Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Published: September 20, 2020 doi: 10.3791/61680
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een methode om niveaus en lokalisatie van specifieke RNA's op het niveau van één cel nauwkeurig te kwantificeren. Hier rapporteren we onze gevalideerde laboratoriumprotocollen voor natte-bench verwerking, beeldvorming en beeldanalyse voor eencellige kwantificering van specifieke RNA's.

Abstract

Gentranscriptie is een essentieel proces in de celbiologie en stelt cellen in staat om interne en externe signalen te interpreteren en erop te reageren. Traditionele bulkpopulatiemethoden (Northern blot, PCR en RNAseq) die mRNA-niveaus meten, missen het vermogen om informatie te verstrekken over cel-naar-celvariatie in reacties. Nauwkeurige single cell en allelische visualisatie en kwantificering is mogelijk via single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH). RNA-FISH wordt uitgevoerd door doel-RNA's te hybridiseren met gelabelde oligonucleotidesondes. Deze kunnen worden afgebeeld in modaliteiten met een gemiddelde / hoge doorvoer en bieden, via beeldanalysepijplijnen, kwantitatieve gegevens over zowel volwassen als ontluikende RNA's, allemaal op het niveau van één cel. De fixatie-, permeabilisatie-, hybridisatie- en beeldvormingsstappen zijn gedurende vele jaren in het laboratorium geoptimaliseerd met behulp van het hierin beschreven modelsysteem, wat resulteert in een succesvolle en robuuste eencellige analyse van smFISH-etikettering. Het belangrijkste doel met monstervoorbereiding en -verwerking is om beelden van hoge kwaliteit te produceren die worden gekenmerkt door een hoge signaal-ruisverhouding om valse positieven te verminderen en gegevens te leveren die nauwkeuriger zijn. Hier presenteren we een protocol dat de pijplijn beschrijft van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse in combinatie met suggesties en optimalisatiestappen om aan te passen aan specifieke monsters.

Introduction

Gentranscriptie en translatie zijn de twee belangrijkste processen die betrokken zijn bij het centrale dogma van de biologie, gaande van de DNA-sequentie tot RNA tot eiwit1. In deze studie richten we ons op de productie van boodschapper-RNA (mRNA) tijdens transcriptie. Het ontluikende RNA-molecuul omvat zowel niet-coderende introns als coderende exonen. Introns worden co-transcriptioneel uitgesplitst voordat het mRNA in het cytoplasma gaat voor translatie op de ribosomen2,3.

Traditioneel wordt de meting van mRNA uitgevoerd in bulkpopulaties van cellen (honderden tot miljoenen) met klassieke assays zoals RT-qPCR of Northern blotting. Hoewel zeer krachtig, zijn deze methoden beperkt omdat ze geen inzicht geven in cel-tot-celvariatie (fenotypische heterogeniteit), identificatie van het aantal transcriptioneel actieve allelen en, misschien nog belangrijker, gebrek aan ruimtelijke informatie. Meer recent begonnen genoombrede technologieën die RNA-sequencing met één cel (RNAseq) mogelijk maakten, de kloof tussen beeldvormingsmethoden en sequencing te overbruggen4. RNAseq heeft echter last van relatief lage detectie-efficiënties en de verwerkingsstappen resulteren in volledig verlies van ruimtelijke informatie5. Hoewel eencellige RNAseq inzicht kan geven in fenotypische heterogeniteit onder een populatie van isogene cellen, kan RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) een completere verkenning van doelgenexpressie op ruimtelijk niveau en op een allel-per-allel basis6,7.

RNA FISH is een techniek die de detectie en lokalisatie van doel-RNA-moleculen in vaste cellen mogelijk maakt. In tegenstelling tot eerdere, bewerkelijke methoden, maakt de huidige state-of-the-art RNA-FISH gebruik van commercieel beschikbare nucleïnezuursondes die complementair zijn aan de doel-RNA-sequenties, en deze sondes hybridiseren naar hun doelen door Watson-Crick base pairing8. De vroege in situ hybridisatietechnieken betroffen een soortgelijk protocol dat in 1969 door Gall en Pardue werd vastgesteld, omdat een monster werd verwerkt met nucleïnezuursondes die specifiek hybridiseerden tot een doel-RNA9. Oorspronkelijk werd de test uitgevoerd met behulp van radioactieve of colorimetrische detectie; echter, in de jaren 1980, de ontwikkeling van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) protocollen voor DNA FISH en later RNA FISH opende de weg naar meer gevoelige detectie, en het potentieel voor multiplexing10,11.

Verdere ontwikkelingen in RNA FISH hebben geleid tot het vermogen om enkele RNA-moleculen (smFISH) te detecteren en te kwantificeren12,13. Directe detectie is een methode waarbij de sondes zelf worden gelabeld met fluoroforen. Een uitdaging met smFISH is dat er behoefte is aan voldoende hybridiserende sondes /target om de detectie van fluorescerende signalen als afzonderlijke, diffractie-beperkte plekken te vergemakkelijken. Om dit probleem aan te pakken, kan men een sondeset van korte enkelstrengs DNA-oligonucleotiden gebruiken die complementair zijn aan verschillende regio's van hetdoel-RNA 8,12,14. De binding van meerdere sondes verhoogt de lokale fluorofoordichtheid, waardoor het RNA zichtbaar wordt als een afzonderlijke, hoge intensiteitsvlek door fluorescentiemicroscopie. Deze methode is voordelig omdat off-target binding van oligonucleotiden in de probe set pool kan worden onderscheiden van het echte RNA-spotsignaal door kwantitatief de spotgrootte en -intensiteit te analyseren om onderscheid te maken tussen echt signaal en valse oligonucleotidebinding, waardoor een nauwkeurigere analyse wordt vergemakkelijkt door valse positieven te verminderen12.

