изображений. Мы также предоставляем побочный протокол для проверки реакций хемокиновых рецепторов на лиганды-кандидаты, что полезно при попытке установить паттерны распознавания лигандов в нехарактеризованных рецепторах. Эти методы могут быть использованы в сочетании с дальнейшими генетическими манипуляциями, такими как ингибирование экспрессии эндогенного хемокина или генерация мутантных рецепторов с измененным лиганд-индуцированным трафиком, чтобы выяснить, как специфическая динамика передачи сигналов влияет на поведение лейкоцитов in vivo. Трансгенные линии, экспрессирующие флуоресцентно помеченные хемокиновые рецепторы, также могут быть использованы в качестве репортеров для эндогенных градиентов хемокина, которые в противном случае трудно обнаружить путем прямого окрашивания антител. Описанная методология предоставляет возможности для расширения генерации репортеров на другие иммуносигнационные рецепторы.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все рыбки данио содержались в соответствии с руководящими принципами ARRIVE и правилами Министерства внутренних дел Великобритании, Законом о животных Великобритании (научные процедуры) 1986 года.
1. Генерация трансгенных репортерных личинок рыбок данио для визуализации трафика рецепторов в лейкоцитах
- Генерация конструкции на основе Tol2 для тканеспецифической экспрессии флуоресцентно помеченного рецептора, представляющего интерес. Для нейтрофилов используют промоторные последовательности из лизоцимаС15 и гена миелопероксидазы16. Конструкция может быть спроектирована как слияние с одним флуоресцентным белком (например, GFP), тандемным флуоресцентным таймером (например, быстро складывающимся GFP и более медленно созревающим tagRFP 8,14,17) или бицистронной экспрессией репортерного GFP и маркера управляющей мембраны9 (см. Обсуждение соображений при выборе подхода).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта конструкция не повторяет эндогенные уровни экспрессии рецепторов, но полезна для получения высокого уровня экспрессии рецепторов в интересующем типе клеток. Обратитесь к литературе по аналогичным рецепторам 3,5,6,8,9,10,14, чтобы определиться с положением флуоресцентной метки. - Установите резервуар, содержащий взрослых самцов и самок дикого типа, следуя стандартным методам животноводства18, разделенный барьером за день до нереста яиц.
- В день нереста яиц готовят трансгенезную смесь для микроинъекции, содержащую 12,5 нг/мкл конструкции ДНК Tol2 и 17,5 нг/мкл транспозазной мРНК7. Снимите барьеры из аквариумов вскоре после того, как утром придут огни (это может варьироваться в разных рыбных учреждениях) и соберите икру в течение 15 минут для инъекции мРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор ДНК не содержит РНКазы, чтобы избежать деградации транспозазной мРНК в смеси. Вариантом обхода этого является инъекция яиц с отдельными растворами конструкции Tol2 и транспозазы. - Следуйте стандартным протоколам трансгенеза и микроинъекции яиц рыбок данио19.
- Вводят 1 нЛ раствора в клетку одноклеточных стадий эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты экспрессии более последовательны при введении внутрь клетки и отбрасывании инъекций, которые могут не быть четко внутри клетки. На одноклеточные эмбрионы нацелены из-за изменчивости объемной инъекции на клетку при введении эмбрионов 2-16 клеточной стадии. Одним из вариантов было бы отделение одноклеточных инъекций от партий более поздних инъекций, если они имеют разную эффективность. - Проверьте введенные эмбрионы позже в тот же день и удалите неоплодотворенные или мертвые яйцеклетки, чтобы сохранить кладку здоровой.
- Через 3 дня после оплодотворения (dpf) экранируют личинок под флуоресцентным микроскопом. Маркер будет виден в нейтрофилах, особенно в каудальной кроветворной ткани (CHT), которая богата этими клетками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процент меченых клеток варьируется в зависимости от различных конструкций, но обычно ожидается, что 20-60% нейтрофилов экспрессируют конструкцию. Более низкие проценты обычно предсказывают больше скрининга на взрослой стадии. Хорошей практикой также является проверка правильной локализации рецептора на мембране с подходом визуализации с более высоким разрешением в образце этих эмбрионов перед выращиванием рыбы. - Выращивайте положительных личинок в соответствии со стандартными методами животноводства20. Они представляют поколение F0.
- В 3-месячном возрасте экран F0 рыбы для основателей. Скрещивайте отдельных рыб с нетрансгенным диким типом и проверяйте их потомство на 3 dpf для экспрессии рецептора, просматривая под рассекающим прицелом. В зависимости от успешности трансгенеза, который варьируется с каждой конструкцией, наблюдайте процент положительного потомства в подмножестве скрещиваний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для хорошего трансгенеза от трети до половины взрослых особей дадут положительное потомство. Процент потомства, которое является положительным в кладке, варьируется в зависимости от количества вставленных трансгенов и может составлять от 10 до 60%. Полезно отслеживать менделевские соотношения в кладках, чтобы идентифицировать трансгенные соединения с одной вставкой (их легче идентифицировать в кладках F2, ища 50% соотношение положительных личинок)20. - Выращивают положительное потомство, которое представляет поколение F1.
