Summary
Här presenterar vi ett protokoll för adenovirusproduktion med hjälp av pAdEasy-systemet. Tekniken inkluderar rekombination av pAdTrack och pAdEasy-1 plasmider, adenovirusförpackningar och förstärkning, rening av adenoviralpartiklarna från celllyat och odlingsmedium, virustitration och funktionell testning av adenoviruset.
Abstract
Adenoviral transduktion har fördelen av en stark och övergående induktion av uttrycket av genen av intresse i en bred variation av celltyper och organ. Rekombinant adenoviral teknik är dock mödosam, tidskrävande och dyr. Här presenterar vi ett förbättrat protokoll med pAdEasy-systemet för att erhålla renade adenoviralpartiklar som kan inducera ett starkt grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck i transduced celler. Fördelarna med denna förbättrade metod är snabbare beredning och minskad produktionskostnad jämfört med den ursprungliga metoden som utvecklats av Bert Vogelstein. De viktigaste stegen i adenoviral-tekniken är: (1) rekombinationen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1-plasmiden i BJ5183-bakterier; 2. Förpackningen av adenoviralpartiklarna. 3. Förstärkning av adenoviruset i AD293-celler. 4. Rening av adenoviralpartiklar från celllyat och odlingsmedium. och (5) viral titrering och funktionstestning av adenoviruset. Förbättringarna av den ursprungliga metoden består av i) rekombinationen i BJ5183-innehållande pAdEasy-1 genom kemisk omvandling av bakterier; ii) Val av rekombinanta kloner med "negativ" och "positiv" PCR. iii) Transfektion av AD293-celler med hjälp av transfekteringssystemet K2 för adenoviralförpackningar. iv) Utfällning med ammoniumsulfat av de viruspartiklar som frigörs av AD293-celler i cellkulturmedium. och v) rening av viruset genom ettstegs cesiumkloridavsättningsgradient ultracentrifugering. Ett starkt uttryck för genen av intresse (i detta fall GFP) erhölls i olika typer av transduced celler (såsom hepatocyter, endotelceller) från olika källor (människa, nötkreatur, murin). Adenoviral-medierad genöverföring representerar ett av de viktigaste verktygen för att utveckla moderna genterapier.
Introduction
Adenovirus är icke-utstärpade virus som innehåller en nukleocapsid och ett dubbelsträngat linjärt DNA-genom1,2,3. Adenovirus kan infektera ett brett spektrum av celltyper och infektion är inte beroende av aktiv värdcellsdelning. Efter infektion introducerar adenoviruset sitt genomiska DNA i värdcellskärnan, där det förblir episkt och transkriberas tillsammans med värdens gener. Således uppnås en minimal potentiell risk för införande av mutagenes eller onkogenreglering4,5,6. Adenoviral genomet replikeras inte tillsammans med värdgenomet och därmed späds adenoviralgenerna ut i en delningscellpopulation. Bland fördelarna med adenoviral transduktion finns det: i) höga nivåer av transgene uttryck; ii) Minskade risker i samband med integreringen av virus-DNA i värdgenomet på grund av episomalt uttryck. iii) Transduktion av en mängd olika delnings- och icke-delande celltyper. De flesta adenovirus som används i biomedicinsk forskning är icke-replikiva, saknar E1-regionen7,8,9. För deras produktion krävs en cellinje som levererar E1-sekvensen (till exempel HEK293). Dessutom togs en icke-nödvändig region för viruslivscykeln (E3) bort för att möjliggöra införandet av en transgen i virusgenomet. Andra regioner (E2 och E4) ströks ytterligare i vissa adenovirus, men i dessa fall rapporterades en minskad avkastning av adenoviral produktion och lågt uttryck för transgen7.
Här presenterar vi ett förbättrat protokoll för konstruktion, förpackning och rening av adenovirus med hjälp av AdEasy-systemet. Dessa förbättringar gjorde det möjligt att packa adenoviruset på ett snabbare och mer ekonomiskt sätt jämfört med den ursprungliga metoden som utvecklats av Bert Vogelstein2,10, på grund av följande fördelar: i) rekombinationen i BJ5183-innehållande pAdEasy-1 genom kemisk omvandling av bakterier; ii) PCR:s val av rekombinanta kloner. iii) Transfektion av AD293-celler med hjälp av transfekteringssystemet K2 för adenoviralförpackningar. iv) Utfällning av adenoviralpartiklar från odlingsmedium efter viral förpackning och förstärkning. v) adenoviral rening med hjälp av ettstegs cesiumklorid (CsCl) gradient ultracentrifugation.
Protokollet för produktion av adenovirus med hjälp av AdEasy-systemet(figur 1)omfattar följande steg:
(1) Rekombination av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 i BJ5183 bakterier
(2) Förpackning av adenoviralpartiklarna
(3) Förstärkning av adenoviruset
(4) Rening av adenoviralpartiklar från celllyat och odlingsmedium
(5) Adenovirustitration.
Figur 1: Adenovirusproduktionstekniken. Huvudstegen i adenoviraltekniken är: (1) Rekombinationen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1-plasmiden i BJ5183-bakterier. De utvalda rekombinerade plasmiderna förstärks i DH5α-bakterier och renas sedan; (2) Förpackningen av adenoviralpartiklarna i AD293-celler som producerar adeno-E1-proteiner. (3) Förstärkning av adenoviruset i AD293-celler. (4) Rening av adenoviralpartiklarna från celllyat och odlingsmedium genom ultracentrifugation på en CsCl-densitetsgradient. (5) Titreringen av adenoviruset och den funktionella testningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
I detta protokoll exemplifierade vi tekniken för produktion av adenoviruset, vilket kan inducera uttrycket av GFP i värdcellerna. GFP är redan insatt i ryggraden på pAdTrack-CMV shuttle vector (Addgene #16405), under en andra CMV-promotor och används som reportergen (Figur 1). Av denna anledning utsåg vi här pAdTrack-CMV-vektorn som pAdTrack-GFP och vi bedömde GFP:s uttryck för demonstrativa ändamål. Förutom GFP-uttryck kan systemet användas för att överuttrycka en gen av intresse, som kan klonas på pAdTrack-CMV: s flera kloningsplatser. En gen eller en minigen klonad i pAdTrack-CMV är vanligtvis effektivare för uttrycksinduktion jämfört med cDNA11. Data visade ett starkt GFP-uttryck i transduced celler (såsom hepatocyter, endotelceller) från olika källor (människa, nötkreatur, murin). Adenoviral-medierad genöverföring representerar ett av de viktigaste verktygen för att utveckla moderna genterapier.