Alternatieve methoden om mRNA te detecteren zijn de klassieke BAC-kloon-gebaseerde nick-translatiemethode en het meer recent ontwikkelde vertakte DNA-systeem. In de BAC-gekloonde, nick-translatiemethode wordt het te labelen DNA enzymatisch geknepen en wordt een nieuw nucleotide toegevoegd aan het blootgestelde 3'-uiteinde. De activiteit van DNA-polymerase I voegt een gelabeld nucleotide toe, wat resulteert in de gewenste sonde15,16. De vertakte DNA-techniek omvat oligonucleotide-sondes die in paren hybridiseren naar RNA-doelen en deze sondes worden versterkt met behulp van meerdere signaalversterkingsmoleculen. Deze methode kan de signaal-ruisverhouding aanzienlijk verbeteren, maar de versterking kan de nauwkeurige kwantificering scheeftrekken, omdat fluorescerende vlekken enorm kunnen verschillen in grootte en intensiteit17.

Als een modelsysteem voor dit protocol, dat volledig wordt gebruikt als onderdeel van de niehs Superfund Research Program-deelname om de effecten van hormoonontregelende chemicaliën in Galveston Bay / Houston Ship Channel te kwantificeren, gebruikten we de oestrogeenreceptor (ER) positieve borstkankercellijn MCF-7 die 's nachts werd behandeld met een ER-agonist, 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 reguleert veel ER-doelgenen, waaronder het prototypische ER-doelgen, GREB17,20,21,22. Het hier beschreven smFISH-protocol maakt gebruik van een set van twee spectraal gescheiden sondesets gericht op GREB1; een die hybridiseert naar exonen en de andere naar introns, waardoor zowel volwassen als ontluikend RNA kan wordengemeten 7. Vervolgens gebruiken we epifluorescentiemicroscopie in combinatie met deconvolutie om smFISH-gelabelde monsters in beeld te brengen en passen we vervolgens beeldanalyseroutines toe om het aantal actieve allelen en volwassen RNA's per cel te kwantificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Om optimale resultaten te garanderen, vereist het natte laboratoriumgedeelte van dit protocol standaard RNase-vrije voorzorgsmaatregelen bij alle stappen. Zo wordt het gebruik van gefilterde pipetpunten, steriele vaten en RNase-vrije buffers sterk aangemoedigd. Het gebruik van RNase-remmers zoals vanadyl ribonucleoside-complexen wordt ook voorgesteld, vooral voor doel-RNA's met een lage abundantie.

1. Celcultuur en experimentele opstelling

  1. Onderhoud adherent MCF-7 borstkankercellen (ATCC #HTB-22) in een T75 weefselkweekkolf met fenol-rood vrij (alleen nodig voor hormoonstimulatie-experimenten) Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1 nM natriumpyruvaat, 50 I.U./ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine.
  2. Plaats zuur-geëtste, poly-D-lysine gecoate ronde coverslips (0,16 tot 0,19 mm dik, 12 mm diameter) in een 24 multiwell weefselkweekplaat.
    OPMERKING: Gebruik 1 M HCl om de coverslips te zuur-etsen en te coaten met een 1 mg / ml oplossing van poly-D-lysine gereconstitueerd in steriel PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder Ca++ en Mg++) volgens standaardprotocollen.
  3. Verwijder de groeimedia uit de cellen en was eenmaal met 5 ml steriel PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder Ca++ en Mg++). Maak MCF-7-cellen los met behulp van 2-3 ml Trypsine-EDTA 0,25% oplossing. Zodra de cellen zijn losgemaakt, neutraliseert u de Trypsine-EDTA 0,25% oplossing met een gelijk volume groeimedia.
  4. Breng de cellen in de mediasuspensie over naar een conische buis van 15 ml, draai gedurende 1 minuut met 391 x g naar beneden om de cellen te pelleteren. Verwijder de media voorzichtig uit de conische buis zonder de celkorrel te verstoren en resuspend de cellen in een geschikte hoeveelheid behandelingsmedia.
    OPMERKING: Behandelingsmedia zijn fenol-roodvrije DMEM aangevuld met 5% houtskool-dextran gestript en gedialyseerd FBS, 2 mM L-glutamine, 1 nM natriumpyruvaat, 50 I.U./ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine. Deze media is essentieel voor steroïde hormoonstimulatie-experimenten omdat de serumcomponent grotendeels is uitgeput van steroïden door houtskool die de media stript en de groeifactoren via dialyse heeft verminderd.
  5. Zaai de cellen op coverslips in de 24 multiwell-plaat met 60.000 tot 70.000 cellen per put in 500 μL behandelingsmedia. Voor dit experiment moet de celconfluentie ongeveer 70-80% zijn bij aanvang van de behandeling. Optimaliseer de celzaaidichtheid afhankelijk van het celtype, de groeisnelheid en de lengte van het experiment om samenloop te voorkomen, wat beeldanalyse bemoeilijkt.
    OPMERKING: Voor de beste beeldvorming en beeldanalyse, vermijd celklonteren. Meng hiervoor de aliquot van cellen grondig door de cellen een paar keer te pipetteren (of kort te vortexen) voordat ze in de putten terechtkomen. Voordat u de vergulde cellen terug in de incubator plaatst, helpt het laten bezinken van de cellen in de weefselkweekkap gedurende ongeveer 20 minuten om het klonteren van cellen te verminderen.
  6. Incubeer cellen gedurende ten minste twee dagen voorafgaand aan de behandelingen om celcyclussynchronisatie en achtergrondreductie te garanderen als gevolg van signaalmoleculen die achterblijven in het gestripte / gedialyseerde serum van groeimedia.
  7. Behandel NA een incubatie van 48 uur in behandelingsmedia MCF-7-cellen met 10 nM 17β-oestradiol (E2) en voertuigcontrole (DMSO), verdund in behandelingsmedia gedurende 24 uur. Deze behandeling maakt gebruik van een verzadigde dosis E2 om een maximale respons te induceren. Voer tijds- en dosis-responsexperimenten uit om empirisch de voorwaarden voor verschillende doelgenen, celmodellen en type behandelingen te bepalen. Zie als voorbeeld onze recente publicatie7.