- В 3-месячном возрасте скрининг F1 взрослым таким же образом устанавливает стабильную трансгенную линию F2.
- Проведите эксперименты на личинках F2 после проверки нейтрофильной экспрессии трансгена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время трансгенеза можно наблюдать различные уровни экспрессии рецепторов, и желательно сохранить различные трансгенные кладки, чтобы получить наиболее подходящий уровень экспрессии для биологических вопросов. Первоначальные результаты могут быть получены у личинок F0 или F1.
2. Сбор эмбрионов рыбок данио для оценки реакций лейкоцитарных ран
- Установив стабильную трансгенную репортерную линию, создайте помесь взрослых и самок трансгенных рыб и соберите яйца на следующее утро.
- Выращивайте эмбрионы при 28,5 °C в среде E3 (или яичнойводе 18).
- Опционально, при 24 л.с.ф., инкубируют эмбрионы в центрифужной трубке, содержащей 50 мл среды E3, дополненной 0,003% отбеливателем в течение 5 мин. Затем промыть 3 раза в среде E3, давая трубке постоять пару минут, чтобы эмбрионы осели на дне, а затем декантируя и заменяя среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает уровень контроля над инфекционным воздействием личинок, что может повлиять на поведение лейкоцитов во время ранирования. - После отбеливания держите эмбрионы в среде E3 с добавлением 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины для предотвращения синтеза меланина. Метиленовый синий, который часто используется для профилактики грибковых инфекций, здесь не добавляют, чтобы минимизировать тканевую аутофлуоресценцию.
- Позвольте личинкам вылупиться естественным образом и используйте при 3 dpf, когда нейтрофилы в изобилии21.
3. Ранение вентрального плавника личинок
- Подготовьте личинок к ранению. Используют личинок при 2,5-3,5 дпф, когда наблюдаются обильные нейтрофилы. Перенос личинок в среду Е3 с добавлением 160-200 мг/л трицина MS222.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированные растворы трицина следует заранее приготовить и заморозить в аликвотах и разморозить в день. - Оставьте личинок в среде E3 + трикаин в течение 15 минут, чтобы убедиться, что они обезболены. Проверьте их ответы, осторожно коснувшись небольшой кистью или аналогичным инструментом.
- Отбирают личинок с трансгенной экспрессией рецепторов под флуоресцентной рассекающей областью.
- Переложите личинок в 120-миллиметровую чашку Петри в E3 + трицен для ранения. С помощью стерильного скальпеля разрезают брюшной плавник личинки, при этом наблюдая под рассекающим прицелом (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Идея состоит в том, чтобы выполнить достаточно глубокий разрез, чтобы вызвать значительный набор нейтрофилов, но без разрезания сосудов CHT. Разрез делается перпендикулярно оси CHT таким образом, что разрез почти достигает сосудов CHT. Это требует некоторой практики и должно быть сначала выполнено с наблюдением за личинками, которые не генерируются для этой цели (например, избыточные личинки из другого эксперимента).
4. Подготовка личинок к живой визуализации
- Растворяют агарозу с низкой температурой плавления (LMP) в среде E3 путем нагревания с получением жидкого 2% раствора агарозы.
- Дайте этому раствору остыть до 60 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите колбу или трубку с агарозой в инкубаторе при температуре 60 °C, чтобы избежать установки агарозы между установками различных личинок. - Пипетка 0,5 мл жидкости LMP + E3 в стеклянной нижней чашке для микроскопической визуализации.
- Пипетка раненой, обезболенной личинкой рыбки данио вместе с 0,5 мл Е3 + 2x Трикаина в стеклянной нижней посуде.
- Осторожно смешайте два раствора для получения 1% раствора LMP/1x трикаин агарозы/Е3, избегая образования пузырьков. Ориентируйте эмбрион сбоку и осторожно отталкивайте вниз так, чтобы каудальная часть рыбы была как можно ближе к стеклу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань, подлежащая изображению, должна быть как можно ближе к стеклянному дну при визуализации с помощью инвертированного микроскопа. Установка ориентации для личинки должна быть быстрой, чтобы агароза не заходила до того, как личинка будет позиционирована. - Дайте раствору агарозы остыть и затвердеть в течение 5-10 мин. Проверьте, устанавливается ли агароза, осторожно коснувшись агарозного геля небольшой кистью или кончиком краски.
- Как только агароза станет твердой, добавьте 2 мл E3, дополненных 0,2 мг / мл трикаина, к пластине визуализации.
5. Живая конфокальная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение эмбрионов на вращающемся дисковом конфокальном микроскопе или эквиваленте (рисунок 2). Лазерный сканирующий микроскоп также может быть использован, но временное разрешение динамики будет более ограниченным. Подготовьте настройки визуализации перед тем, как принести раненую личинку, чтобы реакцию можно было сфотографировать как можно быстрее после ранения. Нейтрофилы прибывают в рану в течение 5 минут, и рецепторы в первых прибывающих клетках могут усваиваться в течение этого периода времени. С практикой можно получить изображение уже через 15 минут после ранения.
