Summary
Bu makale, mikroplastikler gibi parçacık kirleticilerin toksikolojik çalışmaları için yumurta kabuğu kullanmadan bir kuluçka yöntemi sunun.
Abstract
Mikroplastikler, hayvan doku ve organlarındaki alım ve translokasyon nedeniyle hayvanlar için büyük bir sağlık tehdidi oluşturan gelişmekte olan küresel bir kirletici türüdir. Mikroplastiklerin kuş embriyolarının gelişimi üzerindeki ekotoksikolojik etkileri bilinmemektedir. Kuş yumurtası tam bir gelişim ve beslenme sistemidir ve tüm embriyo gelişimi yumurta kabuğunda gerçekleşir. Bu nedenle, mikroplastikler gibi kirleticilerin stresi altında kuş embriyosu gelişiminin doğrudan bir kaydı, geleneksel kuluçkadaki opak yumurta kabuğu ile oldukça sınırlıdır. Bu çalışmada mikroplastiklerin bıldırcın embriyo gelişimi üzerindeki etkileri yumurta kabuğu olmadan yumurtadan çıkarak görsel olarak izlendi. Ana adımlar döllenmiş yumurtaların temizlenmesi ve dezenfeksiyonu, maruz kalmadan önce inkübasyon, maruziyet sonrası kısa süreli inkübasyon ve numune ekstraksiyonu içerir. Sonuçlar, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, mikroplastiklere maruz kalan grubun ıslak ağırlığı ve vücut uzunluğunun istatistiksel bir fark gösterdiğini ve maruz kalan tüm grubun karaciğer oranının önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Ek olarak, inkübasyonu etkileyen dış faktörleri değerlendirdik: sıcaklık, nem, yumurta dönüş açısı ve diğer koşullar. Bu deneysel yöntem, mikroplastiklerin ekotoksikolojisi hakkında değerli bilgiler ve kirleticilerin embriyoların gelişimi üzerindeki olumsuz etkilerini incelemenin yeni bir yolunu sağlar.
Introduction
Plastik atık üretimi 2015 yılında yaklaşık 6300 Mt idi, bunların onda biri geri dönüştürüldü ve geri kalanı yakıldı veya yeraltına gömüldü. 2050 1'e kadar yaklaşık 12.000 Mt plastikatığın yeraltına gömüleceği tahmin edilmektedir. Uluslararası toplumun plastik atıklara dikkat etmesiyle Thompson, mikroplastik kavramını ilk olarak 2004 yılında öneren2. Mikroplastikler (milletvekilleri), parçacık çapı 5 mm'den az olan küçük parçacık plastiklerini ifade eder. Şu anda, araştırmacılar çeşitli kıtaların kıyı şeridinde, Atlantik Adaları'nda, iç göllerde, Kuzey Kutbu'nda ve derin deniz habitatlarında 3 ,4,5,6,7'demilletvekillerinin her yerde bulunduğunu tespit etmişlerdir. Bu nedenle, daha fazla araştırmacı milletvekillerinin çevresel tehlikelerini incelemeye başladı.
Organizmalar çevredeki milletvekillerini yutabilir. Milletvekilleri dünya çapında 233 deniz organizmasının sindirim sisteminde bulundu (%100 kaplumbağa türleri, %36 fok türleri, %59 balina türleri, %59 deniz kuşu türleri, 92 çeşit deniz balığı ve 6 çeşit omurgasız dahil)8. Dahası, milletvekilleri organizmaların sindirim sistemini engelleyebilir, birikebilir ve bobies9 'larındagöç edebilir. Milletvekillerinin besin zinciri üzerinden transfer edilebildiği ve alımlarının habitat, büyüme aşaması, beslenme alışkanlıkları ve besin kaynaklarının değişmesiyle farklılık gösterir10. Bazı araştırmacılar, deniz kuşlarının dışkısında milletvekillerinin varlığını bildirdi11Deniz kuşlarının milletvekillerinin taşıyıcısı olarak hareket ettiği anlamına gelir. Buna ek olarak, milletvekillerinin yutulması bazı organizmaların sağlığını etkileyebilir. Örneğin, milletvekilleri gastrointestinal sisteme dolanabilir, böylece cetaceanların mortalitesini arttırabilir12.