2. Voorbereiding van buffers

  1. Om de fixatiebuffer voor te bereiden, verdunde gezuiverde, monomere formaldehyde (verkocht door leveranciers van elektronenmicroscopie als 16% paraformaldehyde) tot 4% in steriel PBS Ca++/ Mg++ (fosfaat-gebufferde zoutoplossing plus Ca++ en Mg++). Voeg vanadyl ribonucleoside complexen (VRC) toe aan de fixatiebuffer voor een eindconcentratie van 2 mM om de afbraak van RNA te vertragen.
    1. Bereken de totale hoeveelheid fixatiebuffer op basis van 300-500 μL fixatief per put van een 24 multiwell-plaat. Bewaar de 4% formaldehyde op ijs totdat het nodig is in de fixatiestap.
      OPMERKING: Maak de fixatiebuffer voor elk experiment nieuw.
      LET OP: Formaldehyde is een teratogeen dat door de huid wordt opgenomen. Gebruik deze chemische stof in een zuurkast samen met geschikte PBM's volgens uw institutionele voorschriften.
  2. Bereid voor de permeabilisatiestap 70% ethanol in nucleasevrij water. Een alternatieve optie is 0,5% Triton-X100 in steriel PBS Ca++/Mg++ plus 2 mM VRC. Bereken de totale hoeveelheid permeabilisatiebuffer die nodig is door 500 μL buffer per put te gebruiken.
  3. Om 9 ml van de hybridisatiebuffer te bereiden, voegt u 2 ml bouillon 50% dextransulfaat en 1 ml 20x SSC (zout natriumcitraat) buffer toe aan 6 ml nucleasevrij water. Vortex om de hybridisatiebuffer grondig te mengen. Deze buffer kan maximaal een week bij 4 °C bewaard worden.
  4. Er zijn vijf afzonderlijke wasstappen die 2x zout natriumcitraat (SSC) buffer vereisen. Bereken het uiteindelijke volume van 2x SSC-buffer dat nodig is door te anticiperen op 500 μL buffer per coverslip per wasstap. Verdun de benodigde hoeveelheid bouillon 20x SSC buffer in nucleasevrij water. 2 mM VRC kan als extra voorzorgsmaatregel worden toegevoegd aan wasstappen. Deze buffer kan bij kamertemperatuur worden bewaard voor de duur van de verwerkingsstappen.

3. Fixatie voor RNA FISH

  1. Verwijder na de behandeling de media uit de putten en was eenmaal met steriele, koude PBS Ca++/ Mg++. Als een celmodel met lage hechting wordt gebruikt, gebruik dan geen vacuüm om vloeistof op te zuigen; gebruik handmatig pipetteren om media voorzichtig van de zijkant van de put te verwijderen en de eerste wasstap weg te laten. Voeg 500 μL fixatiebuffer gedurende 30 minuten toe op ijs.
    OPMERKING: Als het monster gevoelig is voor RNA-degradatie, gebruik dan steriel PBS met 2 mM VRC voor de wasstap op dit punt.
  2. Verwijder fixatief en gooi het in chemisch afval volgens institutionele voorschriften. Was de cellen tweemaal met koud steriel PBS Ca++/ Mg++ gedurende 3 minuten.
  3. Verwijder PBS en voeg 500 μL 70% ethanol toe aan elke put. Sluit de 24 putjesplaat af met een paraffine plastic folie. Plaats op een rotator bij 4 °C gedurende ten minste vier uur. Het is het beste om de monsters een nacht in 70% ethanol te laten zitten. Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd en de monsters kunnen maximaal een week worden bewaard in 70% ethanol.
    OPMERKING: Een 0,5% Triton-X100 in PBS met 2 mM VRC-oplossing kan als alternatief worden gebruikt. Incubeer de monsters in 500 μL van deze permeabilisatiebuffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een rotator. Als u deze permeabilisatiebuffer gebruikt, kan het protocol op dit moment niet worden gepauzeerd en moet het doorgaan met de hybridisatiestap.