- Включите микроскоп: лазер, камеру и компьютер в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте программное обеспечение для сбора данных для настройки параметров обработки изображений. Выбирайте лазеры для соответствующих флуорофоров и приблизительное время воздействия на основе предыдущих экспериментов (приобретайте GFP с 488 нм и tagRFP с лазером 561 нм).
- Перенесите пластину с установленным эмбрионом, как можно скорее после захода агарозы, на конфокальную платформу вращающегося диска.
- Используйте окуляр микроскопа, чтобы найти рыбу в блюде с помощью сценического джойстика.
- Сосредоточьтесь на области раны, используя ручку фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы найти интересующую область, может быть проще использовать воздушный объектив с низким увеличением (10x). - Выберите поле для изображения вокруг раны. Используйте объектив 30x/40x с высокой числовой диафрагмой для получения достаточного разрешения.
- Используйте программные кнопки для настройки времени экспозиции таким образом, чтобы флуоресцентный маркер можно было увидеть с хорошей контрастностью, но без насыщения сигнала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции должно быть как можно более низким, чтобы свести к минимуму воздействие флуоресцентных ламп и максимизировать временное разрешение в период времени. Мощность лазера зависит от состояния лазера, но должна быть отрегулирована до уровня, который обеспечивает достаточно низкое время экспозиции для динамической визуализации. - Используйте программные кнопки для выбора громкости изображения в качестве z-стека
- Установите интервал времени каждые 30 секунд на требуемый срок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для стерильных ран брюшных плавников максимальный набор наблюдается через 2-3 ч. - Перед запуском покадровой съемки сделайте яркий снимок поля, чтобы задокументировать поле зрения. Если возможно, приобретите яркое поле в рамках покадрового фильма.
6. Количественная оценка интернализации рецепторов у нейтрофилов рыбок данио
- Запишите временной интервал получения изображения и размер изображения в пикселях. Ведите учет того, через сколько минут после ранения началась визуализация.
- Откройте наборы данных изображений с помощью Fiji, перетащив изображение на программный интерфейс, выберите репрезентативный кадр, представляющий интерес для каждого набора данных, используя ползунок времени, например, через 1-1,5 часа после намотачивания, и сохраните его.
- Продолжите работу с MATLAB для обработки набора данных изображения.
- Создайте новый скрипт и включите функции для чтения изображения (строка 6 в скрипте под названием «select_neutrophils.m» для определения центроида в дополнительном файле 1), открытия (строка 11 в дополнительном файле 1) и ручного выбора точек на изображении (строка 12 в дополнительном файле 1).
- Откройте интересующую рамку, запустив этот скрипт (Дополнительный файл 1), определите нейтрофилы для анализа путем визуального осмотра, нажмите на них и запишите оценку их центроидов, как в ране брюшного плавника, так и в CHT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немобилизованные нейтрофилы в СНТ служат внутренним ориентиром для нейтрофилов, рецепторное распределение которых остается постоянным. Это позволяет нормализовать контрастные значения клеток на ране к внутреннему эталону. - Продолжайте сегментацию нейтрофилов в каждом кадре с использованием метода22 активных контуров, как описано в шагах ниже.
- Создайте функцию для включения метаданных, необходимых для сегментации по активным контурам (например, количество итераций, смещение контура, расчетный центроид и т. Д.) 22 (см. «данные о ранах.m» в дополнительном файле 2).
- Создайте скрипт, который вызывает функцию 'wound_data.m' для ввода необходимой информации для сегментации каждого нейтрофила (строка 28 в скрипте под названием 'calc_contrast.m' в дополнительном файле 3).
- Включите в скрипт команды для чтения изображений (строка 32 в дополнительном файле 3).
- Добавьте генерацию черного изображения (т.е. изображения, где значения пикселей равны нулям) с равным размером входному изображению (строка 44 в дополнительном файле 3) и определение квадрата 10 × 10 пикселей вокруг центроида каждого нейтрофила (строка 45 в дополнительном файле 3).
- Включите сегментацию нейтрофилов с использованием активных контуров (линии 48-49 в дополнительном файле 3) и удаление мелких ложных обнаруженных объектов (строка 52 в дополнительном файле 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Начальный контур сегментации представляет собой квадрат вокруг центроида, который развивается методом активного контура на основе интенсивности пикселей, количества итераций и смещения контура. Результатом сегментации является двоичная маска, где все пиксели имеют значение 0, кроме области нейтрофилов, пиксели которой имеют значение 1. - Включите умножение сегментированного двоичного изображения на исходное, чтобы получить интенсивность пикселей только нейтрофила, при этом остальная часть изображения не является числом, поэтому оно не способствует вычислениям (строки 56-57 в дополнительном файле 3).
- Добавьте расчет матрицы совместного возникновения серого уровня для каждого нейтрофила (GLCM)14,23 (строка 61 в дополнительном файле 3). GLCM - это еще одно представление изображения, показывающее относительное положение пикселей с точки зрения интенсивности пикселей.