Milletvekilleri tek başına organizmalar üzerinde toksik etkilerin yanı sıra diğer kirleticilere sahip organizmalar üzerinde de eklem toksik etkilerine sahiptir. Çevre ile ilgili plastik döküntü konsantrasyonlarının yutulması yetişkin balıkların endokrin sistem işlevini bozabilir13. Mikroplastiklerin büyüklüğü organizmalar tarafından alım ve birikimlerini etkileyen önemli faktörlerden biridir14,15. Küçük boyutlu plastikler, özellikle nanosize plastikler, yüksek toksisiteye sahip hücreler ve organizmalarla etkileşime eğilimlidir16,17,18,19. Nano parçacık boyutundaki mikroplastiklerin organizmalar üzerindeki zararlı etkileri mevcut araştırma seviyesini aşsa da, mikroplastiklerin, özellikle ortamdaki mikrokomron/nano plastikler olmak üzere birkaç mikrometreden daha küçük boyutlarda tespit edilmesi ve nicelleştirilmesi hala büyük bir zorluktur. Ek olarak, nano plastiklerin embriyolar üzerinde de bazı etkileri vardır. Polistiren protein ve gen profillerini düzenleyerek deniz kestanesi embriyolarının gelişimine zarar verebilir20.
Milletvekillerinin organizmalar üzerindeki potansiyel etkilerini araştırmak için bu çalışmayı yürüttük. Kuş embriyoları ve insan embriyoları arasındaki benzerlik nedeniyle, genellikle anjiogenez ve anangiogenez, doku mühendisliği, biyomalzeme implantı ve beyin tümörleri dahil olmak üzere gelişimsel biyoloji araştırma21'dekullanılırlar 22,23,24. Kuş embriyoları düşük maliyetli, kısa kültür döngüsü ve kolay kullanım avantajlarına sahiptir25,26. Bu nedenle bu çalışmada deney hayvanı olarak kısa büyüme döngüsüne sahip bıldırcın embriyolarını seçtik. Aynı zamanda, embriyonik gelişim aşamasında milletvekillerine maruz kalan bıldırcın embriyolarının morfolojik değişimlerini yumurta kabuğu içermeyen bir kuluçka teknolojisi kullanarak doğrudan gözlemleyebiliyoruz. Kullanılan deneysel malzemeler polipropilen (PP) ve polistiren (PS) olarak kullanılmıştır. PP ve PS27 dünya çapında çökeltilerde ve su kütlelerinde elde edilen polimer türlerinin en büyük oranını oluşturduğundan, yakalanan deniz organizmalarından çıkarılan en yaygın polimer türleri etilen ve propilen28'dir. Bu deneysel protokol, milletvekillerinin milletvekillerine maruz kalan bıldırcın embriyoları üzerindeki toksikolojik etkilerinin görsel olarak değerlendirilmesi için tüm süreci açıklar. Diğer kirleticilerin toksisitesini diğer yumurtaparöz hayvanların embriyo gelişimine incelemek için bu yöntemi kolayca genişletebiliriz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pozlamadan önce hazırlık
- Maruz kalma testi için aynı gün doğan döllenmiş bıldırcın yumurtalarını seçin.
- Benzer ağırlıklara sahip bıldırcın yumurtalarını seçin. Her döllenmiş bıldırcın yumurtası yaklaşık 10-12 g'dır.
- Tüm döllenmiş bıldırcın yumurtalarını dış dışkı ve diğer döküntülerden tamamen temizleyin.
- Önceden taranmış her bıldırcın yumurtasını ve kullanılacak yumurtaları (Benzer kabuk şeklinde yumurtaları, özellikle yumurtanın ucunu seçin) bir antibiyotik çözeltisi (penisilin ve streptomisin, 1:1000, oda sıcaklığı) ile sterilize edin. kuluçka makinesini% 75 etanol ile sterilize edin.
- Yumurtaları bir diş matkabının künt ucuyla açın, yumurta kabuğunu daha fazla kullanım için uçta bırakın. Döllenmiş yumurtaları aktarmadan önce, yumurtaların içeriği dökülür. Bu, yumurta kabuğunun nemini korumaktır. Yumurtanın açılış çapı yaklaşık 3 cm idi.
NOT: Bıldırcın embriyosuna verilen zararı azaltmak için, yumurtanın kör ucunun açılması ve çatlağın mümkün olduğunca pürüzsüz olması için bir diş matkabı kullanın. - Sterilizasyondan sonra, döllenmiş bıldırcın yumurtalarını 24-48 saat boyunca% 60 neme sahip 38 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bıldırcın yumurtasının künt ucunun yukarı doğru yüzlerinden emin olun.
