Optimalisatie van kristalgroei voor neutronenmacromoleculaire kristallografie

Summary

Structurele studies van biomacromolecules door kristallografie vereisen hoogwaardige kristallen. Hier demonstreren we een protocol dat kan worden gebruikt door OptiCrys (een volledig geautomatiseerd instrument ontwikkeld in ons lab) en / of microdialyseknoppen voor het kweken van grote hoogwaardige kristallen op basis van kennis van het kristallisatiefasediagram.

Abstract

Het gebruik van neutronen macromoleculaire kristallografie (NMX) breidt zich snel uit met de meeste structuren die in het afgelopen decennium zijn bepaald dankzij de bouw van nieuwe NMX-bundellijnen en de toegenomen beschikbaarheid van structuurraffinaderingssoftware. De neutronenbronnen die momenteel beschikbaar zijn voor NMX zijn echter aanzienlijk zwakker dan gelijkwaardige bronnen voor röntgenkristallografie. Ondanks de vooruitgang op dit gebied zullen er altijd aanzienlijk grotere kristallen nodig zijn voor neutronendiffractiestudies, met name met de neiging om steeds grotere macromoleculen en complexen te bestuderen. Verdere verbeteringen in methoden en instrumentatie die geschikt zijn voor het kweken van grotere kristallen zijn daarom nodig om het gebruik van NMX uit te breiden.

In dit werk introduceren we rationele strategieën en een kristalgroeibank (OptiCrys) ontwikkeld in ons laboratorium die realtime observatie combineert door middel van een op microscoop gemonteerde videocamera met nauwkeurige geautomatiseerde controle van kristallisatieoplossingen (bijv. neerslagconcentratie, pH, additief, temperatuur). Vervolgens laten we zien hoe deze controle van temperatuur en chemische samenstelling het zoeken naar optimale kristallisatieomstandigheden vergemakkelijkt met behulp van modeloplosbare eiwitten. Grondige kennis van het kristallisatiefasediagram is cruciaal voor het selecteren van de uitgangspositie en het kinetische pad voor elk kristallisatie-experiment. We laten zien hoe een rationele aanpak de grootte en het aantal gegenereerde kristallen kan bepalen op basis van kennis van multidimensionale fasediagrammen.

Introduction

Het begrijpen van de structuurfunctierelatie van eiwitten en het mechanisme van fysiologische paden is vaak afhankelijk van het kennen van de posities van waterstofatomen (H) en hoe lading wordt overgedragen binnen een eiwit^1,2. Aangezien waterstofatomen röntgenstralen zwak verspreiden, kunnen hun posities alleen worden bepaald met röntgendiffractiegegevens met een zeer hoge resolutie (>1 Å)^3,4. Omgekeerd kan neutronenkristallografie worden gebruikt om een nauwkeurige positie van waterstofatomen in biologische macromoleculen te verkrijgen, aangezien waterstof en deuterium (H², isotoop van waterstof) atomen verstrooiingslengten van ongeveer gelijke grootte hebben als zuurstof, stikstof en koolstof⁵. Neutronenflux uit beschikbare neutronenbronnen is echter zwakker dan die van röntgenstralen, dus dit moet vaak worden gecompenseerd voor^2,3. Dit kan worden bereikt door H uit te wisselen met H² en/of het volume van kristallen te verhogen om de onsamenhangende verstrooiing van waterstof te verminderen en de signaal-ruisverhouding van diffractiebeelden te verhogen.

Er zijn verschillende kristallisatiebenaderingen (het bijbehorende schematische fasediagram wordt weergegeven in figuur 1) voor het verkrijgen van grote en hoogwaardige kristallen voor zowel röntgen- als neutronenbio-macromoleculaire kristallografie⁶. Bij dampdiffusie wordt een druppel bereid uit een mengsel van een eiwit en een kristallisatieoplossing in de loop van de tijd, door verdamping van water of andere vluchtige soorten, in evenwicht gehouden met een reservoir met een hogere concentratie neerslag van dezelfde kristallisatieoplossing. De toename van de concentratie van eiwitten en neerslag in de druppel leidt tot de oververzadiging die nodig is voor spontane nucleatie , gevolgd door kristalgroei in deze kernen^6,7. Hoewel dampdiffusie de meest gebruikte techniek is voor het kweken van kristallen⁴, kan het kristallisatieproces niet nauwkeurig worden gecontroleerd⁸. In de vrije interface diffusiemethode verspreidt de kristallisatieoplossing zich in een geconcentreerde eiwitoplossing, waardoor het systeem heel langzaam wordt gericht op oververzadiging. Deze methode kan worden beschouwd als een batchmethode met een langzame mengsnelheid^6,9,10,11,12. In de batchmethode wordt het eiwit snel gemengd met een kristallisatieoplossing die leidt tot snelle oververzadiging en op zijn beurt uniforme nucleatie met veel kristallen^3,7. Deze methode is goed voor ongeveer een derde van alle structuren die momenteel in de Protein Data Bank worden gedeponeerd. De dialysemethode wordt ook gebruikt voor het kweken van hoogwaardige en goed diffracerende eiwitkristallen. In de dialysemethode verspreiden moleculen van neerslag zich vanuit een reservoir via een semi-doorlatend membraan in een aparte kamer met de eiwitoplossing. De kinetiek van equilibratie is afhankelijk van verschillende factoren, zoals temperatuur, membraanporiëngrootte en het volume en de concentratie van eiwitmonsters en kristallisatiemiddelen⁶.

Kristallisatiefasediagrammen kunnen worden gebruikt om verschillende toestanden van een eiwit te beschrijven als functie van verschillende fysische of chemische variabele³. Zoals geïllustreerd in figuur 1, kan elke kristallisatietechniek worden gevisualiseerd als het gebruik van een andere kinetische baan om de nucleatie en uitzaaibare zones van een dergelijk diagram^6,10,13te bereiken . Dit geeft informatie over de oplosbaarheid van eiwitten en de eiwitconcentratie waarbij een thermodynamisch evenwicht tussen kristal en oplossing wordt waargenomen, waardoor de optimale omstandigheden voor nucleatie en groei worden gevonden^3,14. In een tweedimensionaal fasediagram wordt de eiwitconcentratie geplot als functie van de ene variabele en de andere variabelen constant¹⁵. In een dergelijk fasediagram, wanneer de eiwitconcentratie onder de oplosbaarheidscurve ligt, bevindt de oplossing zich in het onderverzadigde gebied en treedt er geen nucleatie of kristalgroei op. Boven deze curve bevindt zich de oververzadigingszone waar de eiwitconcentratie hoger is dan de oplosbaarheidsgrens^3,14. Dit is verder verdeeld in drie regio's: de uitzaaibare zone, de spontane nucleatiezone en de neerslagzone. In de uitzaaibare zone is oververzadiging niet voldoende om nucleatie binnen een redelijke tijd te laten plaatsvinden, maar de groei van gezaaide kristallen kan plaatsvinden. Aggregatie en neerslag zijn favoriet in de neerslagzone, waar de oververzadiging te hoog is^14,15.

Wanneer voldoende oververzadiging voor spontane nucleatie wordt bereikt, verschijnen de eerste kernen¹⁰. De groei van kristallen leidt tot een verlaging van de eiwitconcentratie totdat de oplosbaarheidsgrens is bereikt. Zolang de oververzadiging in de buurt van de oplosbaarheidscurve blijft, zal er geen significante verandering in de grootte van kristallen zijn. Er is echter aangetoond dat variaties in de temperatuur en chemische samenstelling van kristallisatieoplossing (bijvoorbeeld de concentratie neerslag) de oplosbaarheid van eiwitten zullen beïnvloeden en kunnen leiden tot het initiëren van verdere kristalgroei^8,13,16.