- Включить расчет контрастности нейтрофилов на основе GLCM (строки 62,65 в дополнительном файле 3). Метрика контраста измеряет различия в интенсивности между соседними пикселями. Пиксели сравниваются с пикселями на определенном расстоянии друг от друга, которое можно отрегулировать эмпирически на основе размера локальных пиков интенсивности. В качестве ориентира, для изображений, с размером пикселя 0,389 мкм, когда рецептор показал везикулярное распределение, каждая яркая точка находилась в диапазоне 5 пикселей. Поэтому интенсивность сравнивалась в пикселях, расположенных на расстоянии 5 пикселей друг от друга.
- Добавьте команды для сохранения значений отдельно для отдельных нейтрофилов в брюшном плавнике (строка 68 в дополнительном файле 3).
- Включите расчет среднего значения контраста нейтрофилов из всех нейтрофилов CHT так же, как и для нейтрофилов в ране (строки 72-119 в дополнительном файле 3). Для нейтрофилов CHT назовите функцию «cht_data.m» (строка 77 в дополнительном файле 4).
- Включите нормализацию контрастного значения отдельных нейтрофилов в ране к среднему контрасту нейтрофилов CHT, рассчитанному выше на этапе 6.16 (т.е. деление) (строка 122 в дополнительном файле 3). Это дает нормализованный контраст, который отражает то, насколько «точечным» является внешний вид рецептора в отдельных реагирующих клетках по сравнению с контрольными не отвечающими клетками (рисунок 3 и рисунок 4).
- Запустите сценарий (дополнительный файл 3), щелкнув символ запуска в программном обеспечении.
- Повторите все шаги для разных условий.
- Используйте статистическое программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для импорта результатов для различных условий путем создания таблицы столбцов, построения результатов и выполнения статистического теста для проверки значимости разницы между средними значениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коды для анализа также можно найти в GitHub по адресу https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. Анализы хемокинового ответа у ранних эмбрионов
ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный побочный эксперимент, который позволяет тестировать изменения распределения рецепторов в ответ на хемокин-кандидат и не зависит от экспериментов, описанных выше в отношении экспрессии нейтрофилов рецепторных конструкций. Различия в лиганд-индуцированном трафике между рецепторами трудно установить с помощью этого метода, поскольку уровни лигандовнасыщают 14. Однако, если кто-то видит лиганд-интернализацию рецептора в этой системе, это может быть признаком того, что лиганд распознается рецептором в тех случаях, когда идентичность лиганда неясна. Это полезно, потому что экспрессия хемокиновых рецепторов в установленных клеточных линиях, таких как клетки HEK293T14 , может быть громоздкой.
- Установите скрещивание диких рыб (например, AB) и соберите икру на следующее утро вскоре после подъема сепараторов (как описано выше).
- Введите 100 пг флуоресцентно меченной мРНК рецептора (например, Cxcr1-FT) вместе со 100 пг мРНК для мембранного маркера (например, мембранного CFP). Включают в смесь различные дозы мРНК для хемокина лиганда.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве индикатора 150 pg Cxcl8a мРНК дали заметную интернализацию флуоресцентного Cxcr1-FT (см. Рисунок 5). - Промыть эмбрионы средой Е3 и инкубировать при 28°C.
- Примерно при 7 л.с.ф. тестируют экспрессию мРНК на флуоресцентной рассекающей области и выбирают эмбрионы для изображения.
- Заранее приготовьте 0,8 % агарозы LMP и храните в стеклянной трубке в теплоблоке при 60 °C. Используйте стеклянную пипетку для манипулирования эмбрионами. Осторожно дехорионируйте эмбрионы, используя пару щипцов в каждой руке.
- Аспирируйте отдельный дехорионированный эмбрион стеклянной пипеткой, гарантируя, что на кончике не будет пузырьков. Осторожно впустите эмбрион в трубку агарозы, позволяя ему погрузиться в трубку.
- Аспирируйте эмбрион из агароновой трубки, собирая по пути немного жидкой агарозы. Осторожно выпустите эмбрион в центр стеклянной тарелки для визуализации. Быстро вращайте эмбрион так, чтобы полюс животного был обращен к дну тарелки (эта сторона должна быть ближе всего к объективу при использовании инвертированного микроскопа).
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется скорректировать ориентацию эмбрионов, пока агароза все еще устанавливается. - После того, как агароза установлена, дополните 2 мл среды E3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы на этой стадии очень хрупкие по сравнению с личинками, и требуется некоторая практика, чтобы дехорионировать и скапливаться. Важно аспирировать и выпускать как можно мягче, чтобы избежать разрыва эмбриона. - Повторите процесс, стремясь загрузить 3-5 эмбрионов на блюдо.