- Döllenmiş bıldırcın yumurtalarının inkübasyonu sırasında, sonraki deneylerde ihtiyaç duyulan aletleri sterilizasyon kabında sterilize edin. Bu aletler arasında plastik sargı, bir beher, steril su, pipet uçları, cerrahi düz makas, cımbız ve kaşık bulunur.
NOT: Yüksek sıcaklık sterilizasyonu ile ilgili sorunları önlemek için yeterince yüksek sıcaklık toleranslı bir film kullanın.
2. Bıldırcın yumurtasını kabuksuz yumurtadan çıkarmak
- Önceden yumurtadan çıkmış döllenmiş bıldırcın yumurtalarını inkübatörden temiz bir tezgaha aktarın ve yaklaşık 1-2 dakika stabilize etmek için kabın üzerine düz bir şekilde koyun.
- Önceden taranmış döllenmiş bıldırcın yumurtalarının orta ekseninde küçük bir delik (çap 3 mm) dürtmek ve 1-2 cm küçük açıklığı kesmek için makas (12,5 cm cerrahi düz makas) kullanın. Döllenmiş bıldırcın yumurtalarının yumurta akı ve sarısını kesilmiş yumurta kabuğuna dikkatlice aktarın.
NOT: Makasla küçük bir açıklık keserken bıldırcın yumurtasının sarısına dokunmaktan kaçının. - Üç parçacık boyutuna (100, 200 ve 500 nm) sahip farklı kütlelerin (0,1, 0,2 ve 0,3 mg) açıkta kalan çözeltisini (milletvekilleri olmadan) pipetle yumurta içeriğine ekleyin. Aynı zamanda, 1 mL şırınna ile 1 damla penisilin ve 1 damla streptomisilin ekleyin.
- Yumurta kabuğunun açıklığı sterilize edilmiş filmle örtün (adım 1.6).
- Adım 2.1-2.4'e göre, tüm döllenmiş bıldırcın yumurtalarını tedavi edin.
- Transfer edilen bıldırcın embriyolarını gerekli süre boyunca% 60 nem ile 38 ° C inkübatöre yerleştirin. Bu deneyde, ±30 ° 'lik bir yumurta dönüş açısı kullanın. Yumurtaları saatte bir kez çevirin.
NOT: Transfer mümkün olduğunca hızlı olmalıdır, bu da erken aşamada daha fazla pratik gerektirir.
3. Örnek toplama
- Yedi günlük kültürden sonra, çıplak gözle gözlemlenen iyi gelişmiş embriyoları yumurta sarısından çıkarın ve fosfat tamponlu çözelti (PBS) ile yıkayın.
- Temizlenmiş embriyonun dışındaki fazla çözeltiyi emici kağıtla kurulayın ve temiz bir Petri kabında tartın.
- Tüm göğüs boşluğunu açın, karaciğeri ve kalbi iğne burun pensesi ile visseradan ayırın ve temizlendikten hemen sonra 1,5 mL santrifüj tüplerine yerleştirin.
- Ağırlığı elektronik bir dengeye hızla kaydedin ve hepatosomatik indeksi hesaplayın (HIS = karaciğer ağırlığı / vücut ağırlığı x 100). Sternumun ve vücudun uzunluğunu ölçün.
- Yukarıdaki göstergelere dayanarak, milletvekillerinin embriyonik gelişim üzerindeki etkisini değerlendirin.
NOT: Buradaki embriyo kalitesi yumurta sarısı çıkarma kalitesini ifade eder.
4. Veri analizi
- Deneysel verileri ortalama ± standart hata (SEM) şeklinde bildirin.
- Birden fazla örnek grubunun araçlarını karşılaştırmak için varyans tek faktörlü analizini kullanın. Önemli fark değeri α = 0,05 idi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel verilerin analizi için, ıslak ağırlık, vücut uzunluğu, sternum uzunluğu ve kontrol grubu ile 6 deney grubu arasındaki hepatosomatik indeksin değişimini karşılaştırarak bıldırcın embriyolarının büyüme ve gelişimini makro perspektiften ölçtük ve yansıttık. Her grupta altı normal bıldırcın embriyosu tespit ettik. Her embriyo gerekli Hamburger ve Hamilton (HH) aşamasına ulaştı.
