Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En effektiv metode for Adenovirusproduksjon

Published: June 10, 2021 doi: 10.3791/61691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Cellular Biology and Pathology "Nicolae Simionescu"

Summary

Her presenterer vi en protokoll for adenovirusproduksjon ved hjelp av pAdEasy-systemet. Teknologien inkluderer rekombinasjon av pAdTrack og pAdEasy-1 plasmider, adenovirusemballasje og forsterkning, rensing av adenoviralpartiklene fra cellelysat og kulturmedium, viral titrering og funksjonell testing av adenoviruset.

Abstract

Adenoviral transduksjon har fordelen av en sterk og forbigående induksjon av uttrykket av genet av interesse til et bredt utvalg av celletyper og organer. Imidlertid er rekombinant adenoviral teknologi arbeidskrevende, tidkrevende og dyr. Her presenterer vi en forbedret protokoll ved hjelp av pAdEasy-systemet for å oppnå rensede adenovirale partikler som kan indusere et sterkt grønt fluorescerende proteinuttrykk (GFP) i transinduserte celler. Fordelene ved denne forbedrede metoden er raskere forberedelse og redusert produksjonskostnad sammenlignet med den opprinnelige metoden utviklet av Bert Vogelstein. Hovedtrinnene i adenoviralteknologien er: (1) rekombinasjonen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier; (2) emballasjen til de adenovirale partiklene; (3) forsterkning av adenoviruset i AD293-celler; (4) rensing av adenovirale partikler fra cellelys og kulturmedium; og (5) viral titrering og funksjonell testing av adenoviruset. Forbedringene av den opprinnelige metoden består av (i) rekombinasjonen i BJ5183-inneholdende pAdEasy-1 ved kjemisk transformasjon av bakterier; (ii) valg av rekombinante kloner med "negative" og "positive" PCR; (iii) transfeksjon av AD293 celler ved hjelp av K2 transfection system for adenoviral emballasje; (iv) utfellingen med ammoniumsulfat av de virale partiklene som frigjøres av AD293-celler i cellekulturmediet; og (v) rensing av viruset ved ett-trinns cesiumklorid diskontinuerlig gradient ultracentrifugation. Et sterkt uttrykk for genet av interesse (i dette tilfellet GFP) ble oppnådd i forskjellige typer transinduserte celler (som hepatocytter, endotelceller) fra ulike kilder (menneske, bovin, murine). Adenoviral-mediert genoverføring representerer et av hovedverktøyene for å utvikle moderne genterapier.

Introduction

Adenovirus er ikke-utviklede virus som inneholder en nukleocapsid og et dobbeltstrenget lineært DNA-genom1,2,3. Adenovirus kan infisere et bredt spekter av celletyper, og infeksjon er ikke avhengig av aktiv vertscelledeling. Etter infeksjon introduserer adenoviruset sitt genomiske DNA i vertscellekjernen, hvor det forblir epikromosomalt og transkriberer sammen med vertenes gener. Dermed oppnås en minimal potensiell risiko for innsetting av mutagenese eller oncogenes-regulering4,5,6. Det adenovirale genomet blir ikke replikert sammen med vertsgenomet, og dermed fortynnes de adenovirale genene i en delingscellepopulasjon. Blant fordelene med adenoviral transduksjon er det: (i) høye nivåer av transgene uttrykk; (ii) redusert risiko knyttet til integrering av viralt DNA i vertsgenomet, på grunn av episomalt uttrykk; (iii) transduksjon av et bredt utvalg av skille- og ikke-skillende celletyper. De fleste adenovirus som brukes i biomedisinsk forskning er ikke-replikerende, mangler E1 region7,8,9. For produksjonen kreves en cellelinje som leverer E1-sekvensen (for eksempel HEK293). Dessuten ble en ikke-essensiell region for den virale livssyklusen (E3) slettet for å tillate innsetting av en transgene i viralgenomet; andre regioner (E2 og E4) ble ytterligere slettet i noen adenovirus, men i disse tilfellene ble det rapportert et redusert utbytte av adenoviral produksjon og lavt uttrykk for transgene7.

Her presenterer vi en forbedret protokoll for konstruksjon, pakking og rensing av adenovirusene ved hjelp av AdEasy System. Disse forbedringene tillot pakking av adenoviruset på en raskere og mer økonomisk måte sammenlignet med den opprinnelige metoden utviklet av Bert Vogelstein2,10, på grunn av følgende fordeler: (i) rekombinasjonen i BJ5183-inneholdende pAdEasy-1 ved kjemisk transformasjon av bakterier; (ii) valg av rekombinante kloner av PCR; (iii) transfeksjon av AD293 celler ved hjelp av K2 transfection system for adenoviral emballasje; (iv) utfelling av adenovirale partikler fra kulturmediet etter viral emballasje og forsterkning; (v) adenoviral rensing ved hjelp av ett-trinns cesiumklorid (CsCl) gradient ultracentrifugation.

Protokollen for adenovirusproduksjon ved hjelp av AdEasy-systemet (figur 1) består av følgende trinn:

(1) Rekombinasjon av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 i BJ5183 bakterier
(2) Emballasje av adenovirale partikler
(3) Forsterkning av adenoviruset
(4) Rensing av adenovirale partikler fra cellelys og kulturmedium
(5) Adenovirustitrering.

Figure 1
Figur 1: Produksjonsteknologien for adenovirus. Hovedtrinnene i adenoviralteknologien er: (1) Rekombinasjonen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier. De valgte rekombinerte plasmidene forsterkes i DH5α-bakterier og renses deretter; (2) Emballasjen til adenoviralpartiklene i AD293-celler, som produserer adeno-E1-proteiner; (3) Forsterkning av adenoviruset i AD293-celler; (4) Rensing av adenovirale partikler fra cellelyset og kulturmediet ved ultracentrifugation på en CsCl tetthet gradient; (5) Titrering av adenoviruset og den funksjonelle testingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I denne protokollen eksemplifiserte vi teknologien for produksjon av adenoviruset, noe som kan indusere uttrykket av GFP i vertscellene. GFP er allerede satt inn i ryggraden i pAdTrack-CMV-shuttle-vektoren (Addgene #16405), under en annen CMV-promotor og brukes som reportergen (figur 1). Av denne grunn utpekte vi pAdTrack-CMV-vektoren som pAdTrack-GFP, og vi vurderte uttrykket av GFP for demonstrative formål. Foruten GFP-uttrykk, kan systemet brukes til å overekspressere et gen av interesse, som kan klones på de mange kloningsstedene til pAdTrack-CMV. Et gen eller en minigene klonet i pAdTrack-CMV er vanligvis mer effektivt for uttrykksinduksjon sammenlignet med cDNA11. Dataene viste et sterkt GFP-uttrykk i transinduserte celler (som hepatocytter, endotelceller) fra ulike kilder (human, bovin, murine). Adenoviral-mediert genoverføring representerer et av hovedverktøyene for å utvikle moderne genterapier.