- Изображение эмбрионов на перевернутом конфокальном микроскопе (см. Таблицу материалов). Используйте масляный объектив 40x/1.3 NA для получения достаточно высокого разрешения. Визуализируйте mCFP, sfGFP и tagRFP с 405, 488 и 552 нм соответственно в области. Отрегулируйте фильтры и настройки, чтобы иметь высокую контрастность, избегая насыщения и минимизируя утечку между каналами.
- Повторите монтаж и визуализацию для разных условий.
Representative Results
Ранение вентрального плавника сопровождается быстрой мобилизацией нейтрофилов из СНТ в брюшной плавник и кластеризацией на крае раны в течение 30-60 мин (рисунок 1). Мы визуализировали распределение двух хемокиновых рецепторов, Cxcr1 и Cxcr2, которые экспрессируются нейтрофилами рыбок данио24 и распознают Cxcl8a и Cxcl8b14, используя конфокальную микроскопию спиннингового диска. Мы сгенерировали две соответствующие трансгенные линии, Tg(lyz:Cxcr1-FT) и Tg(lyz:Cxcr2-FT), в которых нейтрофилы экспрессируют флуоресцентную конструкцию таймера (FT) рецептора, т.е. слияние с тандемом sfGFP и tagRFP (рисунок 2 и ссылка14). Использование двух флуорофоров было предназначено для того, чтобы позволить контролировать широкий спектр судеб рецепторов и обеспечить оценку времени оборота белка на плазматической мембране, поскольку вновь синтезированные рецепторы будут флуоресцировать зеленым цветом и постепенно становиться красными по мере их старения 8,14. Однако было обнаружено, что эти рецепторы имеют быстрый конститутивный оборот на плазматической мембране нейтрофилов и что время пребывания было короче, чем время созревания tagRFP, причем sfGFP показывал локализацию мембраны, а tagRFP показывал везикулярную локализацию в устойчивом состоянии (Дополнительное видео 1 и ссылка14). Поэтому мы сосредоточились на распределении sfGFP для мониторинга лиганд-индуцированной интернализации в местах повреждения тканей. Картина распределения рецепторов была количественно определена с использованием метрики контраста, которая сообщает о различиях в интенсивности между соседними пикселями. Обоснование заключается в том, что когда распределение рецепторов мембранное и плавное, значение контраста низкое. Когда распределение рецепторов везикулярное и более пунктатное, то значение контрастности высокое (рисунок 3).
Альтернативный метод заключается в количественной оценке отношения уровней рецепторов (интенсивность sfGFP) к уровням маркера контрольной мембраны, например, мембранного CFP (mCFP) (рисунок 3). Оба метода могут обнаруживать интернализацию рецепторов, о чем свидетельствует более высокая картина распределения везикулярных рецепторов глобально в клетке (более высокое значение контраста) или более низкие уровни рецепторов на мембране (более низкое соотношение sfGFP/mCFP). Однако метрика контраста может также обнаружить интернализацию рецепторов в кластерах нейтрофилов на ране, в которых сегментация мембран была менее точной и неприменимой (рисунок 3). Используя эту метрику, мы смогли количественно оценить видимые различия между Cxcr1 и Cxcr2 в нейтрофилах в ранах (рисунок 4 и дополнительное видео 2). Cxcr1-FT интернализовался в клетках, расположенных в ране, тогда как Cxcr2-FT оставался мембранозным в нейтрофилах в ране (рисунок 4A-C, дополнительное видео 2 и дополнительное видео 3). Подавление Cxcl8a и Cxcl8b посредством морфолинотерапии дифференцированно влияет на интернализацию Cxcr1-FT в ранах (рисунок 4C,D). Чтобы дополнительно подтвердить, что Cxcr1-FT реагирует на Cxcl8a, мы провели анализы хемокина у ранних эмбрионов. Мы обнаружили, что Cxcr1-FT заметно интернализуется в эмбрионах, у которых Cxcl8a был совместно экспрессирован (рисунок 5). В совокупности эти результаты указывают на то, что описанные методы могут быть использованы для измерения интернализации рецепторов, индуцированных хемокинами, в нейтрофилах и установления идентичности лиганда, опосредующего эти эффекты.