Protocol
Säkerhetsanteckning: I allmänhet klassificeras adenovirus som biosäkerhetsnivå 2-organismer och därför måste alla manipuleringar göras i ett biosäkerhetsskåp av klass II av en utbildad person, som bär biofarlig skyddsutrustning (inklusive handskar, ansiktsmask för biologiska aerosoler, labbrock etc.). Alla fasta material som är förorenade med adenoviruset måste desinficeras med en 10% blekmedelslösning i 30 min och autoklaveras i 30 minuter vid 121 °C och 1 bar. Beroende på vilken gen som sätts in kan det skapade adenoviruset ha farlig potential och kan klassificeras i andra biosäkerhetsnivåer.
1. Experimentell förberedelse
- Använd en separat cellkultur huva för adenoviral manipulationer och en separat inkubator för varje adenovirustyp. Använd T-flaskor med filterlock för virusförpackningar och förstärkning. undvika så mycket som möjligt transduktionsexperiment i ventilerade Petri-plattor.
- Töm cellkulturhuven efter varje användning och exponera den för UV i 15 minuter.
- Autoklav regelbundet pipetthjälpen, pipetter och andra redskap. Om möjligt, kultur i ett separat cellkulturlaboratorium / huva cellerna för adenoviral förpackning (AD293 celler) och de celler som ska användas i transduktionsexperiment. Partier av olika adenovirus som förstärks under samma period bör kontrolleras för korskontaminering av PCR.
- Förbered följande lösningar.
- Förbered SOB (Super Optimal Broth) medium: 20 g tryptone, 5 g jästextrakt, 0,5 g NaCl (10 mM slutlig koncentration), 2,5 ml 1 M KCl (2,5 mM slutlig koncentration), amd H2O till 1 L. Efter autoklavering vid 121 °C, tillsätt följande sterila lösningar: 5 ml 1 M MgCl2 och 5 ml 1 M MgSO4.
- Förbered SOC (Super Optimal buljong med katabolitförtryck) medium: i 1 L steril SOB tillsätt följande sterila lösningar: 20 ml 1 M glukos, 5 ml 1 M MgCl2 och 5 ml 1 M MgSO4.
- Förbered utfällningslösning: Lös upp 29,5 g kaliumacetat i 60 ml H2O, tillsätt 11,5 ml ättiksyra och H2O till 100 ml.
- Förbered resuspensionsbuffert: 95 ml 20% glukos, 5 ml 1 M Tris-Cl pH 8, 4 ml 0,5 M EDTA pH 8 och tillsätt H2O till 200 ml.
- Förbered lyslösning: 4,8 ml 8,3 M NaOH, 10 ml 20%SDS och H2O till 200 ml.
2. Rekombination av pAdTrack-GFP virusvektor med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier
- Linjärisering av pAdTrack-GFP och rening av den linjäriserade plasmiden.
- Förbered följande rötningsblandning på is:
10 μg pAdTrack-GFP
5 μL 10x färglös buffert
2 μL pm I
H2O till en slutlig volym på 50 μL. - Inkubera vid 37 °C i 3 timmar i ett vattenbad.
- Inaktivera vid 65 °C i 20 min.
- Kontrollera effektiviteten hos matsmältningen av pAdTrack-GFP med Pme I: kör 1 μg av den smälta plasmiden parallellt med 1 μg osmält plasmid på en 0,8% agarosgel.
- Förbered följande rötningsblandning på is:
- Isolering och rening av DNA
OBS: Steg 1-6 måste utföras i en rökhuv.- Tillsätt en lika stor mängd fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1) över rötningsblandningen och vänd röret tills blandningen är homogen.
- Centrifugera i 3 min vid 16 200 x goch överför sedan den övre vattenfasen till ett uppsamlingsrör.
- Tillsätt en lika stor mängd fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1) under den nedre organiska fasen och virveln.
- Centrifugera i 3 min vid 16 200 x goch överför sedan den övre fasen till samma uppsamlingsrör.
- Tillsätt en lika stor volym kloroform under vattenfasen som skördas i uppsamlingsröret och virveln.
- Centrifugera i 3 min vid 16 200 x goch överför sedan den övre vattenfasen till ett nytt uppsamlingsrör.
- Tillsätt en 1/10 volym av 3 M natriumacetat och 2 volymer kallt 100% etanol och virvel.
- Inkubera i 1 timme vid -70 °C eller över natten vid -20 °C.
- Tina provet på is och centrifugera det i 10 minuter vid 16 200 x g och 4 °C.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 750 μL 75% etanol.
- Centrifug i 3 min vid 16 200 x g och 4 °C och ta bort supernaten.
- Snurra kort röret för att ta bort all supernatant och torka pelleten i huven. Torka inte DNA-pelleten länge eftersom det är svårt att lösa upp.
- Lös upp pelleten i 15 μL H2O.
- Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer (t.ex. Nanodrop).
- Omvandling av AdEasier-1 bakterier med pAdTrack-GFP
OBS: I detta steg sker rekombinationen av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1-plasmid.- Förbered adeasier-1 (BJ5183-innehållande pAdEasy-1, Addgene #16399) kemiska kompetenta bakterier, med hjälp av ett kommersiellt omvandlingskit, enligt tillverkarnas instruktioner. Håll alikvoter på 100 μL kompetenta bakterier vid -80 °C.
- Tina upp en alikvot av kompetenta AdEasier-1-bakterier på is och tillsätt 1 μg renad pme I-smält pAdTrack-GFP. Blanda försiktigt genom att snärta röret (pipettera inte blandningen). Inkubera i 10 minuter på is.
- Tillsätt 900 μL SOC-medium och inkubera i 1 timme vid 37 °C med skakningar.
- Microfuge i 5 min vid 600 x g.
- Ta bort 900 μL av supernatanten, blanda pelleten och supernatanten och så de omvandlade bakterierna på LB-agarplattor med kanamycin.
- Inkubera i ~ 16 timmar vid 37 °C (överstiger inte 18 timmar).
- Val av möjliga positiva kloner av PCR
- Dela tandpetare i två halvor och sterilisera halvtandpetarna genom autoklavering.
- Plocka upp små och genomskinliga kolonier med sterila halvtandplockare.