Aangezien dialyse voordelig is voor kristalgroei van goede kwaliteit, werd de OptiCrys kristallisatiebank geïllustreerd in figuur 2,ontworpen en ontwikkeld in ons laboratorium om kristallisatie op een volledig geautomatiseerde manier te beheersen⁸. Hiervoor is software geschreven met LabVIEW die de controle en bewaking van de temperatuur van een stromende reservoirdialyse-opstelling in contact met Peltier-elementen mogelijk maakt, via een elektronische controller en een koelmachine. Dezelfde software reguleert ook automatisch de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing (bijvoorbeeld de uitwisseling van kristallisatiemiddelen) met behulp van een multichannel vloeibaar systeem. Daarnaast worden een digitale camera en een omgekeerde microscoop gebruikt om het kristallisatieproces te visualiseren en vast te leggen. Twee kristallisatiekamers met volumes van 15 μL en 250 μL zijn beschikbaar voor het kweken van kristallen voor verschillende doeleinden. Omdat het kristallisatieproces omkeerbaar is, is screening op verschillende omstandigheden mogelijk met slechts een paar microliters van de eiwitoplossing zolang het monster niet wordt beschadigd⁸. Als gevolg hiervan minimaliseert het gebruik van deze methode de hoeveelheid eiwitmateriaal die wordt gebruikt.

Uit eerder werk⁸blijkt dat tijdens het kristalgroeiproces in situ observaties met regelmatige tijdsintervallen moeten worden uitgevoerd. Deze kunnen variëren van enkele seconden tot meerdere dagen, afhankelijk van de gebeurtenis onder observatie (neerslag, nucleatie of kristalgroei).

De optimalisatie van kristalgroei met OptiCrys is gebaseerd op temperatuurprecipitante concentratiefasediagrammen. In het geval van eiwitten met oplosbaarheid als directe functie van de temperatuur, is het mogelijk om gebruik te maken van het zoute regime¹⁸. Dit is waar het verhogen van de ionische sterkte van de oplossing, die kan worden gevisualiseerd met behulp van eiwitprecipitante fasediagrammen, de oplosbaarheid van het eiwit vermindert. Evenzo kunnen eiwitten met omgekeerde oplosbaarheid gebruik maken van het zoute regime¹⁸. Nucleatie vindt plaats in de nucleatiezone, in de buurt van de uitzaaibare zone, en kristalgroei vindt dan plaats in de uitzaaibare zone van het fasediagram totdat de eiwitconcentratie de oplosbaarheidsgrens bereikt. Zoals weergegeven in figuur 3A,kan met een constante chemische samenstellingstemperatuur worden verlaagd om de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone te houden om nieuwe nucleatie te voorkomen. Kristallen groeien tot het tweede kristal/oplossingsevenwicht is bereikt en daarna wordt geen verdere toename van de grootte van kristallen waargenomen. De temperatuur wordt meerdere keren verlaagd totdat de kristallen de gewenste grootte hebben bereikt. In figuur 3Bhoudt het verhogen van de neerslagconcentratie bij constante temperatuur de oplossing in de uitzaaibare zone. Dit proces kan vervolgens meerdere keren worden herhaald om grote kristallen te verkrijgen. Het veranderen van de temperatuur en het manipuleren van de kristallisatieoplossingsomstandigheden, door de oververzadigingsniveaus te regelen, zijn twee krachtige hulpmiddelen voor het scheiden van nucleatie en groei van kristallen die nauwkeurig en automatisch worden gecontroleerd door OptiCrys^5,8,14.

Voorbeelden van eiwitkristallen die worden gekweekt door temperatuurgecontroleerde, of temperatuur- en neerslagconcentratiegestuurde kristallisatie, evenals relatieve diffractiegegevens die zijn verkregen, zijn beschikbaar in de literatuur en PDB. Onder hen zijn menselijke γ-kristallijne E, PA-IIL lectine, gist anorganische pyrofosfatase, uraatoxidase, humaan koolzuuranhydrase II, YchB kinase en lactaatdehydrogenase^5,14,17,18.

Hoewel OptiCrys werd gecommercialiseerd door NatX-ray, zijn er veel laboratoria die geen toegang hebben tot dit instrument of tot de seriële aanpak die het biedt. Het alternatief voor deze techniek is het gebruik van in de handel verkrijgbare plastic microdialyseknoppen met verschillende volumes. Hiermee kunnen temperatuur en chemische samenstelling handmatig worden aangepast en gevarieerd. Inspectie van microdialyseknoppen kan niet ter plaatse worden uitgevoerd en moet in plaats daarvan handmatig worden uitgevoerd met een optische microscoop. Temperatuurregeling kan worden bereikt door het monster in een trillingsvrije temperatuurgecontroleerde incubator te bewaren. Het is essentieel om de temperatuur constant te houden om ervoor te zorgen dat kristallisatie-experimenten reproduceerbaar zijn. Aanzienlijke temperatuurschommelingen kunnen ook leiden tot beschadiging of vernietiging van kristallen⁵.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol met een beschrijving van de monstervoorbereiding en het gebruik van besturingssoftware voor de groei van grote, hoogwaardige kristallen die geschikt zijn voor neutroneneiwitkristallografie. Deze stapsgewijze procedure is ontworpen om te profiteren van het kristallisatiefasediagram om een uitgangspositie en kinetisch pad te selecteren om de grootte en de kwaliteit van de gegenereerde kristallen te bepalen. Bovendien wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het kweken van kristallen met microdialyseknoppen, dat dezelfde redenering gebruikt om grote kristallen van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Protocol