Protocol

Sikkerhetsmerknad: Generelt er adenovirus klassifisert som biosikkerhetsnivå 2 organismer, og dermed må alle manipulasjoner gjøres i et klasse II biosikkerhetsskap av en trent person, iført biofare verneutstyr (inkludert hansker, ansiktsmaske for biologiske aerosoler, labfrakk, etc.). Alle faste materialer kontaminert med adenoviruset må desinfiseres med en 10% blekemiddelløsning i 30 min og autoklavert i 30 minutter ved 121 °C og 1 bar. Avhengig av genet som er satt inn, kan adenoviruset som opprettes ha farlig potensial og kan klassifiseres i andre biosikkerhetsnivåer.

1. Eksperimentell forberedelse

  1. Bruk en separat cellekulturhette for adenovirale manipulasjoner, og en separat inkubator for hver adenovirustype. Bruk T-kolber med filterhetter for viral emballasje og forsterkning; unngå så mye som mulig transduksjonseksperimenter i ventilerte Petri-plater.
  2. Tøm cellekulturhetten etter hver bruk og utsett den for UV i 15 minutter.
  3. Autoklav med jevne mellomrom pipettehjelp, pipetter og andre redskaper. Om mulig, kultur i et eget cellekulturlaboratorium / hette cellene for adenoviral emballasje (AD293-celler) og cellene som skal brukes i transduksjonsforsøk. Partier med forskjellige adenovirus forsterket i samme periode bør kontrolleres for krysskontaminering av PCR.
  4. Forbered følgende løsninger.
    1. Forbered SOB (Super Optimal Broth) medium: 20 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 0,5 g NaCl (10 mM endelig konsentrasjon), 2,5 ml 1 M KCl (2,5 mM endelig konsentrasjon), amd H2O til 1 L. Etter autoklavering ved 121 °C, tilsett følgende sterile oppløsninger: 5 ml 1 M MgCl2 og 5 ml 1 M MgSO4.
    2. Forbered SOC (Super Optimal buljong med katabolittundertrykk) medium: i 1 L steril SOB legg til følgende sterile løsninger: 20 ml 1 M glukose, 5 ml 1 M MgCl2 og 5 ml 1 M MgSO4.
    3. Forbered nedbørsløsning: oppløs 29,5 g kaliumacetat i 60 ml H2O, tilsett 11,5 ml eddiksyre og H2O til 100 ml.
    4. Forbered resuspension buffer: 95 ml 20% glukose, 5 ml 1 M Tris-Cl pH 8, 4 ml 0,5 M EDTA pH 8, og tilsett H2O til 200 ml.
    5. Forbered lysisløsning: 4,8 ml 8,3 M NaOH, 10 ml 20 % SDS og H2O til 200 ml.