- Rotera kort halvtandpetaren med bakterier i 10 μL vatten (i ett PCR-rör) och lägg sedan halvtandpetaren i ett 1,5 mL Eppendorf-rör som innehåller 100 μL SOC-medium med kanamycin. Inkubera i 4-6 timmar vid 37 °C, medan du testar klonerna med "negativ" och "positiv" PCR.
- Inkubera PCR-rören som innehåller 10 μL vatten med bakterier i 5 min vid 95 °C för att erhålla bakterieprovet och köra parallellt det "negativa" och "positiva" PCR.
- "Negativ" PCR - för att testa pAdTrack-GFP-integriteten: Förbered följande PCR-blandning för det negativa PCR på is.
5 μL av bakterieprovet
0,1 μL primer framåt (4631 F: 5'-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG)
0,1 μL primer Reverse (5616 R: 5'-TATGGGGGCTGTAATGTTGTCTC)
0,1 μL dNTP 10 mM
3 μL 5x buffert
1,5 μL MgCl2 25mM
0,1 μL GoTaq-polymeras
H2O till en slutlig volym på 15 μL
OBS: Den positiva kontrollen där DNA-mallen är pAdTrack-GFP-vektorn måste inkluderas. - "Positiv" PCR - för att testa närvaron av genen av intresse. Använd specifika primers för den infogade genen och förbered blandningen som i föregående steg. De primers som användes för GFP var följande:
F: 5'-CAAGGACGACGGCAACTACA
R: 5'-ATGGGGGTGTTCTGCTGGTA - Kör parallellt den "negativa" och "positiva" PCR. PCR-programmet är: 5 min, 95 °C; 40 cykler av följande steg: 30 sek, 95 °C; 30 sek, 68 °C, 1 min, 72 °C, Slutlig förlängning: 10 min, 72 °C.
OBS: Anpassa glödgningstemperaturen för förstärkning av den gen som är av intresse. - Utvärdera PCR-produkterna på en 1% agarose gel och gör valet av klonerna.
- Överväg för vidare bearbetning av klonerna som inte ger några PCR-produkter för den "negativa PCR" och den specifika PCR-produkten efter den "positiva PCR".
- Odla bakteriekulturerna hos utvalda rekombinanta kloner
- Späd ut kulturerna hos de förmodade positiva klonerna (resulterade i steg 2.4.3.) i 4 ml SOC-medium med kanamycin och inkubera dem över natten vid 37 °C med skakningar.
- Isolering av plasmid-DNA från AdEasier-1-bakterier (Miniprep med alkalisk lys)
- Överför 1,5 ml bakteriekultur i mikrocentrifugrör, centrifug i 1 min vid 16 200 x goch ta bort supernaten.
- Överför ytterligare 1,5 ml bakteriekultur i samma rör, upprepa centrifugation och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 200 μL återsuspensionsbuffert (50 mM glukos, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8).
- Tillsätt 200 μL lyslösning (0,2 N NaOH, 1% SDS), blanda försiktigt genom att vända röret.
- Tillsätt 200 μL utfällningslösning (60 ml 5 M kaliumacetat, 11,5 ml glacial ättiksyra, tillsätt H2O till 100 ml) och blanda försiktigt genom att vända röret.
- Centrifugera i 3 min vid 16 200 x g.
- Överför supernatanten i ett nytt mikrocentrifugrör, tillsätt 500 μL isopropanol, blanda och inkubera i 20 minuter på is.
- Centrifug i 15 min vid 16 200 x g och tillsätt 500 μL 75% etanol.
- Centrifug i 10 min vid 16 200 x g och ta bort supernaten.
- Centrifugera i 3 min vid 16 200 x g, ta bort supernaten och tillsätt 15 μL H2O.
- Förstärkning, isolering och omtestning av rekombinerade plasmider
- Omvandling av DH5α bakterier med DNA isolerat från AdEasier-1 celler.
- Förbered DH5α kompetenta bakterier med hjälp av det kommersiella omvandlingssatsen enligt tillverkarens instruktioner.
- Tina 100 μL DH5α kompetenta bakterier på is, tillsätt det rekombinanta DNA:t och inkubera 10 min på is. Så sedan bakterierna på LB-agarplattor med kanamycin.
- Inkubera vid 37 °C över natten.
- Plocka upp flera kolonier och växa var och en i 2 ml LB medium med kanamycin, vid 37 °C, över natten, med skakningar.
- Isolera DNA (Miniprep med alkalisk lys) och återanvänd det erhållna DNA:t i 25 μL H2O.
- Bekräfta de positiva klonerna genom enzymatisk matsmältning.
- Förbered följande blandning på is:
5 μL rekombinant DNA
1,5 μL 10x färglös buffert
0,5 μL hind III eller pst I
H2O till en slutlig volym på 15 μL - Inkubera vid 37 °C i 30 min.
OBS: Som en kontroll, smält även pAdTrack-GFP och pAdEasy-1 plasmider. - I varje prov tillsätt 3 μL Sx6-belastningsbuffert med RNase A (om RNase A inte finns i miniprepbuffertarna).
- Kör de smälta DNA-fragmenten på 1% agarose gel elektrofores.
OBS: Matsmältningsmönstret för en positiv klon innehåller majoriteten av fragment av den smälta pAdEasy plasmiden, avslöjar pAdEasy rekombination med pAdTrack vektor. Genen av intresse bör bevisas genom matsmältning med de restriktionsenzymer som används för kloning.
- Förbered följande blandning på is:
- Beredning av plasmid-DNA (transfection-grade) för adenovirusförpackningar.
- Odla en 200 ml kultur av bakterier från en positiv klon för att isolera plasmid-DNA.
- Isolera plasmid-DNA:t med hjälp av ett kommersiellt kit för plasmid-DNA Midiprep (t.ex. Qiagen Plasmid Midi Kit) enligt tillverkarens instruktioner.
- Omvandling av DH5α bakterier med DNA isolerat från AdEasier-1 celler.
3. Förpackning av adenoviralpartiklarna
- Dag 1. Dirigera AD293-cellerna
- Tvätta AD293-cellerna med PBS och inkubera dem med 0,125% trypsin i 2-5 min vid 37 °C.
- Samla cellerna i kallt medium med serum.
- Centrifugera i 5 min vid 400 x g vid 4 °C.
- Återanvänd cellerna i medium med serum och så cellerna med en densitet av ~2 x 106/T25 kolv. Använd helst en kolv med filter.