4. Hybridisatie voor RNA FISH

  1. Verwijder de permeabilisatiebuffer en was eenmalig in 500 μL 2x SSC-buffer plus 10% formamide gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.
  2. Bereid de volledige hybridisatiebuffer voor. Bereken ongeveer 30 μL volledige hybridisatiebuffer per coverslip. Voeg formamide toe aan de hybridisatiebuffer om het benodigde percentage te bereiken. Als bijvoorbeeld 500 μL volledige hybridisatiebuffer nodig is, dan zou deze bestaan uit 450 μL van de eerder gemaakte hybridisatiebuffer plus 50 μL formamide van moleculaire kwaliteit om 10% vol / vol te bereiken. Vortex kort te mengen.
    LET OP: Formamide is een teratogeen dat door de huid wordt opgenomen. Gebruik deze chemische stof in een zuurkast samen met geschikte PBM's volgens de institutionele voorschriften.
  3. Verdun de GREB1 intron (gelabeld met Atto 647N) en GREB1 exon (gelabeld met Quasar 570) sondes 1:300 in hybridisatiebuffer. Meng via pipetteren. Bescherm deze buffer tegen licht en direct te gebruiken.
    OPMERKING: De sondes zijn ontworpen en vervaardigd zoals beschreven in Stossi et al7. De sondes worden meestal geleverd als een gedroogde oligonucleotide sondepool die moet worden gereconstitueerd in RNAse-vrije TE-buffer volgens het protocol van de fabrikant14. De voorraadoplossing voor deze sondes was dus 12,5 μM; de werkconcentratie van de sondes is 42 nM.
  4. Bereid een bevochtigingskamer voor op de nachtelijke hybridisatiestap. Leg een stuk paraffine plastic film, onbelicht met de zijkant naar boven, neer in een glazen petrischaal die is gereinigd met een oppervlakteontsmettingsmiddel om RNases te verwijderen. Verzadig twee papieren handdoeken met steriel water en plaats ze langs de randen van de petrischaal om vocht te bieden, omdat drogen specifieke etikettering kan vernietigen.
  5. Aliquot de sondes door 30 μL sondes in hybridisatiebuffer op de schone kant van de paraffine plastic film te stippelen. Verdeel de aliquots van sondes zodat de coverslips niet met elkaar in contact komen.
  6. Gebruik een gesteriliseerde tang om de coverslips cel voorzichtig naar beneden te draaien op de sondes in de glazen petrischaal. Vermijd luchtbellen en oefen geen druk uit op de coverslips.
    OPMERKING: Gooi de weefselkweekplaat met de 2x SSC-buffer niet weg, omdat dit nodig is voor volgende stappen.
  7. Sluit de glazen petrischaal af met paraffine plastic film en bedek de plaat met folie om blootstelling aan licht aan de fluoroforen te voorkomen. Incubeer 's nachts, tot 16 uur, bij 37 °C op een vlak, niet-roterend oppervlak. De incubatietijd kan empirisch worden gevarieerd, maar een minimum van 4 uur wordt aanbevolen.
    OPMERKING: De coverslips zijn gevoelig voor glijden tijdens het broeden in de hybridisatiebuffer, wat kan leiden tot droge plekken op de coverslip en het monster kan beschadigen.

5. Monsters voorbereiden voor beeldvorming

  1. Verwijder de volgende dag de dekplaten uit de bevochtigingskamer met een tang en breng ze terug naar de 24-putplaat met de celzijde naar boven. Voeg 500 μL verse 2x SSC-buffer plus 10% formamide toe om overtollige sonde en niet-specifieke hybridisatie uit te spoelen.
    OPMERKING: Bescherm de monsters vanaf dit punt tegen licht.
  2. Was de cellen tweemaal met 500 μL 2x SSC-buffer plus 10% formamide gedurende 15 minuten elk bij 37°C op een verwarmde rotator.
  3. Counterstain DNA met DAPI bij 1 μg/ml in 2x SSC-buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.
  4. Was eenmalig met 2x SSC buffer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
  5. Monteer de coverslips op glazen platen met behulp van niet-uithardende montagemedia na het verwijderen van overtollige 2x SSC-buffer met een papieren handdoek en een snelle wasbeurt in nucleasevrij water om overtollige zouten te elimineren. Sluit tot slot de coverslips af met doorzichtige nagellak.