2. Rekombinasjon av pAdTrack-GFP viral vektor med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier

  1. Linearisering av pAdTrack-GFP og rensing av den lineariserte plasmiden.
    1. Forbered følgende fordøyelsesblanding på is:
      10 μg pAdTrack-GFP
      5 μL 10x fargeløs buffer
      2 μL pme I
      H2O av til et endelig volum på 50 μL.
    2. Inkuber ved 37 °C i 3 timer i et vannbad.
    3. Inaktiver ved 65 °C i 20 minutter.
    4. Kontroller effektiviteten av fordøyelsen av pAdTrack-GFP med Pme I: Kjør 1 μg av den fordøyde plasmid parallelt med 1 μg ufordøyd plasmid på en 0,8% agarose gel.
  2. Isolering og rensing av DNA
    MERK: Trinn 1-6 må utføres i en avtrekkshette.
    1. Tilsett et likt volum fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1) over fordøyelsesblandingen og snu røret til blandingen er homogen.
    2. Sentrifuge i 3 min ved 16,200 x g, og overfør deretter den øvre vandige fasen til et oppsamlingsrør.
    3. Tilsett et likt volum fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1) over den nedre organiske fasen og virvelen.
    4. Sentrifuge i 3 min ved 16 200 x g, og overfør deretter den øvre fasen til samme oppsamlingsrør.
    5. Tilsett et likt volum kloroform over den vandige fasen høstet i oppsamlingsrøret og virvelen.
    6. Sentrifuge i 3 min ved 16,200 x g, og overfør deretter den øvre vandige fasen til et nytt oppsamlingsrør.
    7. Tilsett et 1/10 volum 3 M natriumacetat og 2 volumer kaldt 100% etanol og virvel.
    8. Inkuber i 1 time ved -70 °C eller over natten ved -20 °C.
    9. Tine prøven på is og sentrifuger den i 10 min ved 16 200 x g og 4 °C.
    10. Fjern supernatanten og tilsett 750 μL 75% etanol.
    11. Sentrifuge i 3 min ved 16,200 x g og 4 °C og fjern supernatanten.
    12. Snurr kort røret for å fjerne all supernatanten og tørk pelletsen i hetten. Ikke tørk DNA-pelletsen i lang tid fordi det er vanskelig å oppløse.
    13. Løs opp pelletsen i 15 μL H2O.
    14. Mål DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer (f.eks. nanodrop).
  3. Transformasjon av AdEasier-1 bakterier med pAdTrack-GFP
    MERK: I dette trinnet foregår rekombinasjonen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid.
    1. Forbered AdEasier-1 (BJ5183-inneholdende pAdEasy-1, Addgene #16399) kjemiske kompetente bakterier, ved hjelp av et kommersielt transformasjonssett, i følge produsentens instruksjoner. Hold aliquots på 100 μL kompetente bakterier ved -80 °C.
    2. Tine en aliquot av kompetente AdEasier-1 bakterier på is og tilsett 1 μg renset Pme I -fordøyd pAdTrack-GFP. Bland forsiktig ved å flikke røret (ikke pipette blandingen). Inkuber i 10 min på is.
    3. Tilsett 900 μL SOC medium og inkuber i 1 time ved 37 °C med risting.
    4. Mikrofunksjon i 5 min ved 600 x g.
    5. Fjern 900 μL av supernatanten, bland pellets og supernatant, og frø de transformerte bakteriene på LB-agarplater med kanamycin.
    6. Inkuber i ca. 16 timer ved 37 °C (må ikke overstige 18 timer).
  4. Valg av mulige positive kloner av PCR
    1. Del tannpirkere i to halvdeler og steriliser halvtannpirkerne ved autoklavering.
    2. Plukk opp små og gjennomskinnelige kolonier ved hjelp av sterile halvtannpirkere.
    3. Roter kort halvtannpiken med bakterier i 10 μL vann (i et PCR-rør) og legg deretter halvtannpiken i et 1,5 ml Eppendorf-rør som inneholder 100 μL SOC-medium med kanamycin. Inkuber i 4-6 timer ved 37 °C, mens du tester klonene med "negativ" og "positiv" PCR.
    4. Inkuber PCR-rørene som inneholder 10 μL vann med bakterier i 5 min ved 95 °C for å oppnå bakterieprøven og kjøre parallelt med den "negative" og "positive" PCR.
    5. "Negativ" PCR - for å teste pAdTrack-GFP-integriteten: Forbered følgende PCR-blanding for den negative PCR på is.
      5 μL av bakterieprøven
      0,1 μL primer fremover (4631 F: 5'-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG)
      0,1 μL primer revers (5616 R: 5'-TATGGGGGCTGTAATGTGTCTC)
      0,1 μL dNTP 10 mM
      3 μL 5x buffer
      1,5 μL MgCl2 25mM
      0,1 μL GoTaq Polymerase
      H2O til et endelig volum på 15 μL
      MERK: Den positive kontrollen der DNA-malen er pAdTrack-GFP-vektoren må inkluderes.
    6. "Positiv" PCR - for å teste tilstedeværelsen av genet av interesse. Bruk spesifikke primere for det innsatte genet og forbered blandingen som i forrige trinn. Primerne som ble brukt til GFP var følgende:
      K: 5'-CAAGGACGACGGCAACTACA
      R: 5'-ATGGGGGTGTCTGCTGGTA
    7. Kjør parallelt med den "negative" og den "positive" PCR. PCR-programmet er: 5 min, 95 °C; 40 sykluser av følgende trinn: 30 sek, 95 °C; 30 sek, 68 °C; 1 min, 72 °C; siste forlengelse: 10 min, 72 °C.
      MERK: Tilpass glødetemperaturen for forsterkning av genet av interesse.
    8. Evaluer PCR-produktene på en 1% agarose gel og gjør valg av kloner.
    9. Vurder for videre behandling av klonene som ikke gir noen PCR-produkter for den "negative PCR" og det spesifikke PCR-produktet etter den "positive PCR".
  5. Vokse bakteriekulturene til utvalgte rekombinante kloner
    1. Fortynn kulturene til de antatt positive klonene (resulterte i trinnet 2.4.3.) i 4 ml SOC-medium med kanamycin, og inkuber dem over natten ved 37 °C med risting.
  6. Isolering av plasmid DNA fra AdEasier-1 bakterier (Miniprep ved hjelp av alkalisk lysis)
    1. Overfør 1,5 ml bakteriekultur i mikrocentrifugerør, sentrifuge i 1 min ved 16 200 x g, og fjern supernatanten.
    2. Overfør en annen bakteriekultur på 1,5 ml i samme rør, gjenta sentrifugering og fjern supernatanten.
    3. Tilsett 200 μL resuspension buffer (50 mM glukose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8).
    4. Tilsett 200 μL lysisoppløsning (0,2 N NaOH, 1% SDS), bland forsiktig ved å invertere røret.
    5. Tilsett 200 μL av nedbørsoppløsning (60 ml 5 M kaliumacetat, 11,5 ml issyre, tilsett H2O til 100 ml), og bland forsiktig ved å invertere røret.
    6. Sentrifuge i 3 min ved 16 200 x g.
    7. Overfør supernatanten i et nytt mikrocentrifugerør, tilsett 500 μL isopropanol, bland og inkuber i 20 minutter på is.
    8. Sentrifuge i 15 min ved 16 200 x g og tilsett 500 μL 75% etanol.
    9. Sentrifuge i 10 min ved 16,200 x g og fjern supernatanten.
    10. Sentrifuge i 3 min ved 16 200 x g, fjern supernatanten og tilsett 15 μL H2O.
  7. Forsterkning, isolasjon og re-testing av rekombinerte plasmider
    1. Transformasjon av DH5α bakterier med DNA isolert fra AdEasier-1 celler.
      1. Forbered DH5α kompetente bakterier ved hjelp av det kommersielle transformasjonssettet, i følge produsentens instruksjoner.
      2. Tine 100 μL DH5α kompetente bakterier på is, tilsett det rekombinante DNA-et og inkuber 10 min på is. Frø deretter bakteriene på LB-agarplater med kanamycin.
      3. Inkuber ved 37 °C over natten.
      4. Plukk opp flere kolonier og vokse hver i 2 ml LB medium med kanamycin, ved 37 °C, over natten, med risting.
    2. Isoler DNA (Miniprep ved hjelp av alkalisk lysis) og resuspender det oppnådde DNA i 25 μL H2O.
    3. Bekreft de positive klonene ved enzymatisk fordøyelse.
      1. Forbered følgende blanding på is:
        5 μL rekombinant DNA
        1,5 μL 10x fargeløs buffer
        0,5 μL av Hind III eller PST I
        H2O til et endelig volum på 15 μL
      2. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
        MERK: Som en kontroll, fordøye også pAdTrack-GFP og pAdEasy-1 plasmider.
      3. I hvert utvalg legger du til 3 μL Sx6-lastebuffer med RNase A (hvis RNase A ikke finnes i miniprepbufferne).
      4. Kjør de fordøyde DNA-fragmentene på 1% agarose gelelektroforese.
        MERK: Fordøyelsesmønsteret til en positiv klone inkluderer de fleste fragmenter av den fordøyde pAdEasy-plasmiden, som avslører pAdEasy-rekombinasjon med pAdTrack-vektoren. Genet av interesse bør bevises ved fordøyelsen med begrensningen enzymer som brukes til kloning.
    4. Tilberedning av plasmid DNA (transfeksjonsgrad) for adenovirusemballasje.
      1. Vokse en 200 ml kultur av bakterier fra en positiv klone for å isolere plasmid DNA.
      2. Isoler plasmid-DNA-et ved hjelp av et kommersielt sett for plasmid DNA Midiprep (f.eks. Qiagen Plasmid Midi Kit) i henhold til produsentens instruksjoner.