- Dag 1. Smält det rekombinanta DNA:t med Pac I
- Förbered följande blandning:
6 μL rekombinant DNA (1 μg/μL)
2 μL Pac I
2,5 μL 10x färglös buffert
H2O till en slutlig volym på 25 μL - Inkubera i 3 timmar (eller över natten) vid 37 °C och inaktivera sedan enzymet vid 65 °C i 20 minuter.
- DNA-utfällning med etanol: tillsätt 2,5 μL (1/10 v/v) 3 M natriumacetat och 2-3 volymer 100% etanol. Inkubation i 30 min vid -70 °C eller över natten vid -20 °C.
- Centrifug vid 16 200 x g i 30 min vid 4 °C och återanvänd pelleten i sterilt vatten.
- Förbered följande blandning:
- Dag 2: Transfektion av AD293-celler med K2-reagens
- Tillsätt 40 μL K2 Multiplikator över cellerna, två timmar före transfection.
- Förbered A- och B-lösningar:
Lösning A: Tillsätt 6 μg Pac l-linjäriserat DNA i 260 μL Opti-MEM.
Lösning B: Tillsätt 21,6 μL K2-reagens i 248,4 μL Opti-MEM. - Tillsätt lösning A över lösning B och blanda försiktigt genom rörning.
- Inkubera blandningen i 20 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt dropwise A- och B-blandning i cellerna.
- Dag 3-11: Övervaka GFP-uttrycket genom fluorescensmikroskopi
OBS: Cellerna ska verka gröna i fluorescensmikroskopi och bör gradvis lossna. - Dag 11: Skörda de adenovirala partiklarna F1
- Samla de fristående cellerna och mediet i ett 50 ml-rör, skrapa de vidhäftande cellerna och lägg dem i samma rör.
- Centrifugera i 5 min vid 400 x g, samla supernatanten i ett nytt rör och återanvänd cellpelleten i 0,5 ml PBS.
- Cellavbrott
- Överför cellfjädringen i ett mikrocentrifugrör.
- Utför tre frys-/töväderscykler (frys i flytande kväve eller vid -80 °C /tina vid 37 °C i högst 7 min).
- För de trasiga cellerna genom en 23 G sprutnål tre gånger.
- Ta bort cellskräpet genom centrifugering vid 9 600 x g i 12 min.
- Överför supernaten till 50 ml-röret med det insamlade mediet.
4. Förstärkning av adenoviruset
OBS: Om AD293-cellerna inte nådde det nödvändiga sammanflödet kan alikvoterna i de adenovirala bestånden (lysat som erhållits från de virusproducerande cellerna) som ska användas för infektion lagras vid -80 °C.
- Förbered F2 adenoviral partiklarna.
- Kärna ur AD293-cellerna i en T75-kolv (5 x 106 celler/kolv).
- Infektera ~90% konfluenta AD293-celler med hjälp av F1 adenoviralpartiklarna: tillsätt cellhom homogenatet och mediet från T25-kolven över cellerna som odlas i T75-kolven.
- Övervaka GFP-uttrycket med fluorescensmikroskopi.
- Skörda de virusproducerande cellerna när ~90% av den transduced AD293 lossnar (~ den5: e dagen efter transduktion). Håll cellkulturmediet vid 4 °C.
- Stör cellerna (på samma sätt som för F1) i 1 ml PBS.
- Förbered F3 adenoviral partiklarna.
- Infektera ~90% konfluenta AD293-celler sådda i T175-kolv med F2 adenoviralpartiklar och cellkulturmediet från F2 adenoviralpartiklarna.
- Skörda cellerna (~ 5 dagar efter transduktion).
- Stör cellerna (på samma sätt som för F1) i 2 ml PBS.
- Förbered F4 adenoviral partiklarna.
- Infektera 5 T175-flaskor som innehåller ~90% konfluenta AD293-celler med F3 adenoviralpartiklar och cellkulturmedium.
- Skörda cellerna (~ 5 dagar efter transduktion).
- Stör cellerna (på samma sätt som för F1) i 3 ml PBS.
- Förbered F5 adenoviral partiklarna.
- Infektera 25 T175 flaskor som innehåller ~90% konfluenta AD293-celler med F4 adenoviralbuljong och cellkulturmedium.
5. Rening av adenoviruset från celllyat och odlingsmedium
- Skörda de virusproducerande cellerna och odlingsmediet.
- Skörda AD293-cellerna i F5 efter 5 dagar från transduktion.
- Spara mediet i en steril flaska för utfällning av adenoviralpartiklarna.
OBS: Förvara mediet i kylskåpet tills adenoviruset renas. - Centrifugera cellerna vid 400 x g, i 5 min, vid 4 oC.
- Återanvänd den slutliga pelleten i 5 ml 10 mM Tris HCl, pH 8 med 2 mM MgCl2.
- Aliquot suspensionen i 1,5 ml rör.
- Stör cellerna (på samma sätt med cellerna för F1): tre cykler av frysning/upptining.
OBS: Om ultracentrifugationen inte kan utföras omedelbart, förvara proverna på -80 °C. - Skicka cellfjädringen genom en 23G sprutnål i tre gånger.
- Centrifugera homogenatet vid 9 600 x g i 12 min.
- Spara supernatanten för adenovirus rening av CsCl gradient ultracentrifugation.
- Nederbörd av adenoviruset som frigörs i kulturmediet.
- Ta flaskan med sparat cellkulturmedium vid rumstemperatur.
- Tillsätt 121 g ammoniumsulfat till varje 500 ml cellkulturmedium (mättnaden av lösningen bör vara mellan 40 - 42%).
- Blanda försiktigt tills ammoniumsulfatet är helt upplöst.
- Inkubera i minst 2,5 timmar vid rumstemperatur.
- Centrifug vid 1600 x g, i 15 min, vid 22 oC och spara pelleten.
- Återanvänd pelleten i 4 ml 10mM Tris HCl pH 8 med 2mM MgCl2; denna suspension bör renas omedelbart genom CsCl gradient ultracentrifugation.
OBS: Om reningssteget inte kan utföras senare, dialysera över natten den återanvända pelleten mot 10mM Tris HCl, pH 8 med 2mM MgCl2.
- Adenovirus rening genom ultracentrifugation.