1. Dialysemethode met microdialyseknoppen

1. Monstervoorbereiding
   1. Bereid eiwitoplossing door 30 mg kippeneiwit lysozym op te lossen als een lyophilized poeder in 1 ml CH₃COONa-buffer (100 mM natriumacetaat, pH 4) om een oplossing te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van 30 mg·ml^-1.
   2. Centrifugeer het monster bij de 13.000 × g gedurende 10 min bij 277 K. Dit proces helpt bij het verwijderen van aggregaten voordat u het kristallisatieproces start.
   3. Controleer de absorptie van het monster bij 280 nm en bereken de eiwitconcentratie met behulp van de Beer-Lambert vergelijking (A= εcl).
      OPMERKING: Volgens de Beer-Lambert-vergelijking is de elektronische absorptie (A) direct evenredig met de concentratie (c, mg·ml^-1) van een absorberende soort met een constante optische pathlength (l, cm). De gradiënt van deze lineaire relatie is de molaire extinctiecoëfficiënt (ε, voor lysozym bij 280 nm is 2,64 ml·mg⁻¹·cm⁻¹)¹⁹. De sidechains van aromatische aminozuren (tyrosine, tryptofaan en fenylalanine) en disulfidebindingen tussen cysteïneresiduen hebben een sterke absorptie bij ~ 280 nm als gevolg van spectroscotisch toegestane π - π * overgangen. Aangezien de meeste eiwitten deze residuen bevatten, kan de eiwitconcentratie meestal gemakkelijk worden berekend door de absorptie op 280 nm te meten, gezien de kennis van de extinctiecoëfficiënt.
   4. Bereid kristallisatieoplossingen voor zoals weergegeven in figuur 4. Filter alle voorraadoplossingen met 0,22 μm Millipore-filters voordat u de kristallisatieoplossing voorbereidt.
2. Kristalgroei
   1. Snijd een cellulosedialysemembraan met de juiste moleculaire gewichtsafsnul (6-8 kDa) en week het in gedestilleerd water.
      OPMERKING: Dialysemembraanschijven zijn in de handel verkrijgbaar voor microdialyseknoppen, maar als de dialyseslang wordt gebruikt, vergeet dan niet om de randen te snijden om de twee lagen membraan van de buis te scheiden om slechts membranen met één laag te hebben.
   2. Vul putten van een 24-putige lade met 2 ml kristallisatieoplossing in dezelfde volgorde als in figuur 4.
      OPMERKING: Als knoppen met grotere volumes worden gebruikt (bijv. 200 μL), vul dan 50 ml buizen met een kristallisatieoplossing van minimaal 5 ml om een efficiënte uitwisseling te garanderen.
   3. Voeg/Pipet 35 μL lysozyme-oplossing toe aan de kamer van de microdialyseknop zoals geïllustreerd in figuur 5A.
      OPMERKING: Om de vorming van luchtbellen in een dialyseknop van 30 μL te voorkomen wanneer deze gesloten is, moet een extra volume (dood volume) van 5 μL extra eiwit worden toegevoegd, wat een totaal van 35 μL eiwitmonster betekent. Dit extra eiwitmonster creëert een enigszins gewelfde vorm bovenop de kamer, zoals weergegeven in figuur 5B, die de vorming van luchtbellen voorkomt.
   4. Neem een applicator van de juiste grootte en plaats de elastische O-ring aan het uiteinde (figuur 5C). Plaats vervolgens het membraan, dat eerder licht is afgeveegd/afgetapt met een stuk vezelvrij papier, op de kamer van de dialyseknop. Let er bij het aanbrengen van het papier op dat u geen stof in de kamer legt. Plaats het dialysemembraan op zijn plaats door de elastische O-ring van de applicator over te brengen naar de groef van de dialyseknop (figuur 5C).
      OPMERKING: Het kritieke moment van hanteren is het bevestigen van het dialysemembraan bovenop de kamer door de elastische O-ring van de applicator over te brengen in de groef van de dialyseknop. Alle bewegingen moeten perfect worden gesynchroniseerd om te voorkomen dat luchtbellen met het monster in de eiwitkamer worden omsloten. Het is nuttig om te oefenen met het uitrekken van de elastische O-ring vóór de toepassing ervan om de stijfheid ervan te kennen, een pincet te gebruiken om een deel van het membraan vast te houden tijdens het aanbrengen en de eerste testexperimenten met een modeleiwit uit te voeren.
   5. Plaats de knop met een pincet naar de put of naar de buis van50 ml (afbeelding 5D).
   6. Bedek de put met een afdeklip en druk deze voorzichtig op het vet om de put af te dichten (figuur 5E).
      OPMERKING: Als er geen vet op de putten zit, zorg er dan voor dat u dit toevoegt voordat u met het experiment begint of gebruik een stuk tape in plaats van glazen hoezenlip. Het principe van eiwitkristallisatie met behulp van microdialyseknoppen wordt geïllustreerd in figuur 5.
   7. Bewaar het monster op 293 K in een thermogereguleerde incubator. Verschillende temperaturen kunnen nodig zijn afhankelijk van de gebruikte eiwit- en kristallisatieomstandigheden.
      OPMERKING: Hetzelfde raster van kristallisatieomstandigheden in figuur 4 (waardoor de concentratie neerslag kan worden gevarieerd) kan worden gescreend als een functie van de temperatuur. In een dergelijk geval moet dezelfde kristallisatieplaat worden gereproduceerd en moet elke kopie in een incubator worden geplaatst die op een andere temperatuur is geregeld. Hiervoor zijn verschillende trillingsvrije thermogereguleerde incubators beschikbaar.
   8. Controleer de lade of buizen op kristallen (figuur 4) en maak regelmatig aantekeningen, meestal dagelijks, om te onderscheiden wat er in elke lade zit. Goede noten zijn essentieel om vals-positieve resultaten te voorkomen en stof van kristallen te discrimineren.