Рисунок 1: Миграция нейтрофилов в раны вентральных плавников. (A) (Слева) Карикатура на личинку 3 dpf, показывающая расположение каудальной кроветворной ткани (CHT), циркуляцию Венеры (VC, синий), вентральный плавник (VF) и место раны. (Справа) Карикатура, изображающая область раны (W) с нейтрофилами, мобилизующимися из CHT и группирующимися на ране. Сплетение каудальной вены (CVP) ткани CHT рисуется синим цветом. (B) Изображение яркого поля (слева) и конфокальная проекция (справа), показывающее рану брюшного плавника и распределение нейтрофилов в личинках Tg(mpx:GFP) через 2 ч после ранения. Пунктирные линии показывают контуры VF и CHT. Шкала шкалы = 25 мкм. Мультяшное и флуоресцентное изображение, измененное из ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Живая визуализация трафика хемокиновых рецепторов в нейтрофилах. (A) Конструкции, используемые для нейтрофильной трансгенной экспрессии Cxcr1-FT (флуоресцентный таймер) и Cxcr2-FT. Конфокальные проекции нейтрофилов в головке трансгенной личинки 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), сверху; Tg(lyz:Cxcr2-FT), внизу), показывающий каналы tRFP (пурпурный) и sfGFP (зеленый). Шкала bar = 20 мкм. (B) Анатомическая схема 3 dpf личинки, как показано на рисунке 1A. Ниже личинки находятся схемы, изображающие область раны (W) с нейтрофилами, мобилизуемыми из CHT (вверху) или выполняющими хемотаксис при входе в вентральный плавник (нижний). Пунктирный квадрат обозначает область, изображенную на снимках справа. (C) Нейтрофилы в личинках Tg(lyz:Cxcr1-FT) (показано sfGFP) при мобилизации от CHT (верхние панели) или хемотаксиса к ране (нижние панели). Стрелки показывают одни и те же ячейки с течением времени. Временные точки на правом изображении — это минуты, прошедшие после изображения слева. Шкала = 10 мкм. (D) Схематическое представление экспериментального подхода для живой визуализации трафика хемокиновых рецепторов. Панели А-С изменены по сравнению со ссылкой 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Примеры количественной оценки динамики рецепторов. Одиночные (синие) или кластеризованные нейтрофилы (зеленый) в ранах или немобилизованные нейтрофилы в CHT (красный, оранжевый) были сегментированы и проанализированы различными методами для сравнения результатов. Те же примеры показанных клеток были проанализированы двумя методами, чтобы связать то, что видно на изображении, с диапазоном извлеченных значений. (A) Поверхность выбранных, примерных ячеек была сегментирована на основе определения контура в канале sfGFP. (B) Контраст был вычислен из примера клеток, показанного в A. (C) Мембрана выбранных, примерных ячеек была сегментирована на основе определения контура в канале CFP. Затем последовал ратиометрический анализ sfGFP/CFP. (D) Соотношение sfGFP/CFP было рассчитано на примерах ячеек, показанных в C. Полосы ошибок представляют собой S.E.M. из отдельных ячеек, в случаях n>1 значения здесь использовались не для статистического анализа, а просто для иллюстрации измерений, полученных с помощью различных методов количественной оценки. Шкала шкалы = 10 мкм. Рисунок изменен по сравнению со ссылкой 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Дифференциальная динамика Cxcr1 и Cxcr2 в ответ на ранение. (A) Конфокальная проекция нейтрофилов в личинках Tg(lyz:Cxcr1-FT) или Tg(lyz:Cxcr2-FT) на рану через 80 мин после ранения (показан канал sfGFP). Шкала шкалы = 10 мкм. (B) Увеличенный нейтрофил Cxcr1-FT (слева) и Cxcr2-FT (справа) на ране. Зеленый рецептор показан серым цветом. Шкала бара = 5 мкм. (C) Нормализованный контраст (контраст на отдельный нейтрофил, нормализованный до среднего контраста немобилизованных клеток в CHT). cxcl8a относится к введению сращивания-блокирующего вместе с трансляционно-блокирующим морфолино для cxcl8a. cxcl8b относится к инъекциям с блокирующим сращивание морфолино для cxcl8b. Для Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 клетки (CHT), n=47 клеток (рана) из 8 личинок. Для Tg(lyz:Cxcr1-FT) с морфолинами: n=28 клеток (Cxcl8a-MO) из 5 личинок, n=16 клеток (Cxcl8b-MO) из 5 личинок. Для Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 клеток (CHT) и n=20 клеток (рана) из 3 личинок. Данные были объединены из независимых личинок, полученных в течение 1-5 сеансов визуализации. Тест Крускала-Уоллиса с тестом множественных сравнений Данна для Tg(lyz:Cxcr1-FT), двуххвостый непарный тест Манна-Уитни для Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Конфокальная проекция нейтрофилов в трансгенных личинках Tg(lyz:Cxcr1-FT), обработанных cxcl8a morpholino (MO) (слева) и cxcl8b MO (справа), реагируя на раны плавников (канал sfGFP показан зеленым цветом). Снимок, сделанный в моменты эквивалентного накопления нейтрофилов (85 мин после ранения на левом изображении и 45 мин после ранения на правом изображении). Шкала шкалы = 10 мкм. Рисунок изменен по сравнению со ссылкой 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ хемокинового ответа у ранних эмбрионов. Лазерное сканирование конфокальных срезов гаструлирующих эмбрионов, показывающих экспрессию и распределение Cxcr1-FT. 100 пг мРНК Cxcr1-FT вводили в одну яйцеклетку клеточной стадии с мРНК Cxcl8a или без нее. Зеленые и красные рецепторы показаны в отдельных каналах. Маркер CFP управляющей мембраны (mCFP) показан в голубом канале. Шкала бар = 20 мкм. Рисунок изменен по сравнению со ссылкой 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный фильм 1: Трансгенные нейтрофилы в головке личинки Tg(lyz:Cxcr1-FT) (слева) и Tg(lyz:Cxcr2-FT) (справа) при 3 dpf. sfGFP (зеленый), tagRFP (пурпурный). Интервал кадров составляет 30 сек, а частота кадров - 5 кадров в секунду. Шкала бар = 20 мкм. Видео взято из ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный фильм 2: Нейтрофилы у Tg(lyz:Cxcr1-FT) (слева) и Tg(lyz:Cxcr2-FT) (справа) трансгенных личинок реагируют на раны плавников. Фильм начинается в течение 10 минут после ранения и длится 60 минут. sfGFP (зеленый), tagRFP (пурпурный). Интервал кадров составляет 30 сек, а частота кадров - 10 кадров в секунду. CHT = каудальная кроветворная ткань. VF = брюшной плавник. Шкала шкалы = 25 мкм. Видео взято из ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный фильм 3. Дополнительные примеры нейтрофилов из раненой трансгенной личинки Tg(lyz:Cxcr1-FT) (отличающейся от той, что показана на Видео 2), приобретенных с более высоким разрешением, показывающих интернализацию рецепторов (канал sfGFP показан зеленым цветом) при мобилизации в CHT или при входе и хемотаксисе в вентральном плавнике. Интервал кадров составляет 30 сек, а частота кадров - 2 кадра в секунду. Шкала шкалы = 10 мкм. Видео взято из ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный файл 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 4: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Описанный способ позволяет в реальном времени визуализировать динамику рецепторов в ответ на эндогенные лиганды in situ во время воспалительной реакции на повреждение тканей. Использование нейтрофильных репортеров Cxcr1 /Cxcr2 может быть распространено на другие физиологические условия, такие как инфекция, модели опухолей или другие типы повреждения тканей 14,25,26,27. Кроме того, трансгенные спасательные линии, в которых эндогенный рецептор подавляется и спасается экзогенным мутантным рецептором, могут предоставить полезные инструменты для анализа важности специфических моделей миграции нейтрофилов в иммунных реакциях. Например, мутанты рецепторов Cxcr1, которые имеют нарушенную десенсибилизацию, вызывают более заметную кластеризацию нейтрофилов в воспалительных участках14. Это усиление фенотипа функции может быть использовано для понимания роли конгрегации нейтрофилов в различных физиологических процессах, например, заживление ран, инфекционные заболевания или эволюция опухоли, а также в экспериментах по нокдауну / нокауту рецепторов комплемента. Методология также обеспечивает основу для расширения круга имеющихся репортеров. Выбор флуоресцентного репортера важен для рассмотрения и зависит от биологического вопроса. Мы обнаружили, что конститутивный оборот этих хемокиновых рецепторов в нейтрофилах был высоким по сравнению с эпителиальными клетками, и что репортеры с быстрым созреванием (например, sfGFP) должны были сообщать об уровнях мембраны в устойчивом состоянии и разрешать различия при стимуляции нейтрофилов 8,14. Таким образом, мембранные соотношения sfGFP/tagRFP неприменимы для измерения лиганд-индуцированной интернализации в этом типе клеток, но паттерн tagRFP позволяет отслеживать внутриклеточные судьбы рецептора, что может быть полезно в некоторых исследованиях. Мы также обнаружили, что более концентрированный внутриклеточный сигнал tagRFP полезен для скрининга отдельных личинок. Альтернативный подход к измерению уровней рецепторов на плазматической мембране заключается в совместной экспрессии флуоресцентного мембранного маркера в нейтрофилах либо в том же трансгене9, либо в независимом трансгене14. В первом сценарии трансген обеспечит дополнительные средства для скрининга рыбы, и уровни экспрессии будут сопоставимы между маркером и рецептором. Последний подход будет более модульным, поскольку линия рыбок данио с рецепторным репортером может быть объединена с различными репортерными линиями. В любом случае, стоит отметить, что мембранная количественная оценка уровней рецепторов является сложной задачей в кластеризованных нейтрофилах (см. Ниже). Наконец, мы отмечаем, что возможным расширением этого протокола было бы наблюдение за живой визуализацией с помощью иммуногистохимии для более детального анализа локализации.
Система трансгенеза Tol2 хорошо зарекомендовала себя7, а промотор лизоцима С широко использовался для экспрессии нейтрофилов11,15. Таким образом, подход трансгенеза относительно прост, и уровень экспрессии, достигнутый с помощью этого промотора, достаточно высок, чтобы обеспечить достаточный контраст для анализа динамики рецепторов. Возможным ограничением является то, что уровень экспрессии не повторяет уровни экспрессии эндогенных рецепторов. Новые технологии CRISPR могут быть развернуты для создания линий детонации для рецепторов, представляющих особый интерес28. Эти технологии по-прежнему громоздки и могут не гарантировать требуемые уровни экспрессии для субклеточной визуализации, но их успешное развитие станет важным прорывом для понимания динамики эндогенной сигнализации. Функциональные валидации важны для интерпретации данных с трансгенными рецепторными конструкциями. Например, анализы распознавания лигандов могут быть использованы для установления того, что флуоресцентный слитый белок функционален, а спасение нокаутных фенотипов может быть использовано для установления того, что уровни экспрессии трансгенных нейтрофилов совместимы с функциональностью14. Наконец, более прямым способом подтверждения слияния рецепторов было бы использование функционального анализа in vitro с меченым рецептором наряду с немаркированными версиями14.
Подход к количественной оценке решает конкретные трудности в точной сегментации мембран в нейтрофилах in vivo. В клетках эпителиальной природы количественная оценка уровней рецепторов может быть выполнена автоматически путем нормализации уровней мембранных рецепторов до контрольного маркера, который может быть экспрессирован в тандеме или отдельно9. Действительно, мы применили такой подход при использовании анализа распознавания лигандов при гаструлировании эмбрионов14. Однако нейтрофилы претерпевают сложные, быстрые изменения формы клеток in vivo, что затрудняет сегментацию мембран как в 2D, так и в 3D14. Это еще более сложно, когда нейтрофилы группируются, что происходит во многих физиологических условиях29. Метрика контраста преодолевает это ограничение, поскольку она не требует сегментации мембраны, а вместо этого отражает общее состояние распределения рецепторов в клетке (мембранное / гладкое против везикулярного / точечного). Важно отметить, что на метрику контрастности может влиять общая контрастность изображения, поэтому нормализация значений отдельных клеток к внутренней ссылке необходима для учета изменчивости сигнала у разных эмбрионов / образцов. Например, мы использовали среднее значение клеточного контраста нечувствительных нейтрофилов в CHT (т.е. нейтрофилов, которые остаются неподвижными и не мигрируют в вентральный плавник)14. Дополнительной возможностью будет нормализация с контрастностью значений контрольного маркера в той же ячейке. Это обеспечит решение, когда внутренняя ссылка на не отвечающие клетки недоступна, и, вероятно, может разрешить более тонкие количественные различия в динамике рецепторов между различными условиями.
Местоположение изображения является еще одной переменной, которую следует учитывать. Причина выбора раны брюшного плавника здесь, в отличие от более часто используемой раны хвостового плавника модели16,30, заключается в том, что место ранения находится рядом с местом проживания нейтрофилов / мигрирующего происхождения. Это ускоряет временную шкалу анализа, так как для прибытия нейтрофилов требуется относительно мало времени. Кроме того, он дает возможность фиксировать поведение клеток как в начале миграции (CHT), так и в целевом месте, представляющем интерес (рана). Это актуально и здесь, потому что пространственное и временное разрешение, необходимое для субклеточной визуализации, трудно сочетать с большим полем зрения или многопозиционным сканированием. Таким образом, раневой анализ вентрального плавника позволяет отслеживать эволюцию миграционного ответа от происхождения миграции и одновременно захватывать неспецифические колебания рецепторов в клетках, которые не реагируют. Как упоминалось выше, последнее полезно для целей количественной оценки, поскольку оно обеспечивает внутреннюю ссылку на неконкретную динамику. В других системах может оказаться невозможным иметь такую внутреннюю привязку, и в этом случае значения контраста совместно экспрессированного мембранного маркера обеспечат альтернативный контроль.
Таким образом, мы ожидаем, что методология применима к другим системам и может быть развернута для различных целей. Например, те же репортеры могут быть использованы в других воспалительных условиях, таких как инфекции или другие модели заболеваний. Репертуар репортерных линий рецепторов рыбок данио может быть расширен на другие сигнальные рецепторы, чтобы понять сигнальные механизмы или сообщить о динамике лигандов in vivo. Этот подход может быть объединен с методами нокдауна/нокаута для опроса механистической основы наблюдаемой динамики. Например, возмущение экспрессии лиганда может указывать на зависимость лиганда от наблюдаемой динамики рецепторов. В будущем мы предполагаем, что эта система может быть доработана, с тем чтобы включить в нее вставку репортеров. В конечном счете, результаты, использующие эту методологию, предоставят новые идеи, ценные за пределами сообщества рыбок данио, учитывая сохранение этих сигнальных рецепторов у млекопитающих и относительную проблему проведения этих исследований на более крупных организмах.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Acknowledgments
Мы благодарим Кристин Холт и Билла Харриса за помощь в конфокальной микроскопии. Мы благодарим Даррена Гилмора за флуоресцентные конструкции основы таймера и Анну Хаттенлохер за вектор магистрали Tol2-Lyz. Мы благодарим Стива Реншоу за линию Tg(mpx:GFP)i114 . Эта работа была поддержана MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Исаак Ньютон Траст [12.21(a)i] и грант Исаака Ньютона Траст 19.23(n). C.C. был поддержан студенческим курсом MRC DTP и частично Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Грант Исаака Ньютона [12.21(a)i]. H.W. был поддержан MRC DTP Studentship. H.P. был поддержан грантом Wellcome Trust PhD (105391/Z/14/Z) и частично Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Грант Isaac Newton Trust [12.21(a)i] и грант MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
- Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
- Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
- Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).
- Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
- Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
- Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
- Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).
- Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Chan, T. F., Vese, L. A. Active contours without edges. IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).
- Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
- Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).