- Förbered en diskontinuerlig CsCl-lutning i polypropylenrör för SW41Ti-rotor. Tillsätt 3 ml 765 mg/ml CsCl (hög densitet: 1,4 g/L) längst ner på röret. Tillsätt långsamt 3 ml 288,5 mg/ml CsCl (låg densitet: 1,2 g/L) ovanpå det första CsCl-skiktet.
- Försiktigt överlägg 3 - 4 ml adenoviral partikelupphängning som frigörs från cellerna eller fälls ut från cellkulturmediet (som beskrivits tidigare) ovanpå lutningen.
- Fyll rören med mineralolja och lägg rören i de kalla SW41Ti-hinkarna.
- Jämvikta rören. Se till att de fyllda polypropylenrören laddas symmetriskt i rotorn. Lägg rotorn i ultracentrifugen.
- Centrifugera vid 210 000 x g och 4 °C, i 18 timmar, ingen broms.
- Placera ultracentrifugerören på ett stativ med ett svart papper bakom för att få banden.
- Kassera den klara övre fasen, cellskräpet och det övre bandet i en avfallsbehållare med blekningslösningen.
- Skörda det lägsta bandet som innehåller hela adenoviruset (~ 700 μL - 1 ml) i ett sterilt 1,5 ml-rör och håll det på is.
- Förtöj en dialyskassett i dialysbuffert (10 mM Tris-Cl buffert pH 8, 2 mM MgCl2).
- Injicera det renade adenoviruset i dialyskassetten med en 2 ml spruta.
- Dialys över natten mot 10 mM Tris-Cl buffert pH 8, 2 mM MgCl2 (ändra dialysbufferten 3 - 4 gånger).
- Skörda adenoviralbeståndet från dialyskassetten i alikvoter på 10 - 100 μL.
- Tillsätt sackaros till 4% slutlig koncentration till virala alikvoter (för kryoprotection).
- Förvara alikvoter vid -80 °C.
6. Adenovirus titrering
- Dag 1: Plätering av cellerna
- Kärna ur AD293-cellerna med en densitet av 2,5 × 105 celler per brunn (i en 12-brunns odlingsplatta) i 1 ml fullständigt tillväxtmedium, som visas i figur 2. Se till att cellerna sprids jämnt i varje brunn för korrekt titerbestämning.
Figur 2: Titreringsplatta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Dag 2: Transduktion av celler
- Lossa cellerna från en brunn med trypsin och räkna dem. Notera det här numret eftersom det kommer att användas för att beräkna virustitern.
- Utför seriella utspädningar (1/104;1/105; 1/106; 1/107) av virusbeståndet i 1 ml komplett tillväxtmedium enligt följande:
- 1/103: utspädning av virusbeståndet - tillsätt 2 μL viruslager till 1998 μL av fullständigt medium.
- 1/104:Gör 1:10 utspädning av 1/103 genom att späda ut 120 μL till 1080 μL av fullständigt medium (A).
- 1/105:Gör 1:10 utspädning av B genom att späda ut 120 μL A till 1080 μL av fullständigt medium (B).
- 1/106:Gör 1:10 utspädning av C genom att späda ut 120 μL B till 1080 μL av fullständigt medium (C).
- 1/107:Gör 1:10 utspädning av D genom att späda ut 120 μL C till 1080 μL av fullständigt medium (D).
OBS: Förbered 3 rör av varje utspädning (A, B, C, D) för att utföra experimentet i triplikater. - Ta bort cellkulturmediet från brunnarna och tillsätt virusets beredda utspädningar, som visas i figur 2.
- Dag 3: Övervakning av GFP-uttryck
- Kontrollera brunnarna för närvaron av gröna celler med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
- Dag 4: Flödescytometrianalys av GFP-positiva celler
- Förbered och märk tolv 1,5 ml-rör.
- Samla cellkulturmediet (tillsammans med de fristående cellerna) i 1,5 ml-rör och håll dem på is.
- Tillsätt 200 μL trypsin i varje brunn.
- Inkubera plattan i 2 - 3 min vid 37 °C i CO 2-inkubatorn.
- Skörda cellerna i samma Eppendorfrör med cellkulturmediet. Håll rören på is.
- Pellet cellerna vid 400 x g, i 5 min, vid 4 °C.
- Ta bort supernaten; hålla rören på is.
- Återanvänd pelleten i 250 μL PBS + 2% FBS; hålla rören på is.
- Överför cellfjädringen i flödescytometrirör eller platta.
- Kör proverna på en flödescytometer som registrerar GFP-uttryckscellernas fluorescens.
Titerberäkning: Proverna med 5- 20% GFP-positiva celler från den överordnade populationen bör beaktas vid beräkningen av viral titer med hjälp av följande formel:
Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/V
D = utspädningsfaktor
F = procent av positiva celler / 100
C = antal celler / brunn
V = volymen av viralt inokulat
7. Adenoviral transduktion av målceller och testning av det inducerade proteinuttrycket
- Dag 1: Sådd av cellerna
- Så målcellerna så att de sprids jämnt i brunnarna.
- Dag 2: Transduktion av cellerna
- Ta bort målcellerna från en brunn och räkna dem.
- Beräkna lämplig volym av adenoviral suspension som krävs för att omvandla cellerna med önskat antal infektiösa partiklar per cell.
- Lägg till motsvarande mängd virusupphängning i målcellerna.
- Dag 3: Avlägsnande av virusavstängning och kontroll av GFP-uttryck
- Ersätt cellkulturmediet som innehåller adenoviralpartiklar med färskt medium.
- Kontrollera GFP-uttrycket vid fluorescensmikroskopet.