2. Kristalgroeiproces met OptiCrys

1. Monstervoorbereiding
   1. Bereid een eiwitoplossing en een dialysemembraan zoals beschreven in rubriek 1.1.
   2. Bereid voorraadoplossingen van NaCl (4 M) en van CH₃COONa pH 4 (1 M) en filter ze in buizen van 50 ml.
   3. Voeg de eiwitoplossing (15 μL lysozym met 30 mg·ml^-1) toe aan de dialysekamer van de temperatuurgecontroleerde stromende reservoirdialyseopstelling. Zie figuur 6 voor meer informatie over de temperatuurgecontroleerde instelling van de stromende reservoirdialyse. OptiCrys heeft twee dialysekamers, het minimumvolume is 15 μL en het maximale volume is 250 μL.
   4. Bedek de overchamber met een dialysemembraan en bevestig het membraan met de elastische O-ring (figuur 6B).
      OPMERKING: Deze opstelling verschilt van microdialyseknoppen waarbij elke kamer direct wordt afgesloten door een dialysemembraan. In de stroomcel wordt het dialysemembraan in plaats daarvan aan de overchamber bevestigd, waardoor kristallen kunnen worden gemonteerd zonder dat het wordt verwijderd. Voor dit doel kan de overchamber eenvoudig uit het reservoir worden losgeschroefd.
   5. Draai de overchamber om en leg deze bovenop de dialysekamer. Druk er langzaam en voorzichtig op om alle lucht tussen de twee stukken te verwijderen en bellen in de kamer te vermijden(figuur 6C). Oefenen met een modeleiwit kan voordelig zijn bij het trainen om luchtbellen en monsterverlies te voorkomen.
   6. Bevestig het reservoir in zijn positie door het voorzichtig bovenop de overchamber te schroeven, opnieuw bedachtzaam om te voorkomen dat luchtbellen worden opsluiten. Overstrakking van het reservoir kan ook bellen vormen in de kristallisatiekamer(figuur 6D).
   7. Voeg de kristallisatieoplossing toe en bedek de reservoirkamer met de luchtdichte dop. (Figuur 6G). Het maximale volume van het reservoir is 1 ml.
   8. Breng deze montage over en steek deze in de messing steun. Deze ondersteuning staat in contact met Peltier elementen die worden gebruikt om de temperatuur te regelen.
   9. Zoals geïllustreerd in figuur 6,is de luchtdichte dop uitgerust met een optisch venster om de dialysekamer te verlichten. Plaats de lichtbron (afbeelding 2) op het raam zodat het licht door de kamer kan gaan.
   10. De reservoirkamer kan op een pomp worden aangesloten om deze als continue stroomcel te laten functioneren. Sluit de slang bovenop de buizen van 50 ml die de voorraadoplossingen en gedestilleerd water bevatten aan op de draaiklep, zoals geïllustreerd in figuur 7.
       OPMERKING: Als automatische bereiding en wisseling van kristallisatieoplossingen tijdens het experiment niet gewenst zijn, laat dan stap 2.1.10 achterwege. In een dergelijk geval moet de kristallisatieoplossing worden voorbereid en moet het reservoir handmatig worden voorgevuld.
2. Software
   1. Zet de computer aan en start de software Croissance cristalline [Crystal growth]. Deze besturingssoftware is geschreven met LabVIEW (http://www.ni.com/labview/) en biedt een gebruiksvriendelijke grafische interface. Het bevat 4 verschillende grafische interfaces (Accueil [Welkom], Paramétrage [Instelling], Essai [Test] en Onderhoud [Onderhoud]) (Figuur 8).
      OPMERKING: Vertalingen uit het Frans staan tussen haakjes.
   2. Selecteer de onderhoudsweergave door op de knop te klikken zoals geïllustreerd in figuur 8. Deze weergave wordt momenteel het meest gebruikt en stelt gebruikers in staat om de meeste parameters tijdens het experiment te beheren.
      OPMERKING: Nadat u op de onderhoudsweergave hebt geklikt, verschijnt er een nieuw venster met verschillende secties voor het regelen van parameters zoals temperatuur of licht. In figuur 8 worden verschillende delen van deze weergave weergegeven met pijlen en kaders. In de volgende stappen laten we zien hoe elke parameter wordt bestuurd met behulp van de software.
   3. Régulateur de température [Temperatuurregelaar] sectie maakt de controle en bewaking van de temperatuur mogelijk. Klik op de knop, nummer één (1) in figuur 8, om deze in te schakelen.
      OPMERKING: Het temperatuurbereik in OptiCrys is 233,0 – 353,0 ± 0,1 K.
   4. Stel de temperatuur in op de sectie geadresseerde [setpoint] en druk op enter (figuur 8(2)). Onder deze knop staat een grafiek met 2 sporen (rood en geel). Het rode spoor toont de uiteindelijke (geordende) temperatuur en het gele spoor toont de huidige temperatuur. Zoals aangegeven in figuur 8(2)wordt de temperatuur ingesteld op 20 °C.
      OPMERKING: Om een kristal te laten groeien, zoals uitgelegd in het kristalgroeigedeelte, moeten veel temperaturen worden gekozen. Als u de temperatuur wilt wijzigen, voegt u elke nieuwe temperatuur toe in de sectie verzendpunt en drukt u op de enter-knop op het toetsenbord.
   5. Schakel het licht in door de helderheid van het gedeelte Lumières [Lights] in figuur 8te verhogen . De helderheid varieert van 0 tot 100, "0" geeft aan dat het licht uit is en bij "100" is het licht ingesteld op maximale intensiteit en helderheid. Door het licht te vergroten, in de microscoopsectie, kan men in de dialysekamer kijken. Tijdens het experiment kan de helderheid in de cel variëren; pas de parameters aan om duidelijk te visualiseren in de dialysekamer. Vergroting kan ook worden verhoogd of verlaagd met behulp van de + en – knoppen voor "zoom" voor een betere weergave.
   6. Aan de rechterkant van de microscoopsectie zijn er verschillende secties voor het opslaan van relevante informatie voor elk kristallisatie-experiment. Elke gebruiker kan een map maken om informatie op te slaan over kristallisatieomstandigheden, eiwitnamen en de moleculaire gewichtsafsnul van het gebruikte dialysemembraan (figuur 8(3)).
   7. De gebruiker kan een naam voor het experiment definiëren door deze eenvoudigweg in te typen op het Nom-dossier [Mapnaam]. Als u op de knop Dossier [Map] klikt (weergegeven met een groen kader in figuur 8) wordt een nieuw venster geopend. In dit venster wordt een tekstbestand weergegeven met alle informatie die voor het experiment is gedefinieerd. Bovendien worden afbeeldingen met tijdstempels in deze map opgeslagen voor toekomstige verwerking.
   8. Selecteer in de sectie NB-afbeeldingen het aantal afbeeldingen dat tijdens het experiment moet worden gemaakt. Geef het nummer van de afbeeldingen in het rechterpaneel op, samen met het gewenste tijdsinterval tussen deze afbeeldingen (bijv. min, uur, dag). Figuur 8 toont de software-instelling om in een minuut nul afbeeldingen op te nemen.
      OPMERKING: Gebruik het pompe-gedeelte voor het mengen van voorraadoplossingen en het injecteren van kristallisatieoplossing in de reservoirkamer. Zie punt 2.1.10 en figuur 7 voor een uitleg van het principe van het vloeistofmengsysteem.
   9. Inputconcentraties van de voorraadoplossingen in Etape 1 [Stap 1]: voorraden oplossingen. Voor het kristallisatie-experiment in de volgende sectie worden NaCl 4 M en CH₃COONa 1 M pH 4 gebruikt.
      OPMERKING: Concentraties van voorraadoplossingen bevinden zich in molaire eenheden.
   10. Definieer de uiteindelijke concentratie van elke oplossing. Bijvoorbeeld 0,75 M voor NaCl en 0,1 M voor CH₃COONa pH 4. Voer deze in de laatste concentratiesectie (figuur 8) in de Etape 2 [Stap 2]: oplossing à préparer [oplossing om voor te bereiden]. Druk op de knop Calcul [Compute], die wordt weergegeven met een rood kader in figuur 8. Het uiteindelijke volume van elke voorraadoplossing die bij het mengen wordt gebruikt, wordt weergegeven in het volumepaneel voor elk concentratiepaneel.
   11. Druk op de Lancer préparation [Launch preparation] knop (Afbeelding 8). Zoals geïllustreerd in figuur 7,neemt de draaiklep elke voorraadoplossing en injecteert deze via een schakelaar in de mengbuis.
   12. Nadat de kristallisatieoplossing is voorbereid, klikt u op de knop Voorgerechtoplossing [Solution Entry] in Etape 3 [Stap 3]: Flux van het pompgedeelte (geel frame in figuur 8). De schakelaar verandert om de nieuwe kristallisatieoplossing van mengbuis in de reservoirkamer te injecteren. Druk op de knop Arrêt distribution [Distribution Stop] om het uitwisselingsproces te stoppen.
       OPMERKING: Observeer het kristallisatieproces tijdens het experiment en wijzig parameters zoals temperatuur, kristallisatieoplossing en zoom, in de bijbehorende grafische interface van de toezichtsoftware. Door de software te gebruiken, is het niet nodig om de luchtdichte dop of de stroomcel tijdens het experiment te verwijderen, dus de enige variabele is degene die de gebruiker via de software verandert.
3. Grote kristalgroei
   1. Voeg 15 μL lysozym met een concentratie van 30 mg·ml^-1 toe aan de dialysekamer (figuur 6A).
      OPMERKING: Bereid het eiwitmonster zoals beschreven in rubriek 1.1.
   2. Monteer de temperatuurgecontroleerde stroomdialyse-opstelling zoals beschreven in punt 2.1 en figuur 6.
   3. Bereid de kristallisatieoplossing voor. Vergeet niet om alle voorraadoplossingen vóór monstervoorbereiding te filteren met filters van 0,22 μm. Voor dit experiment bevat de kristallisatieoplossing 0,75 M NaCl en 0,1 M CH₃COONa pH 4. Dit kan handmatig worden toegevoegd of met behulp van de reservoirkamer en het pompsysteem zoals beschreven in de punten 2.2.10 tot en met 2.2.12.