6. Hoge resolutie microscopie en beeldverwerking

  1. Stel de monsters voor op een wide-field epifluorescentiemicroscoop met behulp van een 60x of 100x olie objectief en een sCMOS camera. Zie de tabel met materialen voor de specifieke microscoop en het objectief dat voor dit experiment is gebruikt.
    1. Volledige beeldvorming zodra de monsters volledig zijn verwerkt om tijdsafhankelijke degradatie van het signaal te voorkomen.
      OPMERKING: In dit experiment wordt dompelolie met een brekingsindex (RI) van 1,516 gebruikt. Empirische tests moeten worden uitgevoerd om de olie-RI af te stemmen op specifieke monsters, omdat RI-mismatches zullen resulteren in aberraties van de puntspreidingsfunctie die de deconvolutie van het beeld zullen beïnvloeden.
  2. Beelden worden vastgelegd met een laterale pixelgrootte van 0,10827 μm.
  3. Optimaliseer de hoeveelheid verlichting van de lichtbron (d.w.z. procentuele transmissie) en belichtingstijden voor elk kanaal (DAPI-, TRITC-, CY5-filters in dit specifieke voorbeeld) met behulp van het monster dat naar verwachting de hoogste intensiteit heeft (d.w.z. positieve controles). In dit experiment wordt verwacht dat het met E2 behandelde monster een hogere intensiteit zal hebben voor beide GREB1-sondesets. Over het algemeen is het percentage transmissie voor GREB1 intron- en exon-sondes 50 - 100% en de belichtingstijden variëren van 0,25 - 0,60 seconden.
  4. Verkrijg bovendien afbeeldingen onder omstandigheden die fotobleeken en / of verzadiging van camerapixels voorkomen. In onze ervaring zou er een minimaal ~ tienvoudig verschil moeten zijn tussen de achtergrond en de signaalintensiteit. Verzadiging van enkele pixels/veld kan optreden als gevolg van niet-specifieke signalen in het monster (d.w.z. vuil op de coverslip, sondeaggregaten buiten de cel), wat aanvaardbaar kan zijn, maar alleen als verzadigde gebieden niet zijn opgenomen in de kwantificering.
  5. Als u de acquisitie van een z-stack wilt instellen, richt u zich op het monster in het DAPI-kanaal. Selecteer de boven- en onderkant van de z-stack op de afstanden waar de DAPI-gekleurde kernen onscherp worden. De z-stack stapgrootte die we gebruikten is 0,25 μm per plak en de totale z-stack moet de hele cel overspannen (ongeveer 10 μm in MCF-7-cellen). De z-stack stapgrootte verandert echter afhankelijk van het gebruikte doel en moet voldoen aan het Nyquist-bemonsteringscriterium.
    OPMERKING: Introns zijn meestal alleen aanwezig in de kern; exonen bevinden zich echter zowel in de kern als in het cytoplasma. Daarom zal het instellen van de z-stack zoals hierboven beschreven het grootste deel van de intron- en exon-labeling vastleggen, aangezien de z-stack de hele cel omvat.
  6. Stel meestal minimaal 200 cellen af voor kwantitatieve analyse in voorlopige experimenten om een momentopname te maken van de omvang van de respons en variatie tussen cellen.
  7. Sommige afgebeelde cellen worden uitgesloten van de uiteindelijke analyse (d.w.z. uitvalpercentage) omdat ze worden gefilterd door de analysepijplijn (d.w.z. cellen die de rand van het beeld raken, apoptotische / mitotische cellen).
    OPMERKING: Bij het selecteren van afbeeldingsgebieden zijn er een paar factoren waarmee u rekening moet houden. Kies gebieden met gelijkmatig verdeelde, niet-overlappende cellen zoals gedefinieerd door DAPI-gelabelde, nucleaire fluorescentie. Probeer bovendien gebieden te selecteren met het minste aantal kernen langs de randen van het afbeeldingsgebied om te voorkomen dat gedeeltelijke cellen worden geteld. Geautomatiseerde, onbevooroordeelde beeldvorming heeft altijd de voorkeur voor experimenten die statistische analyse vereisen.
  8. Na acquisitie deconvolve beelden met behulp van een agressief restauratief algoritme met behulp van 10 cycli (d.w.z. aantal iteraties). Genereer projecties met maximale intensiteit voor beeldanalyse (laat deze stap weg als specifieke 3D-analyse vereist is). Sla alle projectiebeelden op volgens de bitdiepte van de gebruikte camera; in ons geval werden 16-bits TIFF-grijswaardenafbeeldingen opgeslagen. RGB-afbeeldingen hebben een verminderde bitdiepte, wat resulteert in een verlies van informatie; daarom zijn RGB-beelden niet geschikt voor beeldanalyse.