Representative Results
Vi modifierade och förbättrade det ursprungliga Vogelsteins protokoll för att uppnå snabbare och effektivare adenovirusproduktion. För det första reviderade vi metoden för att uppnå ett enklare urval av rekombinanter. Efter rekombination testades BJ5183 bakteriell kloner av "negativ PCR" för att bedöma integriteten hos pAdTrack-GFP som en indikator på bristen på rekombination (figur 3A), eller av "positiv PCR" för att identifiera genen av intresse, assimilerad i vårt fall till GFP (Figur 3B). I både "negativa" och "positiva" PCR: er använde vi pAdTrack-GFP som en kontrollmall, vilket gav ett band på 986 bp för pAdTrack-integritet (Figur 3A, bana 1) och ett band på 264 bp för GFP (Figur 3B, körfält 3). Primers som används för den "negativa PCR" utformades för att förstärka ett fragment på 986 bp som innehåller PmeI-webbplatsen i pAdTrack-GFP. Detta DNA-fragment förstoras drastiskt efter rekombination och förstärks inte i de positiva rekombinanta klonerna. Negativa kloner för rekombination, där pAdTrack-GFP förblev intakta, representeras i figur 3A, körfält 3, 4 och 6. Primers glödgning på DNA-sekvenserna intill rekombinationsplatsen. Potentiella positiva rekombinanta kloner(figur 3A,körfält 2 och 5) uttryckte GFP enligt figur 3B,körfält 1 och 2. Plasmid-DNA från dessa kloner isolerades och användes för DH5α-omvandling för att erhålla en högre mängd DNA. Dessa förvalda rekombinanta plasmider som förstärktes i DH5α testades sedan genom enzymatisk matsmältning. I figur 3illustreras C-E resultaten av den enzymatiska matsmältningen av en rekombinantpositiv klon som smälts med hind III, psti, bamhi-restriktionsenzymer (figur 3C, D, E lane 2). HindIII och PstI matsmältning mönster av rekombinant klon liknade de som erhållits för pAdEasy-1 sedan HindIII och PstI skar pAdEasy-1 plasmid 24 respektive 25 gånger, (Figur 3C och D, körfält 3); HindIII klippte en gång och PstI skar fyra gånger pAdTrack-GFP vektorn(Figur 3C och D, körfält 1). BamHI klippte två gånger pAdEasy-1 vektor(Figur 3C, körfält 3), och en gång pAdTrack-GFP (Bild 3C, körfält 1).
PacI klippte ut ett fragment på 4,5 kb från den rekombinanta plasmiden(bild 3F,körfält 2), ett fragment på 2863 bp från pAdTrack-GFP (Figur 3F, körfält 1) och linjäriserade pAdEasy-1-vektorn (Figur 3F, körfält 3). DNA-stegen finns representerad i figur 3C-F, i körfält 4. Rekombinant plasmid smältes med Pac I för vidare användning för AD293 transfection.
Figur 3: Rekombination av pAdTrack-GFP med pAdEasy-1-plasmiden. De plasmider som erhölls efter rekombinationen av pAdTrack-GFP och pAdEasy-1 testades av "negativ" PCR för pAdTrack-GFP integritet (A). De icke-rekombinanta klonerna visade sig vara i närvaro av ett 986 bp-band som motsvarar sekvensen som förstärktes från pAdTrack-GFP-plasmiden (A, körfälten 3, 4 och 6). Klonerna potentiellt positiva för rekombination (A, körfält 2 och 5) erhölls också. När pAdTrack-GFP vektorn användes som en mall, erhölls ett band på 986 bp för pAdTrack-GFP (A, lane 1). De potentiellt positiva rekombinanta klonerna testades för GFP-uttryck med "positiv" PCR (B); ett band på 264 bp visas för både potentiellt rekombinerade kloner (B, lane 1 och 2), samt för pAdTrack-GFP-plasmiden. DNA från en potentiell rekombinant klon testades med HindIII, PstI, BamHI och PacI begränsning enzym (C-F, körfält 2). I kontrollerna smältes pAdEasy-1 vektorn (C-F, körfält 3) och pAdTrack-GFP plasmid (C-F, körfält 1) med samma enzymer. DNA-stegen finns representerad i C-F lane 4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Adenoviral förpackning och förstärkning utfördes i AD293 celler. Adenoviral partiklar (AdV-GFP) renades från AD293 cell lysate samt från cell kultur medium, där de hade släppts av de infekterade cellerna. För att koncentrera adenoviruset som finns i cellkulturmediet fälldes partiklarna ut med ammoniumsulfat och återanvändes sedan i 10 mM Tris HCl pH 8 med 2 mM MgCl2, samma buffert som används för celllys. Därefter renades adenoviral partiklarna från cell lysat och från odlingsmediet av CsCl diskontinuerlig gradient ultracentrifugation. Efter ultracentrifugering erhölls ett starkt band av renad AdV-GFP, vilket visas i figur 4.
Figur 4: Adenoviral rening genom ultracentrifugation på en diskontinuerlig CsCl gradient. Cell homogenate och adenovirus fälls ut från mediet utsattes för ultracentrifugation på en diskontinuerlig gradient bildas av låg och högdensitet CsCl lösningar. Starka band av GFP- adenovirus visades i båda fallen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
För att bestämma virustitern uttryckt i givarenheterna per ett ml (TU/ml) infekterades AD293-cellerna med seriella utspädningar av AdV-GFP. Efter 48 timmar uttryckte de infekterade cellerna GFP, i en omvänd korrelation med utspädningsfaktorn för virussuspensionen. Detta observerades genom fluorescensmikroskopi och andelen GFP-positiva celler bestämdes av flödescytometri (figur 5). För att beräkna titern beaktades den virala utspädning som inducerade 5- 20% av GFP-positiva celler (figur 5C). Vanligtvis får vi en viral titer på ~ 1010 (TU / mL) för GFP-adenovirus.
Nedan ger vi ett exempel på en adenoviral titer beräkning för en specifik adenoviral sats där 300000 celler (C) transduced med 1 mL adenoviral lösning (V), vid en utspädning faktor 106 (D), för vilka 6% GFP-positiva celler (F) erhölls:
Titer (TU/ml) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 1010 TU/mL
Figur 5: Bedömning av adenoviraltitern. AD293 celler var smittade med olika adenoviral utspädningar. Fyrtioåtta timmar senare observerades cellerna av fluorescensmikroskopi och analyserades av flödescytometri för att bestämma procentandelen GFP-positiva celler som inducerats av olika adenoviral utspädningar (A-D). För att fastställa porten för flödescytometri analyserades också icke-transduced celler (E). Titern beräknad för utspädningsfaktorn 106, när 6% av cellerna var GFP-positiva var 1,8 x 1010 TU/ ml. För paneler A-E, staplar: 100μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att testa transduktionspotentialen hos det beredda adenoviruset användes fyra cellinjer: mänskliga endotelceller (EA.hy926), bovina aorta endotelceller (BAEC), murin hepatocyter (Hepa 1-6) och murin mesenchymala stromal celler (MSC). Endotelceller (EA.hy926 och BAEC) transducerades med 25 TU/cell, hepatocyterna transducerades med 5 TU/cell och MSC transduced med 250 TU/cell.