Şekil 1'de,önceden taranmış döllenmiş bıldırcın yumurta içeriğini yarı küresel yumurta kabuklarına aktardık ve inkübatöre koyduk. Daha sonra üç gün boyunca orta kuluçka döneminde embriyo gelişimini kaydettik. Şekil 2'degösterildiği gibi A-A2 kontrol grubu, B-B2 ise bir tedavi grubudur. Makroskopik embriyo gelişimi açısından bakıldığında, embriyolar mikroplastiklerin olumsuz etkileri olmadan normal olarak gelişti.
Tablo 1 ve Tablo 2, bir haftalık maruziyet sonrası bıldırcın embriyosunun ıslak ağırlık, vücut uzunluğu ve sternum uzunluğunun ortalama ± SEM'idir. Tablolar, ıslak ağırlığın ve vücut uzunluğunun farklı maruz kalma gruplarında önemli ölçüde değiştiğini göstermektedir. 0.1 mg, 0.3 mg, 100 nm ve 500 nm milletvekilleri ile tedavi edilen grupların ağırlık ve vücut uzunluğu biraz azaldı. Vücut ağırlığı ve vücut uzunluğu 0.2 mg 200 nm mikroplastik tedavi grupları hafifçe artmıştır (P < 0.05).
Hepatosomatik indeks (HIS), bıldırcın embriyosundaki karaciğer oranını gösterir, bu da karaciğer gelişiminin derecesini değerlendirmek için önemli bir işarettir. Ayrıca, HSI karaciğer hücre zarı yaralanması ve enflamatuar infiltrasyon patogenezinde önemli bir rol oynar. Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterildiği gibi, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, mikroplastiklere maruz kaldıktan sonra tüm tedavi grubundaki karaciğer oranı önemli ölçüde artmıştır. Ancak 100 nm milletvekili tedavi gruplarının 0.2 mg ile 0.3 mg'ı ile kontrol grubu arasında anlamlı bir fark yoktu.
Şekil 1: Kabuksuz bıldırcın yumurtası yumurtaları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yumurta kabuğu olmadan kuluçkanın orta aşamasında 6, 7 ve 8. günde bıldırcın embriyo gelişimi. Yeşil ok gözleri işaret eder; mavi ok uzuvları işaret eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 7 gün boyunca milletvekillerine (nm) maruz kalındıktan sonra bıldırcın embriyolarının hepatosomatik indeksi. Kontrol ve tedavi grupları arasındaki anlamlı farklar * P < 0.05 ile endikedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 7 gün boyunca milletvekillerine (μm) maruziyet sonrası bıldırcın embriyolarının hepatosomatik indeksi. Kontrol ve tedavi grupları arasındaki anlamlı farklar * P < 0.05 ile endikedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Milletvekillerinin tedavisi | Ağırlık (g) | Uzunluk (cm) | Sternum uzunluğu |
| Kontrol | 2.509±0.324 | 5.425±0.477 | 1.025±0.094 |
| 100 nm | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0,950±0,152 |
| 200 nm | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 | 1.025±0.076 |
| 500 nm | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 |
Tablo 1: 7 gün boyunca milletvekillerine (nm) maruz kalındıktan sonra bıldırcın embriyolarının ıslak ağırlığı, vücut uzunluğu ve sternum uzunluğu
| Muamele | Ağırlık (g) | Uzunluk (cm) | Sternum uzunluğu |
| Kontrol | 2.161±0.166 | 5,23±0,26 | 1.10±0.04 |
| 0.1 mg | 1.960±0.338* | 4.82±0.75* | 1,04±0,04 |
| 0.2 mg | 2.410±0.366* | 5,25±0,26 | 1,07±0,10 |
| 0.3 mg | 1.901±0.759 | 4.95±0.15* | 1,02±0,09 |
Tablo 2: 7 gün boyunca milletvekillerine (μm) maruz kalındıktan sonra bıldırcın embriyolarının ıslak ağırlığı, vücut uzunluğu ve sternum uzunluğu. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, * P < 0,05'i, ** P < 0,01'i gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, temel gelişim indekslerini tespit ederek bıldırcın embriyo gelişimini değerlendirmek için etkili bir deneysel şema sunmaktadır. Ancak, bu denemede hala bazı sınırlamalar vardır.
İlk olarak, bıldırcın embriyolarının kuluçkanın sonraki aşamasında mortalitesi kabuksuz kuluçka nedeniyle daha yüksektir. Deneysel süreçte normal protein oranının yok edilmesi gibi yapay olarak kontrol edilemeyen faktörler vardır. Deneyin doğruluğunu sağlamak için embriyoların maruz kalma süresini sınırlandırıldık. Embriyotoksiklik araştırması ancak embriyo gelişiminin erken ve orta evrelerinde ortaya çıkabilir. İkinci olarak, milletvekillerinin bıldırcın embriyosu gelişimi üzerine çalışması sadece temel morfolojik analiz düzeyinde gerçekleşir. Bu nedenle, sonuçlar nispeten basittir ve kusurlar olabilir. Aynı zamanda, deneysel koşullar ve çalışma gereksinimleri bu deney sürecinde nispeten yüksektir. Bu nedenle, bazı dikkat çekici noktalar aşağıdaki gibi listelenmiştir:
Döllenmiş bıldırcın yumurtalarının yüzeyindeki zararlı patojenik mikroorganizmalar nedeniyle hazırlık çalışmalarında döllenmiş bıldırcın yumurtalarının dezenfekte edilmesi ve sterilize edilmesi çok önemlidir. Dezenfekte edilirse, mikroplar kuluçka sırasında döllenmiş bıldırcın yumurtalarına izinsiz girebilir ve bıldırcın embriyolarının ölümüyle sonuçlanabilir. Nakil başarılı olsa bile ölüm oranı daha yüksek olacaktır. Bu nedenle deneysel mortaliteyi azaltmak için dezenfeksiyon ve sterilizasyonda iyi bir iş yapılmalıdır.
Kuşlar yumurtadan çıktığında, genellikle yumurtaların konumunu değiştirirler ve yumurtalar için sabit bir sıcaklık ve fetüs için doğru pozisyonu korumak için hava sirkülasyonunu korurlar. Bu deneyde yumurta kabuğunun mühürlenerek film kullanılması kullanıldı. Yumurta dönme açısı çok büyükse, yumurta akı dışarı akacaktır. Çok küçükse, embriyo filmi ile yumurta kabuğu filmi arasında yapışma meydana gelebilir ve bu da ölü embriyolarla sonuçlanabilir. Bu nedenle, dönüş açısını gerçek duruma göre ayarlayın.
Bıldırcın embriyolarının transferi sırasında, önceden döllenmiş bıldırcın yumurtaları yatay olarak yerleştirilir ve daha sonra yumurta kabuğunun ortasında kesilir. Bu şekilde, yumurta beyazının küçük bir kısmı kolayca akar, bu da kalın ve ince yumurta akının normal oranını ve dağılımını yok eder. Bu, üstte olması gereken sarının bir tarafa eğilerek embriyonun ölmesine neden olmasını sağlar. Bu nedenle, transfer sırasında normal orantıyı ve dağılımı sağlamak için tüm yumurta beyazını yeni yarım küre yumurta kabuğuna akmaya özen gösterin.
Başarılı transferden sonra, deneyci sıvıyı doğrudan düşürmemeye dikkat etmelidir. Sıvı, kirleticilerin ve antibiyotiklerin eklenmesi sırasında yavaşça akmasını sağlamak için yumurta kabuğu duvarına güvenmelidir.
Yukarıda belirtilen dört noktaya ek olarak, kuluçka koşullarını kesinlikle kontrol edin. Sıcaklık, nem ve havalandırma dengesini koordine edin. En iyi kuluçka ortamını elde etmek için kuluçka laboratuvarını sessiz ve karanlık tutun.
Sonuç olarak, bu deney çevresel kirleticilerin bıldırcın embriyolarının gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için temel bir protokol sağlar. Embriyonik büyüme ve gelişme çalışmasında vasküler gelişim, oksidatif stres ve hücre hasarı gibi başka gösterge türleri de vardır. Yukarıdaki deney, embriyonik gelişimin morfolojik açıdan sadece basit bir makroskopik değerlendirmesidir. Son olarak, gelecekte geliştirilmiş araştırma fikri ve protokolü embriyo büyümesi ve gelişiminin toksikolojik çalışması için yeni bir yöntem sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok. Tüm yazarlar, bu makalenin çalışmalarını etkileyebilecek bilinen rakip finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma Sincan Uygur Özerk Bölgesi'ndeki Önemli Araştırma ve Geliştirme projeleri (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
- Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
- Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
- Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
- Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
- Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
- Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
- Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R.
- Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
- Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
- Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
- Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
- Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
- Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
- Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
- Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
- Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
- Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
- Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
- El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
- Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
- Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
- Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).