3. Pakking av adenoviralpartiklene

  1. Dag 1. Frø AD293-cellene
    1. Vask AD293-cellene med PBS og inkuber dem med 0,125% Trypsin i 2-5 min ved 37 °C.
    2. Samle cellene i kaldt medium med serum.
    3. Sentrifuge i 5 min ved 400 x g ved 4 °C.
    4. Resuspend cellene i medium med serum og frø cellene med en tetthet på ~ 2 x 106/ T25 kolbe. Bruk helst en kolbe med et filter.
  2. Dag 1. Fordøye det rekombinante DNA-et med Pac I
    1. Forbered følgende blanding:
      6 μL rekombinant DNA (1 μg/μL)
      2 μL av Pac I
      2,5 μL 10x fargeløs buffer
      H2O til et endelig volum på 25 μL
    2. Inkuber i 3 timer (eller over natten) ved 37 °C, og deaktiver deretter enzymet ved 65 °C i 20 minutter.
    3. DNA-nedbør med etanol: Tilsett 2,5 μL (1/10 v/v) 3 M natriumacetat og 2-3 volumer 100% etanol. Inkubasjon i 30 min ved -70 °C eller over natten ved -20 °C.
    4. Sentrifuge ved 16.200 x g i 30 min ved 4 °C og resuspender pelletsen i sterilt vann.
  3. Dag 2: Transfeksjon av AD293-celler som bruker K2-reagens
    1. Tilsett 40 μL K2 multiplikator over cellene, to timer før transfeksjon.
    2. Klargjøre A- og B-løsninger:
      Løsning A: Tilsett 6 μg Pac l-linearisert DNA i 260 μL Opti-MEM.
      Løsning B: Tilsett 21,6 μL K2 reagens i 248,4 μL Opti-MEM.
    3. Tilsett løsning A over løsning B og bland forsiktig ved pipettering.
    4. Inkuber blandingen i 20 min ved romtemperatur. Legg til dråpevis A- og B-blanding i cellene.
  4. Dag 3-11: Overvåk GFP-uttrykket ved fluorescensmikroskopi
    MERK: Cellene skal virke grønne ved fluorescensmikroskopi og skal gradvis løsnes.
  5. Dag 11: Høst F1 adenovirale partikler
    1. Samle de frittliggende cellene og mediet i et 50 ml rør, skrap de tilhørende cellene og legg dem til i samme rør.
    2. Sentrifuge i 5 min ved 400 x g, samle supernatanten i et nytt rør og resuspend cellepellet i 0,5 ml PBS.
    3. Celleavbrudd
      1. Overfør cellefjæringen i et mikrosenterrør.
      2. Utfør tre fryse-/tinesykluser (frys i flytende nitrogen eller ved -80 °C /tine ved 37 °C i maksimalt 7 minutter).
      3. Før de ødelagte cellene gjennom en 23 G sprøytenål tre ganger.
    4. Fjern cellerester ved sentrifugering ved 9600 x g i 12 min.
    5. Overfør supernatanten til 50 ml-røret med det oppsamlede mediet.

4. Forsterkning av adenoviruset

MERK: Hvis AD293-cellene ikke nådde den nødvendige sammenløpet, kan aliquots av adenovirale bestander (lysat oppnådd fra virusproduserende celler) som skal brukes til infeksjon lagres ved -80 °C.

  1. Forbered F2-adenoviralpartiklene.
    1. Frø AD293 cellene i en T75 kolbe (5 x 106 celler / kolbe).
    2. Infiser ~90% konfluensierende AD293-celler ved hjelp av F1-adenoviralpartiklene: tilsett cellen homogenat og mediet fra T25-kolben over cellene som vokser i T75-kolben.
    3. Overvåk GFP-uttrykket ved fluorescensmikroskopi.
    4. Høst de virusproduserende cellene når ~90% av den transinduserte AD293 løsnes (~ den femtedagen etter transduksjon). Hold cellekulturmediet ved 4 °C.
    5. Forstyrre cellene (på samme måte som for F1) i 1 ml PBS.
  2. Forbered F3-adenoviralpartiklene.
    1. Infiser ~90% konfluente AD293 celler frøet i T175 kolbe med F2 adenovirale partikler og cellekulturmediet fra F2 adenovirale partikler.
    2. Høst cellene (~ 5 dager etter transduksjon).
    3. Forstyrre cellene (tilsvarende med de for F1) i 2 ml PBS.
  3. Forbered F4 adenovirale partikler.
    1. Infiser 5 T175-kolber som inneholder ~90 % sammenfallende AD293-celler med F3-adenovirale partikler og cellekulturmedium.
    2. Høst cellene (~ 5 dager etter transduksjon).
    3. Forstyrre cellene (tilsvarende med de for F1) i 3 ml PBS.
  4. Forbered F5 adenovirale partikler.
    1. Infiser 25 T175-kolber som inneholder ~90% sammenfallende AD293-celler med F4 adenoviral bestand og cellekulturmedium.

5. Rensing av adenoviruset fra cellelysat og kulturmedium

  1. Høsting av de virusproduserende cellene og kulturmediet.
    1. Høst AD293-cellene i F5 etter 5 dager fra transduksjon.
    2. Lagre mediet i en steril flaske for utfelling av adenoviralpartiklene.
      MERK: Oppbevar mediet i kjøleskapet til det er renset adenoviruset.
    3. Sentrifuger cellene ved 400 x g, i 5 min, ved 4 oC.
    4. Resuspend den endelige pellet i 5 ml av 10 mM Tris HCl, pH 8 med 2 mM MgCl2.
    5. Aliquot suspensjonen i 1,5 ml rør.
    6. Forstyrre cellene (på samme måte som for F1): tre sykluser med frysing/opptining.
      MERK: Hvis ultracentrifugation ikke kan utføres umiddelbart, hold prøvene ved -80 °C.
    7. Før celleopphenget gjennom en 23 G sprøytenål i tre ganger.
    8. Sentrifuger homogenatet ved 9 600 x g, i 12 min.
    9. Lagre supernatanten for adenovirusrensing ved CsCl gradient ultracentrifugation.
  2. Nedbør av adenoviruset utgitt i kulturmediet.
    1. Ta flasken med lagret cellekulturmedium ved romtemperatur.
    2. Tilsett 121 g ammoniumsulfat til hver 500 ml cellekulturmedium (metning av løsningen skal være mellom 40 -42%).
    3. Bland forsiktig til ammoniumsulfatet er helt oppløst.
    4. Inkuber i minst 2,5 timer ved romtemperatur.
    5. Sentrifuge ved 1600 x g, i 15 min, ved 22 oC og lagre pelletsen.
    6. Resuspend pellet i 4 ml av 10mM Tris HCl pH 8 med 2mM MgCl2; denne suspensjonen skal renses umiddelbart ved CsCl gradient ultracentrifugation.
      MERK: Hvis rensetrinnet ikke kan utføres senere, dialyze over natten den resuspended pellet mot 10mM Tris HCl, pH 8 med 2mM MgCl2.
  3. Adenovirusrensing ved ultracentrifugation.
    1. Forbered en diskontinuerlig CsCl-gradient i polypropylenrør for SW41Ti-rotoren. Tilsett 3 ml 765 mg/ml CsCl (høy tetthet: 1,4 g/l) nederst på røret. Tilsett sakte 3 ml 288,5 mg/ml CsCl (lav tetthet: 1,2 g/l) oppå det første CsCl-laget.
    2. Legg forsiktig 3 - 4 ml adenoviral partikkelfjæring frigjort fra cellene eller utfelt fra cellekulturmediet (som beskrevet tidligere) på toppen av gradienten.
    3. Fyll rørene med mineralolje, og legg rørene i de kalde SW41Ti-bøttene.
    4. Likevekt rørene. Pass på at de fylte polypropylenrørene er lastet symmetrisk inn i rotoren. Sett rotoren i ultracentrifuge.
    5. Sentrifuge ved 210.000 x g og 4 °C, i 18 timer, ingen brems.
    6. Plasser ultracentrifuge rørene på et stativ med et svart papir bak for å få båndene.
    7. Kast den klare øvre fasen, celleavfallet og det øvre båndet i en avfallsbeholder med blekeløsningen.
    8. Høst det laveste båndet som inneholder det komplette adenoviruset (~700 μL - 1 ml) i et sterilt 1,5 ml rør og hold det på is.
    9. For-våt en dialysekassett i dialysebuffer (10 mM Tris-Cl buffer pH 8, 2 mM MgCl2).
    10. Injiser det rensede adenoviruset i dialysekassetten med en 2 ml sprøyte.
    11. Dialyze over natten mot 10 mM Tris-Cl buffer pH 8, 2 mM MgCl2 (endre dialysebufferen 3 - 4 ganger).
    12. Høst adenoviralbestanden fra dialysekassetten i aliquots på 10 - 100 μL.
    13. Tilsett sukrose til 4% endelig konsentrasjon til virale aliquots (for kryobeskyttelse).
    14. Oppbevar aliquots ved -80 °C.