Här är ett exempel på hur volymen av adenoviral suspension som behövs för att infektera 3 x 106 celler med 25 TU/cell, med hjälp av adenoviral suspension med 1,8 x 1010 TU/mL, beräknades.
För 1 cell ................. 25 TU (på 25 )
3 x 106 celler ................. x TU 
x=75 x 106 TU
Om virusbeståndet innehåller
1,8 x 1010 TU ................. 1 ml
75 x 106 TU .............. y ml y= 4,2 x 10-3 ml = 4,2 μL viruslager
Fyrtioåtta timmar efter transduktion analyserades cellerna av fluorescensmikroskopi. Som framgår av figur 6transducerades mänskliga eller bovina endotelceller med god effektivitet (~50 %) för 25 TU/cell(figur 6 EA.hy926 och BAEC). Murin hepatocyter (Hepa 1-6) transducerades effektivt av adenovirus vid en låg mängd adenoviruspartiklar (5 TU/cell), men de är också känsliga för adenoviruset eftersom en högre andel döda celler (PI-positiva celler) registrerades (~ 16%) jämfört med de andra celltyperna. Mesenkymala stromal celler var de svåraste att överföra (Figur 6), på grund av bristen på specifika adenoviralreceptorer (opublicerade data).
Figur 6: Infektionsförmågan hos adenoviruset och induktionen av GFP-uttryck i transduced celler. Mänskliga endotelceller (EA.hy926), bovina aorta endotelceller (BAEC), murin hepatocyter (Hepa 1-6) och murin mesenchymala stromal celler (MSC) transduced med den angivna mängden adenovirus. GFP upptäcktes av fluorescensmikroskopi och andelen GFP positiva celler analyserades av flöde cytometri. PI-positiva celler som bestäms av flödescytometri visar celldödligheten som bestäms av virustransduktion. EA.hy926 celler, nötkreatur aorta endotelceller och Hepa 1-6 celler var mycket transduced av adenovirus, utbytet av transduktion sträcker sig från 41-52%. För MSC inducerade en högre mängd virus (250 TU/celler) endast 27% GFP positivt av de transduced cellerna. Staplar: 100μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Rekombinanta adenovirus är ett mångsidigt verktyg för genleverans och uttryck12,13,14. För att inducera starka protein uttryck genom adenoviral transduktion, kodning sekvensen av genen av intresse infogas i arvsmassan av adenoviruset. AdEasy adenoviral-systemet, utvecklat i Bert Vogelsteins laboratorium, består av en ryggradsplasmid (pAdEasy-1) som innehåller det mesta av det vilda typ adenoviruset serotyp 5 genom och en skyttelvektor (pAdTrack), utformad för genkloning2,10. Borttagningen av adenoviralgenerna E1 (ansvarig för montering av infektiösa viruspartiklar) och E3 (kodningsproteiner som är involverade i att undvika värdimmunitet) skapade ett utrymme i adenoviralgenomet, där en gen av intresse på 6,5-7,5 kb kan infogas2,3. Denna storlek är tillräcklig för många gener, särskilt för dem med kortare introner15,16,17. Det finns också forskare som rapporterar produktionen av adenovirus som bär cDNA av en transgen18,19,20. Vi fick dock en lägre avkastning av transgene uttryck för cDNA-bärande adenovirus än för deras motsvarigheter som bär en gen eller en mini-gen (data visas inte).
Att förbättra och anpassa de tidigaremetoderna 2,10,14,18,21, tekniken för adenoviral produktion kräver en kortare tid, lägre kostnad och mindre ansträngning. Adenoviral DNA i full längd erhålls genom rekombination mellan skyttelvektorn och pAdEasy-1-plasmiden i den homologa rekombinationsbenägna E. coli-stammen BJ5183. Protokollet innebär kemisk omvandling av AdEasier-1-celler (BJ5183 bakterier som innehåller pAdEasy-1). Denna teknik kräver inte en elektroporator som kanske inte är tillgänglig i vissa laboratorier, är mycket enkel, ökar rekombinationsutbytet och minskar den tid som krävs för att få kompetenta celler och utföra omvandlingen. Förvalet av rekombinanta kloner som utförs av PCR förkortar ytterligare tiden och underlättar hela proceduren. Ett liknande förfarande användes av Zhao och medarbetare22, men i protokollet optimerade vi sekvenserna av primers.
För GFP-adenovirusförpackningen och förstärkningen användes en HEK293 derivatcelllinje, nämligen AD293-celler, som är mer vidhäftande till odlingsplattan. Andra cellinjer som vanligen används för adenoviral produktion är följande: 911, 293FT, pTG6559 (A549 derivat), PER. C6 (HER derivat), GH329 (HeLa derivat), N52. E6 och HeLa-E123,24,25,26. I våra händer erhölls ingen förbättring av adenoviral produktionen när 911 celler användes (data visas inte). Transfektionen av AD293-celler med rekombinant plasmid med K2-reagens ökade kraftigt effektiviteten i virusförpackningssteget. Efter adenovirusproduktion är upp till ~ 70% av adenoviruset fortfarande inuti cellerna och frigörs av tre frys- och upptiningscykler. Att öka antalet cykler är inte lämpligt eftersom det förstör adenoviruset.
Under hela den rutinmässiga adenoviral produktionsprocessen frigörs många viruspartiklar i cellkulturmediet. Att kassera detta cellkulturmedium under skörden av de infekterade AD293-cellerna skulle resultera i en viktig virusförlust. Vi optimerade protokollet som beskrivs av Schagen och medarbetare för att rena adenoviral partiklarna från cellkulturmediet genom nederbörd med ammoniumsulfat27. Denna metod har en högre effektivitet i adenovirus återhämtning från cellkulturmediet jämfört med metoden med polyetylenglykol28. Det fällda adenoviruset ska renas omedelbart genom ultracentrifugation eller förvaras i kylskåpet i ett par dagar men först efter dialys, för att avlägsna saltöverskottet. Att hålla fällningen längre än några timmar utan dialys är skadligt för viruset.