   4. Stel de temperatuur in op 295 K zoals uitgelegd in de punten 2.2.3 en 2.2.4 en weergegeven in afbeelding 8. Onder de eerste omstandigheden zal het evenwicht tussen de dialysekamer en het reservoir na ongeveer 90 minuten worden bereikt en zullen de eerste zichtbare kernen na 22 uur verschijnen.
   5. Laat kristallen groeien totdat er geen zichtbare veranderingen in de grootte van de kristallen meer worden waargenomen (figuur 9, deelvenster 1).
      OPMERKING: Om de nucleatietijd te bepalen en de variatie in de grootte van de kristallen te meten, neemt u elke 15 of 20 minuten beelden op, wat respectievelijk 4 of 3 afbeeldingen per uur is in de sectie NB-afbeeldingen. Voor in situ observatie van eiwitdenaturatie, aggregatie en neerslag of kristaloplossing of nucleatie zijn meestal tussen enkele seconden en enkele tientallen minuten vereist. Voor kristalgroei ligt dit bereik echter tussen een paar minuten en een paar uur.
   6. Verlaag na drie dagen de temperatuur tot 291 K om de kristalgroei opnieuw op te starten. Houd de temperatuur constant en laat het kristal zich ontwikkelen (figuur 9, paneel 2). Voor deze fase van het experiment volstaat het om elke 2 uur beelden op te nemen en elke 10 tot 12 uur te controleren op elke verandering in de grootte van de kristallen. Het experiment kan worden voortgezet als er geen verandering in de grootte van de kristallen wordt waargenomen.
      OPMERKING: Afhankelijk van de eiwit- en neerslagconcentraties in de kristallisatieoplossing en de gebruikte eiwitvolumes, kan de tijd die nodig is om het evenwicht voor elke stap te bereiken variëren.
   7. Verlaag de temperatuur tot 288 K om de kristalgroei opnieuw op te starten. In de experimentele toestand van de hier gepresenteerde zaak is één dag voldoende om evenwicht te bereiken (figuur 9, paneel 3).
   8. Controleer de grootte van de kristallen en houd een constante temperatuur aan zolang het kristal blijft groeien.
   9. Verlaag na 4 dagen de temperatuur tot 275 K om de kristalgroei opnieuw op te starten(figuur 9,deelvenster 4).
      – In de experimentele omstandigheden van het gepresenteerde geval wordt na ongeveer 10 dagen een kristal van 500 μm in één dimensie verkregen (figuur 9).
4. Controle van de kristalgrootte
   1. Bereid een eiwitoplossing en de temperatuurgecontroleerde stromende reservoirdialyse zoals beschreven in de punten 2.3.1 en 2.3.2.
   2. Bereid kristallisatieoplossingen voor met 0,9 M NaCl en 0,1 M CH₃COONa pH 4.
   3. Stel de temperatuur in op 291 K en laat kristallen groeien. Onder de eerste omstandigheden begint de eerste nucleatiegebeurtenis na ongeveer een uur en groeien er gedurende drie uur talrijke kristallen in de dialysekamer (figuur 10, stappen: 1 en 2). Neem elke 20 minuten beelden op om de grootte van de kristallen tijdens het groeiproces te controleren.
      OPMERKING: De optimalisatie van kristallisatieomstandigheden is cruciaal voor het beheersen van de meeste uiteindelijke eigenschappen van gegenereerde kristallen. De temperatuur en chemische samenstelling van kristallisatieoplossingen kunnen worden gewijzigd om kristallen van uniforme grootte op te lossen en opnieuw te laten groeien. Er zij ook op gewezen dat een eiwitmonster in een dergelijk experiment niet wordt geconsumeerd, aangezien de omstandigheden kunnen worden omgekeerd om het monster opnieuw op te lossen zolang het niet gedenatureerd is. Bij het oplossen van kristallen door de temperatuur te veranderen en de constante chemische samenstelling te behouden, gaat u als volgt verder met het experiment:
   4. Zodra kristallen op 291 K zijn gegroeid, kunnen deze worden opgelost om minder, grotere kristallen opnieuw te laten groeien. Verhoog de temperatuur geleidelijk gedurende 20 minuten tot 313 K. Het duurt ongeveer een uur om alle kristallen in de dialysekamer op te lossen(figuur 10,stappen: 3-5). Neem elke 5 tot 15 minuten beelden op om het ontbindingsproces te volgen.
      OPMERKING: Veel eiwitten zijn gevoelig voor hoge temperaturen. Zorg ervoor dat u werkt binnen het temperatuurbereik waar het eiwit stabiel is om schade/denaturatie te voorkomen. Naast de oplosbaarheid van eiwitten beïnvloedt temperatuur ook de bufferoplossing. De pH van de buffer kan bijvoorbeeld veranderen met de temperatuur, vooral in de Tris-buffer. In een dergelijk geval is het van cruciaal belang om de pH in te stellen op basis van de temperatuur waarop het experiment wordt uitgevoerd¹⁸. Opgemerkt moet ook worden dat eiwitoplossing aanzienlijk minder tijd kost (van een paar minuten tot een paar uur) in vergelijking met de groei van eiwitkristal (van een paar uur tot een paar dagen). Over het algemeen neemt de temperatuur tijdens de ontbinding van de kristallen geleidelijk en langzaam toe (met inachtneming van de korte totale ontbindingstijd), voornamelijk in het geval van gedeeltelijke ontbinding van de kristallen om de toename van de kristalmozaïekiteit te voorkomen. Wanneer de kristallen groeien, kan de temperatuur snel (in minder dan een minuut) dalen tot de ingestelde temperatuur (met inachtneming van de lange totale groeitijd). Regelmatige controle van de kristallisatiekamer door het opnemen van beelden is raadzaam om schade aan het eiwit te voorkomen en te helpen bij het bepalen van de optimale tijd voor ontbinding of groei van kristallen voor elk bestudeerd eiwit.
   5. Nadat alle kristallen zijn opgelost, stelt u de temperatuur in op 295 K om een tweede nucleatiegebeurtenis te starten (figuur 10, stappen: 6,7). Neem elke 5 minuten beelden op om het tweede nucleatieproces te volgen. In deze stap verschijnen de eerste kernen na ongeveer 18 minuten.
      OPMERKING: Bij deze temperatuur bevindt de oplossing zich in de nucleatiezone, in de buurt van de uitzaaibare zone. Als gevolg hiervan verschijnen er slechts een paar kernen in de kristallisatiekamer.
   6. Ga door met het experiment en herhaal de optimalisatieworkflow die wordt beschreven in sectie 2.3 voor het kweken van grotere kristallen. De totale duur van het experiment in figuur 10 is slechts enkele dagen.
      OPMERKING: Als tijdens de nucleatiefase de kristallen op verschillende tijdstippen verschijnen, worden kristallen van verschillende grootte verkregen in de kristallisatiekamer. In een dergelijk geval zal de temperatuurstijging (in het geval van eiwitten met directe oplosbaarheid) resulteren in een snellere ontbinding van de kleinere kristallen. Afhankelijk van het kinetische rijpingseffect kan het extra eiwit (verkregen door ontbinding) vervolgens worden gebruikt voor de groei van de grotere kristallen.
      Bij het oplossen van kristallen bij constante temperatuur door de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing te veranderen, gaat u als volgt verder met het experiment:
      Het is ook mogelijk om eerder geteelde kristallen op te lossen door de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing tijdens het experiment te veranderen om een populatie van uniforme kristallen onder nieuwe omstandigheden opnieuw te laten groeien.
   7. Bereid de eiwitoplossing (2.3.1), de temperatuurgecontroleerde vloeiende reservoirdialyse-opstelling (2.1) en de kristallisatieoplossing (2.4.2) zoals hierboven beschreven. Onder de eerste omstandigheden in de nucleatiezone ver van de uitzaaibare zone verschijnen talrijke kleine kristallen in de kristallisatiekamer en beginnen ze te groeien (figuur 11, stappen: 1,2).
   8. Na drie uur, wanneer veel middelgrote kristallen zichtbaar zijn in de kristallisatiekamer(figuur 11,stap: 3), verlaagt u de NaCl-concentratie (0,9 M) geleidelijk tot nul. Bereid hiervoor een nieuwe kristallisatieoplossing voor die alleen bufferoplossing bevat met 0,1 M CH₃COONa pH 4. Gebruik het pompsysteem om het te vervangen door de kristallisatieoplossing in de reservoirkamer. Volg de stappen 2.2.10 tot en met 2.2.12 voor de bereiding en injectie van een nieuwe oplossing in de reservoirkamer. Met deze nieuwe oplossing neemt de NaCl-concentratie in de kamer af wanneer oplossingen worden uitgewisseld totdat de uiteindelijke oplossing in de reservoirkamer niet meer dan 0,1 M CH₃COONa pH 4 en geen NaCl bevat. Leg elke 10 minuten beelden vast om het ontbindingsproces vast te leggen.
   9. Laat de kristallen volledig oplossen (figuur 11, stappen: 4,5). De ontbindingstijd is ongeveer twee uur voor dit experiment. Zoals eerder vermeld, is de ontbindingstijd afhankelijk van het eiwitsysteem, de kristallisatieomstandigheden en het gebruikte dialysekamervolume. Regelmatige observatie van de kristallisatiekamer (zie microscoopsectie) en het opnemen van beelden en notities tijdens het experiment zijn essentieel.
   10. Wanneer alle kristallen in de kamer zijn opgelost(figuur 11,stap: 5), gebruikt u het pompsysteem opnieuw om een nieuwe kristallisatieoplossing voor te bereiden door NaCl in een lagere concentratie te injecteren dan de vorige (0,75 M NaCl in 0,1 M CH₃COONa pH 4).
   11. Injecteer de nieuwe oplossing in de reservoirkamer (figuur 11, stappen: 6,7) en herhaal de kristallisatiegroeioptimalisatieworkflow zoals beschreven in paragraaf 2.3. Er zal een uniforme populatie van grotere kristallen worden gegenereerd. De resultaten in figuur 11 werden na enkele dagen verkregen.

Representative Results

In de paragrafen 2.3 en 2.4 worden drie voorbeelden van geoptimaliseerde kristalgroei gepresenteerd, die het gebruik van het instrument en een experimenteel ontwerp voor de teelt van grote kristallen laten zien. Voor deze demonstratie hebben we lysozym gebruikt als modeleiwit, hoewel kristalgroeiexperimenten met succes zijn uitgevoerd met veel andere eiwitsystemen met behulp van deze methode (zie hierboven). Door het hier gepresenteerde protocol te gebruiken en onder de knie te krijgen, kan men het aanpassen voor andere eiwitkandidaten.

In paragraaf 2.3 hebben we aangetoond dat gevestigde rationele kristallisatiestrategieën gunstig kunnen zijn bij het kweken van kristallen met voldoende verstrooiingsvolumes voor neutroneneiwitkristallografie. Hier tonen we aan dat de voorgestelde rationele optimalisatiestrategieën ook het mogelijk maken om een uniforme populatie kristallen van elke specifieke grootte te genereren die nodig is voor downstreamstructuurbepalingsbenaderingen.

Deze twee experimenten zijn ontworpen om het belang van fasediagrammen bij het beheersen van kristalkernatie en groei te benadrukken. Hier worden controle van de temperatuur en chemische samenstelling van kristallisatieoplossingen in combinatie met het monitoren van het kristallisatieproces in realtime gebruikt om het kwalitatieve fasediagram te bestuderen. Met behulp van deze methode kunnen nucleatie en kristalgroei rationeel worden geoptimaliseerd op een omkeerbare manier. Het gebruik van een dergelijke seriële benadering vermindert ook de hoeveelheid eiwit en de tijd die nodig is om de grootte en kwaliteit van de kristallen te controleren.

Bij de dialysemethode wordt een eiwitoplossing gescheiden van een kristallisatieoplossing door een halfdoorlatend^{membraan 6} (figuur 5). Met dit dialysemembraan kunnen kleine moleculen zoals additieven, buffers en ionen door het membraan gaan, maar geen macromoleculen zoals eiwitten^6,20. Met deze functie kan de kristallisatieoplossing tijdens het experiment worden gewijzigd⁶. Uitwisseling van de oplossing kan handmatig worden gedaan, bijvoorbeeld in microdialyseknoppen, of op een geautomatiseerde manier met behulp van een instrument dat voor dit doel is ontwikkeld, OptiCrys⁸.

In de eerste reeks experimenten werden microdialyseknoppen gebruikt voor de kristallisatie van kippeneiwit lysozym. Microdialyseknoppen werden ondergedompeld in kristallisatieoplossingen met verschillende zoutconcentraties. In dit eenvoudige kristallisatierasterexperiment is de enige variabele de neerslagconcentratie terwijl de temperatuur constant wordt gehouden (293 K). Zoals weergegeven in figuur 4,veroorzaken kleine variaties in de zoutconcentratie een verandering in de grootte en het aantal waargenomen kristallen, waardoor het kristallisatiefasediagram kan worden onderzocht. In figuur 4,deelvenster 1, bevat de kristallisatieoplossing 0,7 M NaCl en een beperkt aantal grotere kristallen in de knoppen. Door de zoutconcentratie te verhogen van 0,7 naar 1,2 M neemt de oververzadiging toe en beweegt de oplossing in de nucleatiezone weg van de uitzaaibare zone (figuur 4, panelen 1 t/m 6). Als gevolg hiervan neemt het aantal kristallen toe en neemt hun grootte af.

In het eerste experiment met een volledig geautomatiseerd instrument dat temperatuurgecontroleerde dialysekristallisatie mogelijk maakt, OptiCrys (figuur 9), werd het kristalgroeiexperiment op maat gemaakt om grote kristalgroei te genereren. Het experiment werd gelanceerd bij een begintemperatuur van 295 K met een kristallisatieoplossing met 0,75 M NaCl en 0,1 M Na acetaatbuffer pH 4. Onder deze experimentele omstandigheden bereikte de kristallisatieoplossing de nucleatiezone in de buurt van de uitzaaibare zone van het fasediagram (figuur 9, pijl 1). Als gevolg hiervan werden slechts enkele kernen gegenereerd tijdens de eerste fase van het experiment. Om geselecteerde kristallen verder te laten groeien (zie figuur 9)werd de kristalgroeioptimalisatieworkflow door wisselende temperatuur naar de uitzaaibare zone gedreven zodra het kristaloplossingsevenwicht was bereikt.

Telkens wanneer het evenwicht tussen kristal en oplossing werd bereikt, werd de temperatuur verlaagd, eerst tot 291 K, vervolgens tot 288 K en uiteindelijk tot 275 K, om de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone te houden. Het resultaat van dit experiment is een enkel groot kristal dat geschikt is voor zowel macromoleculaire röntgenstraling als neutronenkristallografie.

Voor de meeste eiwitten is het precieze kwantitatieve fasediagram (of gewoon een kwalitatief diagram) nog niet verkregen vanwege het gebrek aan experimentele apparaten die de eiwitconcentratie nauwkeurig kunnen meten (of gewoon het kristallisatieproces in realtime kunnen observeren/detecteren) tijdens kristallisatie-experimenten¹⁸. Als gevolg hiervan is het vaak niet mogelijk om het experiment zo te ontwerpen dat kristallisatie begint in het optimale gebied van het fasediagram, in de buurt van de uitzaaibare zone.

Daarom moet een kristallisatieoptimalisatiestudie plaatsvinden voordat het experiment dat is gewijd aan de groei van een kristal met een groot volume wordt uitgevoerd. In deze studie zijn enerzijds temperatuurschommelingen (bij constante chemische samenstelling) en anderzijds variaties in chemische samenstelling (bij constante temperatuur) nodig om de uitzaaibare zone te identificeren en de optimale omstandigheden af te baken voor het starten van een groot kristalgroeiexperiment.

Hiertoe worden twee andere experimenten gepresenteerd die zijn afgestemd om de reversibiliteit aan te tonen van de temperatuurgecontroleerde dialysekristallisatie-experimenten met OptiCrys voor nucleatie, kristalgroei, ontbinding en hergroei. De kristalgroeioptimalisatieworkflow werd gecontroleerd zodat een uniforme populatie van minder, grotere lysozymekristallen werd gekweekt, met behulp van variatie in temperatuur of neerslagconcentratie.

In het tweede experiment met OptiCrys werd de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing gedurende het hele experiment constant gehouden (0,9 M NaCl in 0,1 M CH₃COONa pH 4) met variabele temperatuur. De begintemperatuur werd ingesteld op 291 K. De resultaten van dit experiment zijn samengevat in figuur 10. Door hoge oververzadiging verschenen een groot aantal kleine kristallen in de kristallisatiekamer (figuur 10, panelen 1 en 2). In overeenstemming met het concept van directe oplosbaarheid van eiwitten, door de temperatuur geleidelijk te verhogen tot 313 K, werden alle kristallen opgelost (figuur 10,panelen 3, 4 en 5). Ten slotte, door de temperatuur te verlagen tot 295 K, werd de tweede nucleatie gestart in de buurt van de uitzaaibare zone en maakte gecontroleerde vorming van een lager aantal kernen mogelijk. Verdere kristalgroei resulteerde in de uniforme opwekking van een populatie grotere kristallen (figuur 10, deelvenster 7).

Zoals getoond in figuur 11, kan variatie van de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing, bij een constante temperatuur van 291 K, ook worden gebruikt om een uniforme populatie van grotere kristallen te verkrijgen. Net als bij het vorige experiment was de oorspronkelijke toestand 0,9 M NaCl in 0,1 M CH₃COONa pH 4. De NaCl-concentratie werd vervolgens geleidelijk verlaagd van 0,9 M naar nul om de kristallen op te lossen (figuur 11, panelen 4 en 5). Op dit moment werd NaCl volledig vervangen door een bufferoplossing van 0,1 M CH₃COONa pH 4. Het verlagen van de zoutconcentratie houdt de oplossing in de onderverzadigde zone van het fasediagram, wat leidt tot de ontbinding van de kristallen. Vervolgens werd een nieuwe kristallisatieoplossing met een lagere ionische sterkte, bij 0,75 M NaCl in 0,1 M CH₃COONa pH 4, in de reservoirkamer geïnjecteerd. Bij deze neerslagconcentratie verschenen de eerste kernen (figuur 11, paneel 6) na 90 minuten. Het aantal gegenereerde kristallen was lager en de kristallen bereiken een groter volume (figuur 11, paneel 7) dan voorheen.

Figuur 1: Schematisch fasediagram. Kinetische trajecten voor drie kristallisatietechnieken zijn vertegenwoordigd in een zoute regime. Elke methode bereikt nucleatie en kristallisatie anders, gevisualiseerd door een andere kinetische route door het fasediagram om de nucleatie en uitzaaibare zones te bereiken. De oplosbaarheidscurve scheidt onderverzadigings- en oververzadigingsgebieden. Oververzadiging is verdeeld in drie zones: uitzaaibaar, nucleatie en neerslag. In de nucleatiezone vindt spontane nucleatie plaats terwijl in de uitzaaibare zone kristalgroei plaatsvindt. Deze figuur is aangepast van Junius et al. ⁸Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schematische weergave van de kristallisatiebank (OptiCrys). De LED-lichtbron bevindt zich bovenop de temperatuurgecontroleerde dialysestroomcel. Een omgekeerde microscoop en de digitale camera worden rechtsboven op de afbeelding weergegeven met de rode pijl. De rode cirkel vertegenwoordigt de locatie van de koelslang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Schematisch tweedimensionaal fasediagram voor eiwitkristallisatie als functie van temperatuur (A) en neerslagconcentratie (B). (A) In het geval van een eiwit met directe oplosbaarheid houdt het verlagen van de temperatuur de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone. Temperatuurvariatie kan meerdere keren worden herhaald om het kristalgroeiproces te regelen totdat kristallen met het gewenste volume worden verkregen. (B) Het wijzigen van de concentratie van de neerslagoplossing kan ook worden gebruikt om de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone voor het kweken van kristallen te houden. Deze figuur is aangepast van Junius et al. ⁸Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kristallen van lysozym verkregen met behulp van de dialysemethode. Dit experiment werd uitgevoerd bij een constante temperatuur van 293 K in 0,1 M natriumacetaatbuffer pH 4. Het verhogen van de NaCl-concentratie van 0,7 M naar 1,2 M verhoogt de nucleatiesnelheid en resulteert in een groter aantal kristallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Overzicht van het eiwitkristallisatieproces volgens de dialysemethode. (A) Door het eiwit toe te voegen aan de kamer van de dialyseknop, (B) ontstaat er een koepelvorm aan de bovenkant van de kamer. (C) Er wordt een applicator gebruikt om de O-ring over te brengen naar de groef van de dialyseknop om het dialysemembraan op zijn plaats te bevestigen. (D) De dialyseknop is klaar voor onderdompeling in de reservoiroplossing. (E) Kristallisatieoplossing gaat door het semipermeabele membraan en kristallen beginnen zich in de kamer te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Schematische weergave van de temperatuurgestuurde vloeiende dialyseopstelling. (A) Het eiwitmonster wordt aan de dialysekamer toegevoegd. (B) Het dialysemembraan wordt met een O-ring met behulp van een applicator op de overchamber bevestigd. (C) De overchamber wordt gedraaid en bevestigd aan de bovenkant van de dialysekamer. Witte pijlen geven aan waar schroeven op de overchamber worden geplaatst. (D) De reservoirkamer wordt met de klok mee gedraaid (E) en bovenop de overchamber bevestigd. (F) De reservoirkamer is bedekt met een luchtdichte dop met connectoren naar een pompsysteem en (G) de stroomcel wordt in de messing steun geplaatst. Deze figuur is aangepast van Junius et al. ⁸Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Bereiding en injectie van de kristallisatieoplossing in het reservoir door het vloeistofsysteem (A). Buizen met zout en water zijn aangesloten op de druk-/vacuümregelaar (B) en op de draaiklep (C). Door gebruik te maken van de druk creëert de druk/vacuümregelaar een constante doorstroming van de vloeistoffen van de buizen naar de draaiklep. Elke vloeistof die door de debietmeter (D) gaat en de schakelaar wordt in de mengbuis (F) geïnjecteerd. Zodra alle vloeistoffen aan de mengbuis zijn toegevoegd, injecteert de schakelaar door enkele wijzigingen de uiteindelijke oplossing van de mengbuis in het reservoir (G). De vloeistof stroomt door het systeem in de richting van de pijlen in het diagram gemarkeerd in oplopende volgorde (van 1 tot 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Onderhoudsweergave van de toezichtsoftware. Deze weergave wordt gebruikt om verschillende parameters te regelen, zoals temperatuur, licht, kristallisatieoplossing en zoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Het fasediagram als functie van de temperatuur (geselecteerde afbeeldingen moeten in oplopende volgorde worden bijgehouden). Een enkel groot lysozymkristal wordt verkregen door de temperatuur systematisch te veranderen van 295 K naar 275 K. Bij elke stap wordt de kristalgroei gestopt bij het bereiken van de oplosbaarheidscurve. Het verlagen van de temperatuur door de oplossing in de uitzaaibare zone te houden, herstart de kristalgroei. De afbeeldingen hebben verschillende vergrotingsniveaus. Deze figuur is aangepast van Junius et al. ^8,18Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Optimalisatie van kristalgroei bij constante chemische samenstelling met behulp van temperatuurregeling (geselecteerde afbeeldingen moeten in oplopende volgorde worden bijgehouden). Het starten van het nucleatieproces in de nucleatiezone bij 291 K, ver van de uitzaaibare zone, resulteert in de vorming van talrijke kristallen. Het verhogen van de temperatuur tot 313 K lost vervolgens de kristallen op totdat er geen zichtbare kernen in de dialysekamer te zien zijn. Ten slotte herstart het verlagen van de temperatuur tot 295 K het nucleatieproces voor de tweede keer, wat leidt tot een beperkt aantal grotere kristallen. Deze figuur is aangepast van Junius et al. ^8,18Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Optimalisatie van kristalgroei bij constante temperatuur met behulp van variaties in neerslagconcentratie (geselecteerde beelden moeten in oplopende volgorde worden bijgehouden). Het verlagen van de neerslagconcentratie van 0,9 M naar 0 M lost de kristallen op die tijdens de eerste nucleatiegebeurtenis zijn verkregen. Het kristallisatieproces wordt opnieuw gestart door de injectie van hetzelfde neerslag, maar bij een lagere ionische sterkte, 0,75 M, wat leidt tot de vorming van een paar grotere kristallen. Deze figuur is aangepast van Junius et al. ^8,18Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Verschillende fysische, chemische en biologische variabelen beïnvloeden de kristallisatie van eiwitten door de oplosbaarheid van eiwitten te beïnvloeden²¹. Onder deze variabelen worden hier temperatuur en chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing gebruikt in combinatie met dialysetechniek om grote hoogwaardige kristallen van biomacromolecules te verbeteren en te kweken voor neutronendiffractiestudies. Door gebruik te maken van kennis van fasediagrammen wordt kristallisatie voorspelbaarder gemaakt. Hoewel screening van verschillende kristallisatieomstandigheden in een seriële benadering ook mogelijk is, is het belangrijkste doel van het gebruik van de gepresenteerde rationele benaderingen het scheiden en beheersen van de kinetiek van kristalkernatie en groei.

Net als bij alle kristallisatiestudies verhogen pure en homogene eiwitmonsters van hoge kwaliteit en stofvrije kristallisatieoplossingen het slagingspercentage van het experiment. Filtratie en centrifugeren van oplossingen zijn essentiële stappen in de beschreven protocollen. Het kennen van de fysisch-chemische eigenschappen van de bestudeerde eiwitten, zoals het molecuulgewicht (om het juiste dialysemembraan te kiezen), het iso-elektrische punt en de oplosbaarheid van eiwitten zijn cruciaal voor het ontwerp van een optimaal kristalgroeiexperiment. Ook moet rekening worden gehouden met eiwitstabiliteit bij verschillende temperaturen of met verschillende chemicaliën om monsterverlies te voorkomen en de kans op succes te vergroten. Gezien het temperatuurbereik van OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), kan een breed scala aan eiwitten ermee worden gekristalliseerd. Maar het is de moeite waard om te benadrukken dat eiwitten die voornamelijk thermostabieel zijn, zoals eiwitten uit thermofiele bronnen, het meest zouden profiteren van temperatuurgecontroleerde kristalgroeiexperimenten met een groot volume die door dit instrument worden aangeboden.

Met behulp van een dialysekamer met een laag volume (bij gebruik van OptiCrys) of microdialyseknoppen en het screenen van verschillende temperaturen en kristallisatieomstandigheden (bijv. rasters van neerslagconcentratie of pH), is het mogelijk om informatie te verkrijgen over de locatie van de grenswaarde van de uitzaaibare zone (kinetisch evenwicht tussen nucleatie en uitzaaibare zones). Dit is van onschatbare waarde bij het ontwerpen van een succesvol kristalgroeiexperiment, vooral voor nieuwe eiwitkandidaten in kristallisatie. Zonder deze informatie kunnen experimenten beginnen vanuit een gebied van het fasediagram met een hoge oververzadiging, te ver van de grens van de uitzaaibare zone om kristalkernatie gemakkelijk te beheersen. Hoewel de ontbinding van het eiwitprecipitaat kan worden geprobeerd, bijvoorbeeld door de temperatuur te verhogen in het geval van directe oplosbaarheid, voor eiwitten met verminderde thermostabiliteit, kan het langer op hoge temperatuur houden van het monster de eiwitprecipitatie onomkeerbaar maken. De beste strategie bestaat dus uit het gebruik van een eerste voorwaarde met lagere oververzadiging in de buurt van de grens van metastabiliteit, waar nucleatie kan worden gecontroleerd en eiwitneerslag kan worden vermeden. In lijn hiermee vermindert kristallisatievoorscreening de kans op een eiwitprecipitaat in de dialysekamer en verhoogt het de slagingssnelheid van het experiment.

Na het ontwerpen van een experiment is het voorbereiden van dialysekamers (OptiCrys) of microdialyseknoppen een andere belangrijke stap. Het voorkomen van luchtbelvorming in de dialysekamer/knop verhoogt de kans op succesvolle kristallisatie, vooral wanneer kleine volumes worden gebruikt. De aanwezigheid van luchtbellen in de dialysekamer kan ook de kinetiek van het kristallisatieproces veranderen en de reproduceerbaarheid van het experiment verminderen (omdat het contactoppervlak tussen eiwitten en oplossingen is gewijzigd). Niet alleen eiwit, maar ook kristallisatieoplossing kan het succes van het experiment beïnvloeden. Het gebruik van nieuwe buizen van 50 ml voor het pompsysteem telkens wanneer men na elk experiment een nieuw experiment wil starten en wasslangen na elk experiment vermindert de kans op besmetting en vermijdt de creatie van zoutkristallen in het apparaat.

Het gebruik van microdialyseknoppen is een alternatief wanneer OptiCrys niet beschikbaar is. De hierboven genoemde strategieën voor het optimaliseren van kristallisatie en het monitoren van kristalgroei moeten handmatig worden uitgevoerd. Meestal vereist dit dat u zich buiten een thermogereguleerde incubator bevindt, wat problematisch kan zijn wanneer temperatuurregulatie een kritieke stap is in de beschreven methodologie. Dit vergemakkelijkt niet het veranderen van de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossingen, of het monitoren van kristalgroei door beeldvorming, zodat het kristalgroeiproces niet in realtime kan worden gecontroleerd.

Kennis van het fasediagram is de basis van het gebruik van de kristallisatiebank, OptiCrys, om systematisch grote, hoogwaardige kristallen op een geautomatiseerde manier te laten groeien. Controle van fysisch-chemische parameters zoals temperatuur, neerslagconcentratie en pH tijdens kristallisatie verplaatst het eiwit-oplossingsevenwicht in een goed gedefinieerd kinetisch traject over het fasediagram. Dit wordt aangevuld met het gebruik van een dialysemembraan om het massatransport aan te passen en een gecontroleerde gradiënt in de kristallisatiekamer te creëren die de grootte en kwaliteit van de kristallen beïnvloedt. Daarom is het gebruik van zowel thermodynamische gegevens als kinetische trajecten essentieel om het kristallisatieproces te beheersen om kristallen van hoge kwaliteit te laten groeien. Dankzij OptiCrys kunnen systematische fasediagrammen in een multidimensionale ruimte worden bestudeerd met een seriële benadering met aanzienlijk minder materiaal dan voorheen. Om deze methodologie aan te tonen, bieden we hier een casestudy met een modeleiwit, kippeneiwit lysozym. Door het hier gepresenteerde protocol te gebruiken en onder de knie te krijgen, kan men het aanpassen voor echte eiwitsystemen^5,14,17,18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µl Dialysis Button	Hampton Research	HR3-330	Dialysis button
24 well plates	Jena Bioscience	CPL-132	Crystallization plate
2-Switch	FLUIGENT	2SW001	Switch
30 μl Dialysis Button	Hampton Research	HR3-324	Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828-500EA	Centrifuge tubes
Acetic acid	Sigma-Aldrich	S2889	Chemical
Chicken Egg White Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO	Spectrum	132478	Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO	Spectrum	132650T	Dialysis membrane
Microcentrifuge	Eppendorf	Minispin	Bench-top centrifuge
Flow Unit	FLUIGENT	FLU-XL	Flow meter
Flowboard	FLUIGENT	FLB	Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ	FLUIGENT	EZ-01000002	Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters	Millipore	GSWP04700	0.22 μm pore size filter
M-Switch	FLUIGENT	MSW002	Rotary valve
Opticrys	NatX-ray	PRT008	Crystallization bench
Siliconized circle cover slides	Hampton Research	HR3-231	Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99%	Sigma-Aldrich	746398	Chemical
Switchboard	FLUIGENT	SWB002	Switchboard
Thermoregulated incubator	Memmert	IPP30	Thermoregulated incubator