6. Adenovirustitrering

  1. Dag 1: Plating cellene
    1. Frø AD293-cellene med en tetthet på 2,5 × 105 celler per brønn (i en 12-brønns kulturplate) i 1 ml komplett vekstmedium, som vist i figur 2. Sørg for at cellene spres jevnt i hver brønn for nøyaktig titerbestemmelse.

Figure 2
Figur 2: Titreringsplatedesign. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Dag 2: Transduksjon av celler
    1. Løsne cellene fra en brønn med trypsin og telle dem. Legg merke til dette nummeret fordi det vil bli brukt til å beregne viral titer.
    2. Utfør serielle fortynninger (1/104; 1/105; 1/106; 1/107) av virusbestanden i 1 ml komplett vekstmedium som følger:
    3. 1/103: fortynning av virusbestanden - tilsett 2 μL viral lager til 1998 μL komplett medium.
    4. 1/104: Gjør 1:10 fortynning av 1/103 ved å fortynne 120 μL til 1080 μL av komplett medium (A).
    5. 1/105: Gjør 1:10 fortynning av B ved å fortynne 120 μL A til 1080 μL komplett medium (B).
    6. 1/106: Lag 1:10 fortynning av C ved å fortynne 120 μL B til 1080 μL komplett medium (C).
    7. 1/107: Gjør 1:10 fortynning av D ved å fortynne 120 μL C til 1080 μL komplett medium (D).
      MERK: Forbered 3 rør av hver fortynning (A, B, C, D) for å utføre eksperimentet i triplikater.
    8. Fjern cellekulturmediet fra brønnene og legg til de forberedte fortynningene av viruset, som vist i figur 2.
  2. Dag 3: Overvåke GFP-uttrykk
    1. Kontroller brønnene for tilstedeværelse av grønne celler ved hjelp av et fluorescensmikroskop.
  3. Dag 4: Strømningscytometrianalyse av GFP-positive celler
    1. Forbered og merk tolv 1,5 ml rør.
    2. Samle cellekulturmediet (sammen med de frittliggende cellene) i 1,5 ml rør og hold dem på is.
    3. Tilsett 200 μL trypsin i hver brønn.
    4. Inkuber platen i 2 - 3 min ved 37 °C i CO 2-inkubatoren.
    5. Høst cellene i de samme Eppendorf-rørene med cellekulturmediet. Hold rørene på is.
    6. Pellet cellene på 400 x g, i 5 min, ved 4 °C.
    7. Fjern supernatanten; holde rørene på is.
    8. Resuspend pellet i 250 μL PBS + 2% FBS; holde rørene på is.
    9. Overfør cellefjæringen i strømningscytometrirør eller plate.
    10. Kjør prøvene på et strømningscytometer som registrerer fluorescensen til GFP-uttrykkscellene.
      Titerberegning: Prøvene med 5 - 20% GFP positive celler fra foreldrepopulasjonen bør tas i betraktning for beregning av viral titer ved hjelp av følgende formel:
      Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/V
      D = fortynningsfaktor
      F = prosent av positive celler / 100
      C = antall celler / brønn
      V = volum av viral inoculum

7. Adenoviral transduksjon av målceller og testing av det induserte proteinuttrykket

  1. Dag 1: Såing av cellene
    1. Frø målcellene som sikrer at de spres jevnt i brønnene.
  2. Dag 2: Transduksjon av cellene
    1. Koble målcellene fra én brønn og tell dem.
    2. Beregn riktig volum av adenoviral suspensjon som kreves for å transdusere cellene med ønsket antall smittsomme partikler per celle.
    3. Legg til den tilsvarende mengden viral suspensjon i målcellene.
  3. Dag 3: Fjerning av viral suspensjon og kontroll av GFP-uttrykk
    1. Erstatt cellekulturmediet som inneholder adenovirale partikler med friskt medium.
    2. Kontroller GFP-uttrykket ved fluorescensmikroskopet.