Rening av adenoviral partiklar genom ultracentrifugation utförs i ett steg minskar manipuleringen av adenoviral beståndet och underlättar förfarandet jämfört med protokollen med hjälp av successiva ultracentrifugation steg14,29. Dialys av det renade adenoviruset är nödvändigt för att avlägsna cesiumklorid som ytterligare kan påverka transduktion. I protokollet använde vi Tris buffert som innehåller MgCl2 men inte sackaros för dialys, eftersom det kräver en enorm, omotiverad mängd sackaros som annars behövs som konserveringsmedel för frysning. Således lade vi till sackaros senare, direkt i adenoviralla bestånden som är beredda för frysning. För att undvika frekvent frysning och upptining av det renade adenoviruset är det lämpligt att alikvotera adenoviralla lager och lagra dem vid -80 °C. Adenoviral titer utvärderades av flöde cytometri med tanke på GFP reporter genen och andelen transduced celler för en specifik viral utspädning. Denna metod är snabbare jämfört med den klassiska "plackanalysen" och är mer pålitlig jämfört med utvärderingen av kapsidproteinerna (med olika metoder som ELISA eller flödescytometri) som inte avslöjar infektionskapaciteten hos adenoviralpartiklarna. ELISA-baserad kvantifiering, Q-PCR eller plackanalys med kommersiellt tillgängliga kit är dock alternativa metoder, särskilt användbara för titrering av adenovirus som inte innehåller en fluorescerande spårämne.
Med tanke på att pAdTrack adenovirus härrör från humana adenovirus serotyp 5 som känns igen av Coxsackievirus och Adenovirus Receptorer (CAR), visade vi kapaciteten hos GFP-adenovirus att omvandla celler av mänskligt ursprung (endotelceller), men också celler av annat ursprung: nötkreatur (endotelceller) och murin (mesenchymala stromala celler och hepatocyter). Data visade att GFP-adenovirus kan inducera en hög grad av uttryck av en transgene.
Sammanfattningsvis optimerade vi denna mödosamma teknik för att minska tiden, kostnaderna och den ansträngning som krävs för att få adenoviralpartiklarna. Det adenovirus som framställs kan infektera olika celltyper och inducera uttrycket av intressegenen. Detta protokoll kan användas i en mängd olika experiment eftersom den adenoviral-medierade genöverföringen representerar ett av de viktigaste verktygen för att utveckla moderna genterapier.
FÖRKORTNINGAR: AdV-GFP, adenovirala partiklar; BAEC, bovina aorta endotelceller. CsCl, cesiumklorid; GFP, grönt fluorescerande protein; MSC, mesenchymala stromal celler; TU, givarenheter.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett projekt som medfinansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden genom det operativa programmet för konkurrenskraft 2014–2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; förkortning diabeter), ett bidrag från det rumänska ministeriet för forskning och innovation PCCDI- UEFISCDI, projektnummer PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 inom PNCD III och av den rumänska akademin. Författarna tackar Kyriakos Kypreos (University of Patras, Grekland) för hans generösa och relevanta råd, Ovidiu Croitoru (University of Fine Arts, Bukarest, Rumänien) för filmning, filmredigering och grafisk design, och Mihaela Bratu för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AD293 cells | Agilent Technologies | 240085 | |
| AdEasier-1 cells | Addgene | 16399 | |
| Agarose I (for electrophoresis) | Thermo Scientific | 17850 | |
| Ammonium sulfate | Sigma | A4418 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma | A0166 | |
| BamH I | Thermo Scientific | FD0054 | |
| Cell culture plates 100 mm | Eppendorf | 30702115 | |
| Cesium chloride | Sigma | L4036 | |
| DH5alpha bacteria | Thermo Scientific | 18265017 | |
| DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) | Gibco | 3240-027 | |
| EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol (99.8%) | Roth | 5054.2 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524 | |
| Flasks T25, T75, T175 | Eppendorf | 30712129 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Hepa 1-6 murine hepatocytes | ATCC | CRL-1830 | |
| Hind III | Thermo Scientific | FD0504 | |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Scientific | 15160054 | |
| K2 Transfection System | Biontex | T060-5.0 | |
| LB medium | Formedium | LBx0102 | |
| LB-agar | Formedium | LBx0202 | |
| Mix & Go E. coli Transformation kit | Zymo Research | T3001 | |
| Midori Green Advanced DNA stain | Nippon Genetics Europe | MG-04 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Opti-MEM | Thermo Scientific | 31985070 | |
| Pac I | Thermo Scientific | FD2204 | |
| pAdEasy-1 | Addgene | 16400 | |
| pAdTrack-CMV | Addgene | 16405 | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) | Invitrogen | 15593-031 | |
| Polymerase GoTaq | Promega | M3005 | |
| Pme I (Mss I) | Thermo Scientific | FD1344 | |
| Potassium acetate | VWR Chemicals | 43065P | |
| Pst I | Thermo Scientific | FD0614 | |
| Qiagen Midi Prep kit | Qiagen | 12125 | |
| Cell Scraper | TPP | 99003 | |
| SDS | Thermo Scientific | 28365 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66330 | |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P5280-100G | |
| Syringe with 23G neeedle | B Braun | 464BR | |
| Tris HCl | Sigma | 1185-53-1 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Tubes 50ml | TPP | 91050 | |
| Ultra-Clear Tubes (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Centrifuge (refrigerated) | Sigma Sartorius | 3-19KS | |
| HeraeusFresco 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
| Ultracentrifuge with SW41Ti rotor | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | |
| Culture Hood | Thermo Scientific | Class II | |
| Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) | Thermo Scientific | ||
| Dry Block Heating Thermostat | Biosan | TDB-120 | |
| Thermocycle | SensoQuest | 012-103 | |
| Water Bath | Memmert | WNB 14 |
References
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81, Pt 11 2573-2604 (2000).
- Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells. European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).
- Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion. Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).
- Kreppel, F., Kochanek, S. Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).
- Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield. Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).
- Jager, L., Ehrhardt, A. Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders. Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).
- Luo, J., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Dumitrescu, M., et al. Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
- Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).
- Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting. Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).
- Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).
- Zvintzou, E., et al. Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity. Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).
- Karavia, E. A., et al. Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice. Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).
- Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties. Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).
- Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma. World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).
- Ambar, B. B., et al. Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand. Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).
- Okuyama, T., et al. Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system. Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).
- van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. Adenovirus-mediated gene transfer. Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).
- Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR. Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).
- Kovesdi, I., Hedley, S. J. Adenoviral producer cells. Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).
- Lin, X. Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors. Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).
- Fallaux, F. J., et al. Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).
- Altaras, N. E., et al. Production and formulation of adenovirus vectors. Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).
- Schagen, F. H., et al. Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield. Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).
- Colombet, J., et al. Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).
- Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).