7. Beeldanalyse

  1. Lees de instructies en download de jupyter notebook van github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Installeer Python anaconda distribution (https://www.anaconda.com/distribution/) versie 3.6 of hoger.
  3. Open de anaconda-prompt en typ de installatieopdracht om Simple ITK voor anaconda te installeren (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Open anaconda navigator en start jupyter notebook. Het opent een webbrowser met mappen en bestanden. Blader door de mapstructuren om de map te bereiken die de gedownloade jupyter notebook van github bevat.
  5. Open het notitieblok en voer elke cel uit door tegelijkertijd op Shift en Enter te drukken.
  6. Volg de details van elke functie en stap in het notitieblok. Voor een andere set afbeeldingen moet men mogelijk enkele parameterwaarden wijzigen.
    OPMERKING: In het kort worden kernen gesegmenteerd vanuit het DAPI-kanaal met behulp van lokale drempels met een blokgrootte van 251 pixels, gaten zijn opgevuld en objecten kleiner dan 100 pixels verwijderd. Aanrakende kernen werden gesplitst met behulp van een stroomgebiedalgoritme. Het nucleaire masker werd vervolgens met 100 pixels verwijd en waterscheiding werd gebruikt om aanrakende objecten te scheiden met behulp van kernen als bassins. Om steady state RNA (exonen) te identificeren, werd Otsu thresholding gebruikt; voor transcriptionele actieve allelen (intron) werd eerst een Gaussiaanse vervaging (sigma=1) toegepast en vervolgens werd maximale entropiedrempeling gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om hormonale reacties via smFISH te analyseren, kozen we bijvoorbeeld voor het oestrogeenreceptor (ER) -model dat wordt gebruikt in high throughput-testen om de aanwezigheid van hormoonontregelende chemicaliën bij milieurampen te bepalen in de context van deelname aan het NIEHS Superfund Research Program7. In dit experiment werden adherente MCF-7 borstkankercellen gedurende 24 uur behandeld met de ER-agonist 17β-oestradiol (E2, 10 nM) of voertuig (DMSO). Spectraal gescheiden sondesets tegen GREB1 intronic (Atto 647N, rood in figuur 1)en exonische (Quasar 570, groen in figuur 1) sequentiesmaken gelijktijdige visualisatie en kwantificering van ontluikend en volwassen mRNA mogelijk; belangrijk is het markeren van het aantal transcriptioneel actieve allelen in elke cel waarvan is aangetoond dat het deel uitmaakt van de oestrogeenresponstijd7.

Het voltooide protocol genereert 16-bits TIFF (Maximum Intensity Projections) voor elke interessante regio. Nucleaire segmentatie wordt uitgevoerd met behulp van DAPI-gekleurde kernen en celgrenzen worden geschat door het nucleaire masker uit te breiden. GREB1-intron- en exon-signalen worden vervolgens gesegmenteerd en toegewezen aan elke individuele cel. Figuur 1 toont gedeconvolgeerde maximaal geprojecteerde beelden en hun segmentatie voor een monster behandeld met DMSO en E2.

Figure 1
Figuur 1: smFISH-voorbeeldafbeeldingen en uitvoer van beeldsegmentatie. (A)MCF-7 cellen, behandeld met DMSO (linkerpaneel) en 17β-oestradiol (E2, rechterpaneel) gedurende 24 uur, werden gehybridiseerd om GREB1-introns (Atto 647N, ontluikend mRNA, rood) en GREB1-exonen (Quasar 570, volwassen mRNA, groen) te targeten. Beelden worden verkregen bij 60x/1.42NA, gedeconvoleerd en maximale intensiteit geprojecteerd. (B) Beelden van (A) worden verwerkt door de beschreven beeldanalysepijplijn die het nucleaire masker definieert, het cellulaire masker schat, individuele volwassen mRNA en transcriptioneel actieve allelen identificeert. GREB1 intron- en exon-vlekken worden vervolgens toegewezen aan individuele cellen. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na de beeldanalysepijplijn verkregen we het aantal cellen dat de beeldgrenzen niet raakte op basis van het afbeelden van tien willekeurige velden per behandeling, en er werd vastgesteld dat er 150 dmso-behandelde cellen en 149 met E2 behandelde cellen waren. Aangezien de aneuploïde MCF-7-cellen vier kopieën van het GREB1-gen hebben, en met intron- en exon-sondes, zullen overlappende signalen het aantal allelen en cellen bepalen dat betrokken is bij actieve transcriptie24. We bepaalden de fractie van de celpopulatie voor elke behandeling met nul tot vier actieve GREB1-allelen door overlappende intron- en exonenvlekken te tellen. Net als in onze vorige studie definiëren we transcriptioneel actieve cellen als cellen die twee of meer actieve GREB1-allelenvertoonden 7. Zoals te zien is in figuur 2A-2B,hebben met E2 behandelde cellen een 4-voudig verhoogde fractie cellen die twee of meer actieve GREB1-allelen vertonen in vergelijking met met voertuigen behandelde cellen7.

Figure 2
Figuur 2: Kwantificering van E2-geïnduceerde GREB1 op cel-voor-cel en allel-voor-allel niveau. (A) De verdeling van het aantal actieve GREB1-allelen per cel waarbij met het voertuig (blauwe balken) en E2 (rode staven) behandelde cellen worden vergeleken. (B) Fractie van cellen die als transcriptioneel actief worden beschouwd, hier gedefinieerd als cellen met twee of meer actieve GREB1-allelen7. (C) Verdeling van het aantal GREB1 volwassen mRNA per cel voor elke behandeling. D)Gemiddeld aantal GREB1 volwassen RNA/cellen weergegeven als gemiddelde waarde voor de populatie. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Introns worden gesplitst uit ontluikend mRNA om volwassen mRNA te produceren dat alleen uit exonsequenties bestaat. Daarom is het ook mogelijk om het aantal volwassen mRNA per cel te tellen door het aantal groene vlekken te kwantificeren. Figuur 2C-2D toont de verschuiving in de verdeling van volwassen GREB1 mRNA/cel en de geaggregeerde vouwverandering (20x) in de celpopulatie na E2-behandeling.

In overeenstemming met de oorspronkelijke waarnemingen gedurende 24 uur E2-behandeling, reageren niet alle cellen op dezelfde manier (d.w.z. de reacties zijn heterogeen in de MCF-7-populatie)7. Het aantal volwassen GREB1 mRNA's per cel vertoont bijvoorbeeld een breed expressiebereik (~ 15-voudig) zelfs in de 24-uurs E2-behandelde cellen; bulk RNA-kwantificeringsmethoden slagen er niet in om de brede niveaus van transcriptie in cellen te onderscheiden door statistische middeling. Dit benadrukt de kracht van smFISH om heterogene cel-tot-cel en allel-voor-allel reacties in een populatie van isogene cellen te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven smFISH-methodologie is gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen7,12,14. In dit protocol leggen we de kritieke stappen uit die zijn geoptimaliseerd van het natte laboratorium (inclusief zaaidichtheid, fixatietijd, permeabilisatie en sondeconcentratie), tot beeldvorming en beeldanalyse, waardoor een volledige experimentele pijplijn wordt geboden voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van eencellige analyse van gentranscriptie.

Om de analyse van één cel te vergemakkelijken, is het belangrijk dat de cellen subconfluent zijn en elkaar niet overlappen, zodat celgrenzen worden geschat zonder dat er een celgrens nodig is. We stellen voor om een celproliferatietest te voltooien die een breed scala aan zaaidichtheden omvat voor de duur van het experiment om de celdichtheid te optimaliseren.

Het bepalen van de optimale fixatietijd is van cruciaal belang voor een succesvol smFISH-experiment. We hebben ontdekt dat het fixeren van de monsters met 4% gezuiverd formaldehyde, verdund in steriel PBS met VRC gedurende 30 minuten op ijs, de consistentie van smFISH-beelden van hoge kwaliteit aanzienlijk verbetert, vooral als structurele analyse vereist is via een combinatie van antilichamen tegen factoren van belang. Formaldehyde fixeert monsters door macromoleculen te verknopen en kan cellulaire structuren beter onderhouden dan andere fixatiemethoden zoals die met organische oplosmiddelen25. Voor het specifieke monster moeten echter de fixatietijd en -temperatuur worden aangepast om te voorkomen dat het monster over- of onderbeadigd wordt26. VRC is nuttig omdat het de afbraak van RNA vermindert en vooral nuttig is voor laag overvloedig RNA27. Er zijn twee opties waarmee we succes hebben gehad voor de permeabilisatiestap. De eerste is een 70% ethanol incubatie bij 4 °C en de tweede is een 0,5% Triton-X100 incubatie bijkamertemperatuur 7,14. Het is mogelijk om hetzelfde protocol uit te voeren in hoge doorvoer met behulp van imaging-compatibele multiwellplaten met glazen bodem (96 en 384 putten). Consistent succes bij het uitvoeren van smFISH is afhankelijk van het gebruik van glazen multiwell-platen met behulp van fixatief met VRC en 0,5% Triton-X 100 met VRC voor de permeabilisatiestap. Hoewel optische plastic bodemplaten een optie zijn, is de beeldkwaliteit en het succes aanzienlijk lager.

Een hoge signaal-ruisverhouding is vereist voor eencellige analyse om achtergrondsignalen en valse positieven eruit te filteren en diffractiebeperkte plekken correct te identificeren. Achtergrondsignaal draagt bij aan de intensiteitswaarden van het signaal van belang. Hoge achtergrond komt vaak voort uit suboptimaal experimenteel ontwerp, en hoewel het wordt afgetrokken van fluorescerende intensiteitsmetingen, is het het beste om in eerste instantie de interessegebieden in beeld te brengen met zo min mogelijk achtergrondsignaal28. Een hoog dynamisch bereik, met een minimaal ~ 10-voudig verschil, is vereist om met succes te bepalen of het signaal wordt beschouwd als achtergrond of signaal van belang29. Vals-positieve vlekken verwijzen naar signalen die zich buiten de celgrenzen bevinden, vaak als gevolg van slecht gereinigde coverslips, onvoldoende wassen na hybridisatie of sondeaggregatie die optreedt wanneer sondes zichzelfassociëren 30. Als er niet-specifieke signalen optreedt als gevolg van valse binding van het oligo dat is ingesteld aan RNA's die verschillen van het doel (d.w.z. vanwege pseudogenen of sequentieovereenkomsten), kunnen deze worden geëvalueerd door de sondesets te testen in een model dat het gen van belang niet tot expressie brengt (d.w.z. knock-out MEF's, CRISPR / Cas9 knock-out)31. Bovendien moeten, zoals bij elk fluorescentiemicroscopie-experiment, de intron- en exon-sondes spectraal gescheiden zijn. In ons voorbeeldexperiment kozen we Atto 647N en Quasar 570 kleurstoffen voor de GREB1-sondeset omdat ze compatibel zijn met de specificaties van de filtersets op de gebruikte microscoop, bestand zijn tegen fotobleaching en een relatief hoge kwantumopbrengst hebben8,14,32. Afhankelijk van het monster raden we aan om een verdunningsreeks van de voorraadsonde te maken (meestal een verdunning van 1:200 tot 1:1000, of 12,5 nM tot 62,5 nM) om de beste signaal-ruisverhouding voor elke specifieke sondeset te identificeren. Sommige leveranciers leveren op maat gelabelde sondes met door de gebruiker geselecteerde fluoroforen om de helderheid te verhogen, fotobleaching te verminderen en, indien nodig, extra 1-2 kanalen toe te voegen die algemeen beschikbaar zijn op de meeste moderne fluorescentiemicroscopen7,8,14. Hoewel smFISH de mogelijkheid heeft om RNA met een lage abundantie te meten, is een belangrijk probleem het verhogen van de gevoeligheid en het vermogen om gedeeltelijk afgebroken RNA te detecteren, vooral voor weefselmonsters. Het bereiken van een hogere signaal-ruisverhouding is mogelijk door vertakte DNA-sondes te gebruiken die zijn ontworpen om het signaal te versterken, hoewel we niet hebben ontdekt dat deze aanpak nuttig is in onze studies33. Confocale microscopen gebruiken een gerichte lichtbron om het monster te verlichten en blokkeren onscherp licht om de detectoren te bereiken met een of meer gaatjes. Point-scanning confocale microscopie wordt over het algemeen afgeraden voor RNA-FISH-beeldvorming omdat sondes sneller zullen fotobleken door laserverlichting. Afhankelijk van het monster en de signaalintensiteit kunnen confocale microscopen echter beelden genereren met weinig tot geen signaalverlies8. Hier gebruikten we een breedveld epifluorescentiemicroscoop met een hoge vergroting en een hoog numeriek diafragma objectief om het maximale aantal fotonen te verzamelen dat door de FISH-sondes wordt uitgezonden34. Hoewel beelden kunnen worden vervaagd door onscherp licht uit aangrenzende vlakken van de z-stack, worden herstellende deconvolutie-algoritmen toegepast om computationeel gediffracteerd licht tussen de verworven z-stacks te "herplaatsen" naar het punt van oorsprong34. Dit levert uiteindelijke afbeeldingen met een hoge resolutie op voor beeldanalyse. Indien mogelijk is het het beste om verschillende beeldvormingsmodaliteiten empirisch te vergelijken om het systeem te bepalen dat het beste is voor uw experiment28.

Er zijn veel mogelijke uitbreidingen en toepassingen van smFISH. In ons modelexperiment voltooiden we één ronde van hybridisatie met één set sondes voor het GREB1-gen. Het is echter mogelijk om meerdere rondes smFISH op een sequentiële manier te voltooien (seqFISH)13,35. In deze methode worden de mRNA's in de cel gelabeld door sequentiële rondes van hybridisatie, beeldvorming, probe-stripping en rehybridisatie. Om multiplexing tot op heel transcriptoomniveau enorm te verhogen, zijn barcodingtechnieken ontwikkeld (bijv. MER-FISH)36,37,38. Dit maakt gebruik van een fluorescentie barcode strategie om elk mRNA37, 39uniek te identificeren. Deze technieken zijn aangepast aan weefsels en in combinatie met expansiemicroscopie kan een methode die een monster fysiek uitbreidt met een polymeernetwerk, een verhoogde toegang van sondes tot endogene RNA's36,40,41bieden. MER-FISH maakt het ook mogelijk om de signaalhelderheid van individuele moleculen te verhogen door signaalversterkingstechnieken38. Het protocol dat we hebben beschreven is een proces van twee dagen, maar het is mogelijk om het smFISH-protocol in te korten, zodat de hybridisatie van de sondes naar het doel-RNA in slechts ~ 5 minuten kan plaatsvinden (Turbo-FISH)26. Immunofluorescentie kan worden gecombineerd met smFISH (IF-FISH) om tegelijkertijd eiwitten en mRNA in één monster te detecteren42. Het protocol moet worden geoptimaliseerd voor de FISH-sondes en antilichamen die voor elk experiment worden gebruikt om de afbraak van eiwit- en / of RNA-degradatie in het monster te verminderen, omdat sommige materialen (d.w.z. buffers en fixeermiddelen) niet compatibel zijn voor het verwerken van zowel eiwit als mRNA43. Raadpleeg verschillende publicaties uit ons lab als voorbeelden van succesvolle IF-FISH experimenten naast geoptimaliseerde IF-FISH protocollen7,18.

Tot slot presenteren we een single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) methode die inzicht geeft in single cell heterogeneity en allel-by-allele variatie in response to stimulus. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor het eerder beschreven modelsysteem, bieden we een reeks mogelijke aanpassingen die andere doelgenmodellen kunnen verbeteren7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

MAM, FS en MGM worden gefinancierd door NIEHS (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM en PKS worden ondersteund door het door CPRIT gefinancierde GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719). Beeldvorming wordt ook ondersteund door de Integrated Microscopy Core aan het Baylor College of Medicine met financiering van NIH (DK56338 en CA125123), CPRIT (RP150578), het Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center en het John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Tags

Biochemie Nummer 163 Single molecule FISH beeldvorming beeldanalyse gentranscriptie
Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mistry, R. M., Singh, P. K.,… More

Mistry, R. M., Singh, P. K., Mancini, M. G., Stossi, F., Mancini, M. A. Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH. J. Vis. Exp. (163), e61680, doi:10.3791/61680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter