Strukturelle studier av biomacromolecules av krystallografi krever krystaller av høy kvalitet. Her demonstrerer vi en protokoll som kan brukes av OptiCrys (et helautomatisk instrument utviklet i laboratoriet vårt) og/eller mikroanalyseknapper for dyrking av store krystaller av høy kvalitet basert på kunnskap om krystalliseringsfasediagrammet.
Bruken av nøytron makromolekylær krystallografi (NMX) ekspanderer raskt med de fleste strukturer bestemt i det siste tiåret takket være nye NMX strålelinjer har blitt bygget og økt tilgjengelighet av struktur raffinement programvare. Nøytronkildene som for tiden er tilgjengelige for NMX, er imidlertid betydelig svakere enn tilsvarende kilder for røntgenkrystallografi. Til tross for fremskritt på dette feltet, vil betydelig større krystaller alltid være nødvendig for nøytrondiffraksjonsstudier, spesielt med tendens til å studere stadig større makromolekyler og komplekser. Ytterligere forbedringer i metoder og instrumentering egnet til å vokse større krystaller er derfor nødvendig for bruk av NMX å utvide.
I dette arbeidet introduserer vi rasjonelle strategier og en krystallvekstbenk (OptiCrys) utviklet i laboratoriet vårt som kombinerer sanntidsobservasjon gjennom et mikroskopmontert videokamera med presis automatisert kontroll av krystalliseringsløsninger (f.eks. stupbrakt konsentrasjon, pH, additiv, temperatur). Vi viser deretter hvordan denne kontrollen av temperatur og kjemisk sammensetning letter søket etter optimale krystalliseringsforhold ved hjelp av modellløselige proteiner. Grundig kunnskap om krystalliseringsfasediagrammet er avgjørende for å velge startposisjon og kinetisk bane for ethvert krystalliseringseksperiment. Vi viser hvordan en rasjonell tilnærming kan kontrollere størrelsen og antall krystaller generert basert på kunnskap om flerdimensjonale fasediagrammer.
Å forstå strukturfunksjonsforholdet mellom proteiner og mekanismen for fysiologiske veier er ofte avhengig av å kjenne posisjonene til hydrogenatomer (H) og hvordan ladning overføres i et protein1,2. Siden hydrogenatomer sprer røntgenstråler svakt, kan deres posisjoner bare bestemmes med svært høyoppløselige røntgendiffraksjonsdata (> 1 Å)3,4. Omvendt kan nøytronkrystallografi brukes til å oppnå en nøyaktig posisjon av hydrogenatomer i biologiske makromolekyler som hydrogen og deuterium (H2, isotop av hydrogen) atomer har spredningslengder av omtrent like stor størrelse som oksygen, nitrogen og karbon5. Nøytronfluks fra tilgjengelige nøytronkilder er imidlertid svakere enn for røntgenstråler, så dette må ofte kompenseres for2,3. Dette kan oppnås ved å utveksle H med H2 og/eller øke volumet av krystaller for å redusere usammenhengende spredning av hydrogener og øke signal-til-støy-forholdet mellom diffraksjonsbilder.
Det finnes ulike krystalliseringsmetoder (det tilsvarende skjematiske fasediagrammet er vist i figur 1) for å oppnå store krystaller av høy kvalitet for både røntgen- og nøytronbiomakromolekylær krystallografi6. I dampdiffusjon er en dråpe tilberedt fra en blanding av et protein og en krystalliseringsløsning likevekt over tid, gjennom fordampning av vann eller andre flyktige arter, mot et reservoar som inneholder en høyere konsentrasjon av precipitant av samme krystalliseringsløsning. Økningen i konsentrasjonen av protein og bunnfall i dråpet fører til supermetning som kreves for spontan kjerne etterfulgt av krystallvekst ved disse kjernene6,7. Selv om dampdiffusjon er den mest brukte teknikken for dyrking avkrystaller 4, kan krystalliseringsprosessen ikke kontrolleres nøyaktig8. I den frie grensesnittdiffusjonsmetoden sprer krystalliseringsløsningen seg inn i en konsentrert proteinløsning, og retter systemet sakte mot supermetning. Denne metoden kan betraktes som en satsvis metode med en langsom blandehastighet6,9,10,11,12. I batchmetoden blandes proteinet raskt med en krystalliseringsløsning som fører til rask supermetning og i sin tur jevn kjerner med mangekrystaller 3,7. Denne metoden står for omtrent en tredjedel av alle strukturer som for tiden er deponert i Protein Data Bank. Dialysemetoden brukes også til å dyrke høykvalitets og velfnærende proteinkrystaller. I dialysemetoden diffuserer molekyler av bunndeig fra et reservoar gjennom en halvgjennomtrengelig membran inn i et eget kammer med proteinoppløsningen. Kinetikken av likevekt er avhengig av ulike faktorer, for eksempel temperatur, membran porestørrelse, og volumet og konsentrasjonen av proteinprøver og krystalliseringsmidler6.
Krystalliseringsfasediagrammer kan brukes til å beskrive forskjellige tilstander av et protein som en funksjon av forskjellig fysisk eller kjemisk variabel3. Som illustrert i figur 1kan hver krystalliseringsteknikk visualiseres som å bruke en annen kinetisk bane for å nå kjerne- og metastable sonene i et slikt diagram6,10,13. Dette gir informasjon om proteinløselighet og proteinkonsentrasjonen der en termodynamisk likevekt mellom krystall og løsning observeres, og dermed finner de optimale forholdene for kjerneringog vekst 3,14. I et todimensjonalt fasediagram plottes proteinkonsentrasjonen som en funksjon av en variabel, og de andre variablene holdes konstant15. I et slikt fasediagram, når proteinkonsentrasjonen er under løselighetskurven, er løsningen i den undermeterte regionen og ingen kjerner eller krystallvekst oppstår. Over denne kurven er supermetningssonen der proteinkonsentrasjonen er høyere enn løselighetsgrensen3,14. Dette er videre delt inn i tre regioner: metasonen, den spontane kjernesonen og nedbørssonen. I metastable sonen er supermetning ikke tilstrekkelig for at kjerner skal skje innen rimelig tid, men veksten av seedede krystaller kan finne sted. Aggregering og nedbør favoriseres i nedbørssonen, hvor supermetning er for høy14,15.
Når tilstrekkelig overmetning for spontan kjerner oppnås, vil de første kjernene vises10. Veksten av krystaller fører til en reduksjon i proteinkonsentrasjonen til grensen for løselighet er nådd. Så lenge overmetningen forblir i nærheten av løselighetskurven, vil det ikke være noen signifikant endring i krystallstørrelsen. Det har imidlertid vist seg at variasjoner i temperatur og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsning (for eksempel konsentrasjonen av stupbrakt) vil påvirke proteinløselighet og kan føre til initiering av ytterligere krystallvekst8,13,16.
Som dialyse er en fordel for god kvalitet krystallvekst, OptiCrys krystallisering benken illustrert i figur 2, ble designet og utviklet i vårt laboratorium for å kontrollere krystallisering på en helautomatiskmåte 8. For dette formålet ble programvare skrevet med LabVIEW som tillater kontroll og overvåking av temperaturen på et flytende reservoardialyseoppsett i kontakt med Peltier-elementer, via en elektronisk kontroller og en kjøler. Den samme programvaren regulerer også automatisk den kjemiske sammensetningen av krystalliseringsløsningen (for eksempel utveksling av krystalliseringsmidler) ved hjelp av et flerkanals fluidisk system. I tillegg brukes et digitalt kamera og et omvendt mikroskop til å visualisere og registrere krystalliseringsprosessen. To krystalliseringskamre med 15 μL og 250 μL volumer er tilgjengelige for dyrking av krystaller til forskjellige formål. Siden krystalliseringsprosessen er reversibel, er screening for ulike forhold mulig med bare noen få mikroliter av proteinløsningen så lenge prøven ikke er skadet8. Som et resultat minimerer bruk av denne metoden mengden proteinmateriale som brukes.
Fra tidligere arbeid8er det tydelig at under krystallvekstprosessen må in situ-observasjoner utføres med jevne mellomrom. Disse kan variere fra noen få sekunder til flere dager, avhengig av hendelsen under observasjon (nedbør, kjerner eller krystallvekst).
Optimaliseringen av krystallvekst med OptiCrys er basert på temperaturutfellende konsentrasjonsfasediagrammer. Ved proteiner med løselighet som en direkte funksjon av temperatur, er det mulig å gjøre bruk av saltingsregimet18. Det er her å øke den ioniske styrken av løsningen, som kan visualiseres ved hjelp av protein-stupbrapende fasediagrammer, reduserer oppløseligheten av proteinet. På samme måte kan proteiner med invers løselighet gjøre bruk av saltingsregimet18. Nucleation forekommer i kjernesonen, i nærheten av den metastable sonen, og krystallvekst finner deretter sted i den metastable sonen i fasediagrammet til proteinkonsentrasjonen når løselighetsgrensen. Som vist i figur 3A, med konstant kjemisk sammensetningstemperatur kan reduseres for å holde krystalliseringsløsningen i metastable sonen for å forhindre ny kjerne. Krystaller vokser til den andre krystall / løsning likevekt oppnås, og etter det observeres ingen ytterligere økning i størrelsen på krystaller. Temperaturen reduseres flere ganger til krystallene når ønsket størrelse. I figur 3B, ved konstant temperatur, holder den utløsende konsentrasjonen løsningen i metasonen. Denne prosessen kan deretter gjentas flere ganger for å oppnå store krystaller. Endre temperaturen og manipulere krystallisering løsning forhold, ved å kontrollere supermetning nivåer, er to kraftige verktøy for å skille kjerner og vekst av krystaller som styres nøyaktig og automatisk av OptiCrys5,8,14.
Eksempler på proteinkrystaller dyrket av temperaturkontrollerte, eller temperatur- og bunnkonsentrasjonskontrollert krystallisering, samt relative diffraksjonsdata innhentet er tilgjengelige i litteraturen og PDB. Blant dem er menneskelig γ-krystallin E, PA-IIL lectin, gjær uorganisk pyrofosfatase, uratoksidase, human karbonsyreanhydrase II, YchB kinase, og laktat dehydrogenase5,14,17,18.
Selv om OptiCrys ble kommersialisert av NatX-ray, er det mange laboratorier som ikke har tilgang til dette instrumentet eller til den serielle tilnærmingen det tilbyr. Alternativet til denne teknikken er å bruke kommersielt tilgjengelige plastmikroanalyseknapper med ulike volumer. Ved hjelp av disse kan temperatur og kjemisk sammensetning justeres og varieres manuelt. Inspeksjon av mikrodialyseknapper kan ikke gjøres in situ og må i stedet gjøres manuelt med et optisk mikroskop. Temperaturkontroll kan oppnås ved å holde prøven i en vibrasjonsfri temperaturkontrollert inkubator. Det er viktig å holde temperaturen konstant for å sikre at krystalliseringseksperimenter er reproduserbare. Betydelig temperaturvariasjon kan også føre til skade eller ødeleggelse av krystaller5.
Her gir vi en detaljert protokoll som beskriver prøveforberedelse og bruk av kontrollprogramvare for vekst av store krystaller av høy kvalitet egnet for nøytronproteinkrystallografi. Denne trinnvise prosedyren ble utformet for å dra nytte av krystalliseringsfasediagrammet for å velge en startposisjon og kinetisk bane for å kontrollere størrelsen og kvaliteten på krystallene som genereres. I tillegg presenteres en detaljert protokoll for voksende krystaller med mikroanalyseknapper som bruker samme begrunnelse for å oppnå store krystaller av høy kvalitet.
Ulike fysiske, kjemiske og biologiske variabler påvirker proteinkrystallisering ved å påvirke proteinløselighet21. Blant disse variablene brukes temperatur og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsningen her i kombinasjon med dialyseteknikk for å forbedre og vokse store krystaller av høy kvalitet av biomacromolecules for nøytrondiffraksjonsstudier. Ved å bruke kunnskap om fasediagrammer, er krystallisering gjort mer forutsigbar. Selv om screening av ulike krystalliseringsforhold i en seriell tilnærming også er mulig, er hovedmålet med å bruke de rasjonelle tilnærmingene som presenteres å skille og kontrollere kinetikken til krystallkjerner og vekst.
I likhet med alle krystalliseringsstudier øker rene og homogene proteinprøver av høy kvalitet og støvfrie krystalliseringsløsninger suksessraten for eksperimentet. Filtrering og sentrifugering av løsninger er viktige trinn i de beskrevne protokollene. Å kjenne de fysikalske egenskapene til proteinene studert som molekylvekt (for å velge riktig dialysemembran), isoelektrisk punkt, og proteinløselighet er avgjørende for utformingen av et optimalt krystallveksteksperiment. Det må også vurderes for proteinstabilitet ved forskjellige temperaturer eller med forskjellige kjemikalier for å forhindre prøvetap og øke sannsynligheten for suksess. Med tanke på temperaturområdet til OptiCrys (233,0–353,0 ± 0,1 K), kan et bredt spekter av proteiner krystalliseres ved hjelp av det. Men det er verdt å understreke at proteiner som primært er termo-stabile, som proteiner fra termofile kilder, vil ha mest nytte i temperaturkontrollerte krystallveksteksperimenter som tilbys av dette instrumentet.
Ved hjelp av et dialysekammer med lavt volum (ved bruk av OptiCrys) eller mikroanalyseknapper og screening av flere temperaturer og krystalliseringsforhold (f.eks. rutenett av bunnkonsentrasjon eller pH), er det mulig å få informasjon om plasseringen av grensen for den metastable sonen (kinetisk likevekt mellom kjerner og meterbare soner). Dette er uvurderlig når du utformer et vellykket krystallveksteksperiment, spesielt for nye proteinkandidater i krystallisering. Uten denne informasjonen kan eksperimenter starte fra et område av fasediagrammet med høy supermetning, for langt fra grensen for metastable sonen for å enkelt kontrollere krystallkjerner. Selv om oppløsning av proteinutløsning kan forsøkes, for eksempel ved å øke temperaturen i tilfelle direkte løselighet, for proteiner med redusert termobilitet, kan det å holde prøven ved høy temperatur i lengre tid gjøre proteinnedbøren irreversibel. Dermed består den beste strategien av å bruke en innledende tilstand med lavere supermetning som ligger nær grensen for metabilitet, hvor kjerner kan kontrolleres og proteinnedbør unngås. I tråd med dette reduserer krystalliseringsprescreening sjansen for å ha et proteinutfelling i dialysekammeret og øker suksessraten for eksperimentet.
Etter å ha designet et eksperiment, er det et annet viktig skritt å forberede dialysekamre (OptiCrys) eller mikrodialyseknapper. Forebygging av luftbobledannelse i dialysekammeret/knappen øker sjansen for vellykket krystallisering, spesielt når små volumer brukes. Tilstedeværelsen av luftbobler i dialysekammeret kan også endre kinetikken i krystalliseringsprosessen og redusere reproduserbarheten av eksperimentet (fordi protein/løsningskontaktoverflaten er endret). Ikke bare protein, men også krystalliseringsløsning kan påvirke eksperimentets suksess. Ved hjelp av nye 50 ml rør for pumpesystemet hver gang man ønsker å starte et nytt eksperiment og vaskerør etter hvert eksperiment reduserer sjansen for forurensning og unngår etablering av saltkrystaller i apparatet.
Bruk av mikroanalyseknapper er et alternativ når OptiCrys ikke er tilgjengelig. Strategiene for å optimalisere krystallisering og overvåking av krystallvekst nevnt ovenfor, må utføres manuelt. Vanligvis nødvendiggjør dette å være utenfor en termoregulert inkubator, noe som kan være problematisk når temperaturregulering er et kritisk skritt i metodikken som er beskrevet. Dette forenkler ikke endring av krystalliseringsløsningenes kjemiske sammensetning, eller overvåking av krystallvekst ved avbildning, slik at krystallvekstprosessen ikke kan kontrolleres i sanntid.
Kunnskap om fasediagrammet er grunnlaget for å bruke krystalliseringsbenken, OptiCrys, til systematisk å vokse store krystaller av høy kvalitet på en automatisert måte. Kontroll av fysikalske parametere som temperatur, bunnkonsentrasjon og pH under krystallisering beveger proteinløsningslikevekten i en veldefinert kinetisk bane over fasediagrammet. Dette suppleres ved bruk av dialysemembran for å justere massetransport og skape en kontrollert gradient i krystalliseringskammeret som påvirker krystallenes størrelse og kvalitet. Derfor er bruk av både termodynamiske data og kinetiske baner avgjørende for å kontrollere krystalliseringsprosessen for å vokse krystaller av høy kvalitet. Takket være OptiCrys kan systematiske fasediagrammer i et flerdimensjonalt rom studeres med en seriell tilnærming ved hjelp av betydelig mindre materiale enn før. For å demonstrere denne metodikken gir vi her en case-studie med et modellprotein, kyllingegg-hvitt lysozyme. Ved å bruke og mestre protokollen som presenteres her kan man tilpasse den for ekte proteinsystemer5,14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
MBS anerkjenner støtten fra LABEX VALO GRAL under kontrakten 2015. NJ anerkjenner CEA’s International Doctoral Research Program (Irtelis) for PhD Fellowship. Forfattere anerkjenner støtte fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Program under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale nummer 722687. Forfatterne er også takknemlige til Dr Esko Oksanen (ESS, Lund) og Dr Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) for nyttige samtaler og innsikt. IBS anerkjenner integrering i Det tverrfaglige forskningsinstituttet i Grenoble (IRIG, CEA).
200 µl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-330 | Dialysis button |
24 well plates | Jena Bioscience | CPL-132 | Crystallization plate |
2-Switch | FLUIGENT | 2SW001 | Switch |
30 μl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-324 | Dialysis button |
50 mL Corning Centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828-500EA | Centrifuge tubes |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Chicken Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Lyophilized protein powder |
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132478 | Dialysis membrane |
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132650T | Dialysis membrane |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
Flow Unit | FLUIGENT | FLU-XL | Flow meter |
Flowboard | FLUIGENT | FLB | Flowboard |
Microfluidic Flow Control System EZ | FLUIGENT | EZ-01000002 | Pressure/vacuum controller |
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
M-Switch | FLUIGENT | MSW002 | Rotary valve |
Opticrys | NatX-ray | PRT008 | Crystallization bench |
Siliconized circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Glass slides |
Sodium Chloride ≥ 99% | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Switchboard | FLUIGENT | SWB002 | Switchboard |
Thermoregulated incubator | Memmert | IPP30 | Thermoregulated incubator |