Representative Results

Vi modifiserte og forbedret den opprinnelige Vogelsteins protokoll for å oppnå raskere og mer effektiv adenovirusproduksjon. Først reviderte vi metodikken for å oppnå et enklere utvalg av rekombinanter. Etter rekombinasjon ble BJ5183 bakteriekloner testet av "negativ PCR" for å vurdere integriteten til pAdTrack-GFP som en indikator på mangelen på rekombinasjon (figur 3A), eller ved "positiv PCR" for å identifisere genet av interesse, assimilert i vårt tilfelle til GFP (Figur 3B). I både "negative" og "positive" PCR-er brukte vi pAdTrack-GFP som kontrollmal, som ga et bånd på 986 bp for pAdTrack-integritet (Figur 3A, bane 1) og et bånd på 264 bp for GFP (Figur 3B, bane 3). Primerne som brukes til den "negative PCR" ble designet for å forsterke et fragment på 986 bp som inneholder PmeI-nettstedet i pAdTrack-GFP. Dette DNA-fragmentet forstørres drastisk etter rekombinasjon og forsterkes ikke i de positive rekombinante klonene. Negative kloner for rekombinasjon, der pAdTrack-GFP forble intakt, er representert i figur 3A, bane 3, 4 og 6. Primerne gløder på DNA-sekvensene ved siden av rekombinasjonsstedet. Potensielle positive rekombinante kloner (Figur 3A, bane 2 og 5) uttrykte GFP som vist i figur 3B, bane 1 og 2. Plasmid DNA fra disse klonene ble isolert og brukt til DH5α transformasjon for å oppnå en høyere mengde DNA. Disse forhåndsvalgte rekombinante plasmidene forsterket i DH5α ble deretter testet ved enzymatisk fordøyelse. I figur 3C-E er illustrert resultatene av enzymatisk fordøyelse av en rekombinant-positiv klone fordøyd med Hind III, PstI, BamHI restriksjon enzymer (Figur 3C, D, E lane 2). HindIII- og PstI-fordøyelsesmønstrene til den rekombinante klonen var lik de som ble oppnådd for pAdEasy-1 siden HindIII og PstI kuttet pAdEasy-1 plasmid henholdsvis 24 og 25 ganger (Figur 3C og D, bane 3); HindIII kuttet en gang og PstI kuttet fire ganger pAdTrack-GFP vektoren (Figur 3C og D, lane 1). BamHI kuttet to ganger pAdEasy-1 vektor (Figur 3C, bane 3), og en gang pAdTrack-GFP (Figur 3C, bane 1).

PacI kuttet ut et fragment på 4,5 kb fra den rekombinante plasmiden (Figur 3F, bane 2), et fragment på 2863 bp fra pAdTrack-GFP (Figur 3F, bane 1) og lineariserte pAdEasy-1-vektoren (Figur 3F, bane 3). DNA-stigen er representert i figur 3C-F, i kjørefelt 4. Den rekombinante plasmiden ble fordøyd med Pac I for videre bruk for AD293-transfeksjon.

Figure 3
Figur 3: Rekombinasjonen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1-plasmiden. Plasmidene oppnådd etter rekombinasjonen av pAdTrack-GFP og pAdEasy-1 ble testet av "negativ" PCR for pAdTrack-GFP-integriteten (A). De ikke-rekombinante klonene ble bevist ved tilstedeværelsen av et 986 bp-bånd som tilsvarer sekvensen forsterket fra pAdTrack-GFP-plasmid (A, baner 3, 4 og 6). Klonene som potensielt er positive for rekombinasjon (A, bane 2 og 5) ble også oppnådd. Da pAdTrack-GFP-vektoren ble brukt som mal, ble det oppnådd et bånd på 986 bp for pAdTrack-GFP (A, bane 1). De potensielt positive rekombinante klonene ble testet for GFP-uttrykk ved "positiv" PCR (B); et bånd på 264 bp vises for både potensielt rekombinerte kloner (B, bane 1 og 2), samt for pAdTrack-GFP-plasmid. DNA-et fra en potensiell rekombinant klone ble testet med HindIII, PstI, BamHI og PacI-begrensningsenzymet (C-F, bane 2). I kontrollene ble pAdEasy-1-vektoren (C-F, baner 3) og pAdTrack-GFP-plasmid (C-F, baner 1) fordøyd med de samme enzymene. DNA-stigen er representert i C-F lane 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Adenoviral emballasje og forsterkning ble utført i AD293-celler. De adenovirale partiklene (AdV-GFP) ble renset fra AD293-cellelyset så vel som fra cellekulturmediet, hvor de hadde blitt frigjort av de infiserte cellene. For å konsentrere adenoviruset som finnes i cellekulturmediet, ble partiklene utfelt med ammoniumsulfat og deretter resuspendert i 10 mM Tris HCl pH 8 med 2 mM MgCl2, samme buffer som den som brukes til cellelys. Deretter ble de adenovirale partiklene fra cellelyset og fra kulturmediet renset av CsCl diskontinuerlig gradient ultracentrifugation. Etter ultracentrifugation ble det oppnådd et sterkt bånd av renset AdV-GFP, som vist i figur 4.

Figure 4
Figur 4: Den adenovirale rensingen ved ultracentrifugation på en diskontinuerlig CsCl-gradient. Cellehomogenatet og adenoviruset som ble utløst fra mediet, ble utsatt for ultracentrifugation på en diskontinuerlig gradient dannet av CsCl-løsninger med lav og høy tetthet. Sterke bånd av GFP- adenovirus ble bevist i begge tilfeller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å bestemme viral titer uttrykt i transduserende enheter per en ml (TU / ml), ble AD293-cellene infisert med serielle fortynninger av AdV-GFP. Etter 48 timer uttrykte de infiserte cellene GFP, i en omvendt korrelasjon med fortynningsfaktoren til virusfjæringen. Dette ble observert ved fluorescensmikroskopi og prosentandelen av GFP-positive celler ble bestemt av strømningscytometri (figur 5). For å beregne titeret ble den virale fortynning som induserte 5 - 20% av GFP-positive celler vurdert (Figur 5C). Vanligvis får vi en viral titer på ~ 1010 (TU / ml) for GFP-adenovirus.

Nedenfor gir vi et eksempel på en adenoviral titerberegning for en bestemt adenoviral batch der 300000 celler (C) ble transdusert med 1 ml adenoviral løsning (V), med en fortynningsfaktor på 106 (D), hvorav 6% GFP-positive celler (F) ble oppnådd:

Titer (TU/ml) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 1010 TU/ml

Figure 5
Figur 5: Vurderingen av adenoviraltipperen. AD293-celler ble smittet med ulike adenovirale fortynninger. Førtiåtte timer senere ble cellene observert ved fluorescensmikroskopi og analysert ved strømningscytometri for å bestemme prosentandelen av GFP-positive celler indusert av forskjellige adenovirale fortynninger (A-D). For å etablere porten for strømningscytometri ble også ikke-transdusert celler analysert (E). Titeret beregnet for fortynningsfaktoren 106, da 6% av cellene var GFP-positive var 1,8 x 1010 TU / ml. For paneler A-E, stenger: 100μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å teste transduksjonspotensialet til det forberedte adenoviruset ble det brukt fire cellelinjer: humane endotelceller (EA.hy926), bovine aorta endotelceller (BAEC), murin hepatocytter (Hepa 1-6) og murine mesenchymale stromale celler (MSC). Endotelceller (EA.hy926 og BAEC) ble transdusert med 25 TU/celle, hepatocyttene ble transdusert med 5 TU/celle og MSC ble transdusert med 250 TU/celle.

Her er et eksempel på hvordan volumet av adenoviral suspensjon som trengs for å infisere 3 x 106 celler med 25 TU/ celle, ved hjelp av adenoviral suspensjon med 1,8 x 1010 TU / ml, ble beregnet.

For 1 celle ................. 25 TIR
3 x 106 celler ................. x TU Equation 1 x=75 x 106 TU
Hvis den virale beholdningen inneholder
1,8 x 1010 TU ................. 1 ml
75 x 106 TU ................. y ml Equation 1 y= 4,2 x 10-3 ml = 4,2 μL viral lager

Førtiåtte timer etter transduksjon ble cellene analysert ved fluorescensmikroskopi. Som vist i figur 6, ble humane eller bovine endotelceller transdusert med god effektivitet (~ 50%) for 25 TU/celle(figur 6 EA.hy926 og BAEC). Murine hepatocytter (Hepa 1-6) ble effektivt transdusert av adenoviruset ved en lav mengde adenoviruspartikler (5 TU/celle), men de er også følsomme for adenoviruset siden en høyere prosentandel døde celler (PI-positive celler) ble registrert (~16%) sammenlignet med de andre celletypene. Mesenchymale stromale celler var de vanskeligste å transdusere (figur 6), på grunn av mangel på spesifikke adenovirale reseptorer (upubliserte data).

Figure 6
Figur 6: Adenovirusets infektivitet og induksjonen av GFP-uttrykk i transinduserte celler. Humane endotelceller (EA.hy926), bovine aorta endotelceller (BAEC), murine hepatocytter (Hepa 1-6) og murine mesenchymale stromale celler (MSC) ble transdusert med den angitte mengden adenovirus. GFP ble påvist ved fluorescensmikroskopi og prosentandelen av GFP-positive celler ble analysert ved strømningscytometri. PI-positive celler bestemt av strømningscytometri viser celledødeligheten bestemt av viral transduksjon. EA.hy926-celler, bovine aorta endotelceller og Hepa 1-6 celler ble sterkt transdusert av adenoviruset, utbyttet av transduksjon fra 41 - 52%. For MSC induserte en høyere mengde virus (250 TU/celler) bare 27 % GFP-positiv av de transinduserte cellene. Barer: 100μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Rekombinante adenovirus er et allsidig verktøy for genlevering og uttrykk12,13,14. For å indusere sterkt proteinuttrykk ved adenoviral transduksjon settes kodingssekvensen av genet av interesse inn i genomet til adenoviruset. AdEasy adenoviral system, utviklet i laboratoriet til Bert Vogelstein, består av en ryggrad plasmid (pAdEasy-1) som inneholder det meste av wild-type adenovirus serotype 5 genom, og en shuttle vektor (pAdTrack), designet for gen kloning2,10. Slettingen av de adenovirale genene E1 (ansvarlig for montering av smittsomme viruspartikler) og E3 (koding av proteiner involvert i unnvikelse av vertsimmunitet) skapte et rom i det adenovirale genomet, der et gen av interesse på 6,5-7,5 kb kan settes inn2,3. Denne størrelsen er tilstrekkelig for mange gener, spesielt for de med kortere introns15,16,17. Det er også forskere som rapporterer produksjon av adenovirus som bærer cDNA av en transgene18,19,20. Vi fikk imidlertid et lavere utbytte av transgene uttrykk for cDNA-bærende adenovirus enn for deres kolleger som bærer et gen eller et minigen (data ikke vist).

Forbedre og tilpasse de forrige metodene2,10,14,18,21, krever teknologien for adenoviral produksjon kortere tid, lavere kostnader og mindre innsats. Det adenovirale DNA-et i full lengde oppnås ved rekombinasjon mellom skyttelvektoren og pAdEasy-1-plasmiden i den homologe rekombinasjonsutsatte E. coli-stammen, BJ5183. Protokollen innebærer kjemisk transformasjon av AdEasier-1 celler (BJ5183 bakterier som inneholder pAdEasy-1). Denne teknikken krever ikke en elektroporator som kanskje ikke er tilgjengelig i noen laboratorier, er veldig enkel, øker rekombinasjonsutbyttet og reduserer tiden som er nødvendig for å oppnå kompetente celler og for å utføre transformasjonen. Forhåndsvalget av rekombinante kloner utført av PCR forkorter tiden ytterligere og letter hele prosedyren. En lignende prosedyre ble brukt av Zhao og medarbeidere22, men i protokollen optimaliserte vi sekvensene til primerne.

For GFP-adenovirusemballasje og forsterkning ble det brukt en HEK293 derivatcellelinje, nemlig AD293-celler, som er mer tilhenger av kulturplaten. Andre cellelinjer som vanligvis brukes til adenoviral produksjon er følgende: 911, 293FT, pTG6559 (A549 derivat), PER. C6 (HER derivat), GH329 (HeLa derivat), N52. E6 og HeLa-E123,24,25,26. I våre hender ble det ikke oppnådd noen forbedring i adenoviralproduksjonen da 911 celler ble brukt (data ikke vist). Transfeksjonen av AD293-celler med rekombinant plasmid ved hjelp av K2-reagens økte effektiviteten til viral emballasjetrinnet sterkt. Etter adenovirusproduksjon er opptil ~ 70% av adenoviruset fortsatt inne i cellene og frigjøres ved tre fryse- og opptiningssykluser. Å øke antall sykluser er ikke egnet fordi det ødelegger adenoviruset.

Gjennom hele den rutinemessige adenovirale produksjonsprosessen frigjøres mange virale partikler i cellekulturmediet. Å kaste bort dette cellekulturmediet under høsting av de infiserte AD293-cellene vil resultere i et viktig virustap. Vi optimaliserte protokollen beskrevet av Schagen og medarbeidere for å rense adenoviralpartiklene fra cellekulturmediet ved nedbør med ammoniumsulfat27. Denne metoden har en høyere effektivitet i adenovirusgjenoppretting fra cellekulturmediet sammenlignet med metoden ved hjelp av polyetylenglykol28. Det utfelte adenoviruset skal renses umiddelbart ved ultracentrifugation eller holdes i kjøleskapet i et par dager, men bare etter dialyse, for å fjerne saltoverskuddet. Å holde utfellingen lenger enn noen få timer uten dialyse er skadelig for viruset.

Rensing av adenoviralpartiklene ved ultracentrifugation utført i ett trinn reduserer manipuleringen av adenoviralbestanden og letter prosedyren sammenlignet med protokollene ved hjelp av påfølgende ultracentrifugation trinn14,29. Dialyse av renset adenovirus er nødvendig for å fjerne cesiumklorid som kan påvirke transduksjonen ytterligere. I protokollen brukte vi Tris buffer som inneholder MgCl2, men ikke sukrose for dialyse, siden det krever en stor, uberettiget mengde sukrose som ellers er nødvendig som konserveringsmiddel for frysing. Dermed la vi til sukrose senere, direkte inn i de adenovirale bestandene forberedt på frysing. For å unngå hyppig frysing og opptining av det rensede adenoviruset, anbefales det å aliquot adenovirallagrene og lagre dem ved -80 °C. Den adenovirale titeren ble evaluert av strømningscytometri med tanke på GFP-reportergenet og prosentandelen transinduserte celler for en bestemt viral fortynning. Denne metoden er raskere sammenlignet med den klassiske "plakkanalysen" og er mer pålitelig sammenlignet med evalueringen av kapsidproteinene (ved ulike metoder som ELISA eller strømningscytometri) som ikke avslører kapasiteten til infeksjon av de adenovirale partiklene. Elisa-basert kvantifisering, Q-PCR eller plakkanalyse ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett er imidlertid alternative metoder, spesielt nyttige for titrering av adenovirus som ikke inneholder en fluorescerende tracer.

Tatt i betraktning at pAdTrack adenovirus er avledet fra humane adenovirus serotype 5 som er anerkjent av Coxsackievirus og Adenovirus reseptorer (CAR), demonstrerte vi kapasiteten til GFP-adenoviruset til å transdusere celler av menneskelig opprinnelse (endotelceller), men også celler av andre opprinnelser: bovine (endotelceller) og murine (mesenchymale stromale celler og hepatocy). Dataene viste at GFP-adenoviruset kan indusere et høyt uttrykk for en transgene.

Til slutt optimaliserte vi denne arbeidskrevende teknologien for å redusere tiden, kostnadene og innsatsen som trengs for å oppnå de adenovirale partiklene. Adenoviruset som er tilberedt er i stand til å infisere ulike celletyper og å indusere uttrykket av genet av interesse. Denne protokollen kan brukes i en rekke eksperimenter siden den adenoviralmedierte genoverføringen representerer et av hovedverktøyene for å utvikle moderne genterapier.

FORKORTELSER: AdV-GFP, adenovirale partikler; BAEC, bovine aorta endotelceller; CsCl, cesiumklorid; GFP, grønt fluorescerende protein; MSC, mesenchymale stromale celler; TU, transduseringsenheter.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et prosjekt finansiert fra Det europeiske regionale utviklingsfondet gjennom Competitiveness Operational Program 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; akronym DIABETER), et tilskudd fra det rumenske forsknings- og innovasjonsdepartementet PCCDI- UEFISCDI, prosjektnummer PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 innen PNCD III og av det rumenske akademiet. Forfatterne takker Kyriakos Kypreos (Universitetet i Patras, Hellas) for hans generøse og relevante råd, Ovidiu Croitoru (University of Fine Arts, Bucuresti, Romania) for filming, filmredigering og grafisk design, og Mihaela Bratu for teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AD293 cells Agilent Technologies 240085
AdEasier-1 cells Addgene 16399
Agarose I (for electrophoresis) Thermo Scientific 17850
Ammonium sulfate Sigma A4418
Ampicillin sodium salt Sigma A0166
BamH I Thermo Scientific FD0054
Cell culture plates 100 mm Eppendorf 30702115
Cesium chloride Sigma L4036
DH5alpha bacteria Thermo Scientific 18265017
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) Gibco 3240-027
EA.hy926 cells ATCC CRL-2922
EDTA Sigma E5134
Ethanol (99.8%) Roth 5054.2
Fetal Bovine Serum Sigma F7524
Flasks T25, T75, T175 Eppendorf 30712129
Glucose Sigma G7021
Hepa 1-6 murine hepatocytes ATCC CRL-1830
Hind III Thermo Scientific FD0504
Kanamycin Sulfate Thermo Scientific 15160054
K2 Transfection System Biontex T060-5.0
LB medium Formedium LBx0102
LB-agar Formedium LBx0202
Mix & Go E. coli Transformation kit Zymo Research T3001
Midori Green Advanced DNA stain Nippon Genetics Europe MG-04
NaOH Sigma S8045
Opti-MEM Thermo Scientific 31985070
Pac I Thermo Scientific FD2204
pAdEasy-1 Addgene 16400
pAdTrack-CMV Addgene 16405
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) Invitrogen 15593-031
Polymerase GoTaq Promega M3005
Pme I (Mss I) Thermo Scientific FD1344
Potassium acetate VWR Chemicals 43065P
Pst I Thermo Scientific FD0614
Qiagen Midi Prep kit Qiagen 12125
Cell Scraper TPP 99003
SDS Thermo Scientific 28365
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes Thermo Scientific 66330
Sodium pyruvate SIGMA P5280-100G
Syringe with 23G neeedle B Braun 464BR
Tris HCl Sigma 1185-53-1
Trypan blue Roth CN76.1
Tubes 50ml TPP 91050
Ultra-Clear Tubes (14x89 mm) Beckman Coulter 344059
Centrifuge (refrigerated) Sigma Sartorius 3-19KS
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor Beckman Coulter Optima L-80 XP
Culture Hood Thermo Scientific Class II
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) Thermo Scientific
Dry Block Heating Thermostat Biosan TDB-120
Thermocycle SensoQuest 012-103
Water Bath Memmert WNB 14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  2. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  3. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81, Pt 11 2573-2604 (2000).
  4. Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells. European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).
  5. Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion. Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).
  6. Kreppel, F., Kochanek, S. Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).
  7. Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield. Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).
  8. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).
  9. Jager, L., Ehrhardt, A. Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders. Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).
  10. Luo, J., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).
  11. Dumitrescu, M., et al. Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
  12. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).
  13. Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting. Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).
  14. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).
  15. Zvintzou, E., et al. Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity. Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).
  16. Karavia, E. A., et al. Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice. Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).
  17. Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties. Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).
  18. Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma. World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).
  19. Ambar, B. B., et al. Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand. Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).
  20. Okuyama, T., et al. Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system. Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).
  21. van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. Adenovirus-mediated gene transfer. Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).
  22. Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR. Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).
  23. Kovesdi, I., Hedley, S. J. Adenoviral producer cells. Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).
  24. Lin, X. Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors. Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).
  25. Fallaux, F. J., et al. Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).
  26. Altaras, N. E., et al. Production and formulation of adenovirus vectors. Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).
  27. Schagen, F. H., et al. Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield. Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).
  28. Colombet, J., et al. Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).
  29. Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).

Tags

Tilbaketrekning utgave 172 Adenovirus pAdTrack grønt fluorescerende protein rekombinant seleksjon titer adenovirusrensing
En effektiv metode for Adenovirusproduksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dumitrescu, M., Trusca, V. G.,… More

Dumitrescu, M., Trusca, V. G., Fenyo, I. M., Gafencu, A. V. An Efficient Method for Adenovirus Production. J. Vis. Exp. (172), e61691, doi:10.3791/61691 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter