Summary

שורש יבש רוט רוט מחלה אומר חומוס: מתודולוגיה מפורטת

Published: January 17, 2021
doi:

Summary

מחקר זה מציג מתודולוגיות כדי ללמוד את המנגנונים הפתומורפולוגיים והמולקולריים הבסיסיים חומוס –אינטראקציה בטיקולה Rhizoctonia. שיטת נייר הכתמים שימושית כדי ללמוד במהירות תגובות גנוטיפ חומוס, בעוד השיטה מבוססת סיר חולה יכול לשמש בו זמנית לכפות בצורת וזיהום R. bataticola ומסנן עבור גנוטיפים סובלניים.

Abstract

מחלת ריקבון שורש יבש (DRR) היא איום לחץ ביוטי המתעוררים על גידול חומוס ברחבי העולם. היא נגרמת על ידי פתוגן פטרייתי הנישא בקרקע, ריזוקוניה באטיקולה. בספרות, פרוטוקולים מקיפים ומפורטים שלב אחר שלב על מחלות הם דלים. מאמר זה מספק פרטים מלאים על השלבים המעורבים בהגדרת טכניקת נייר משתקת להקרנה מהירה של גנוטיפים להתנגדות ל-DRR. טכניקת הנייר הנוהקת קלה ופחות יקרה. שיטה נוספת, המבוססת על גישת החשיש החולה, היא חיקוי של זיהום טבעי וניתן ליישם אותה כדי ללמוד את הרכיבים המקיימים אינטראקציה – צמח, פתוגן וסביבה – המעורבים במשולש המחלה.

יתר על כן, בטבע, DRR מתרחשת בעיקר באזורי גידול חומוס ים, שם לחות הקרקע נסוגה ככל שצמיחת היבול מתקדמת. לחץ בצורת ידוע נטייה צמחי חומוס למחלת DRR. הבנה פתומורפולוגית ומולקולרית של אינטראקציה בין צמחים לפתוגן תחת לחץ בצורת יכולה לסלול את הדרך לזיהוי זנים עמידים בפני DRR מבריכת החיידקים של גרגירי החומוס. מאמר זה מספק מתודולוגיה צעד קדימה להכנת סיר חולה ואסה מחלה לאחר מכן. בסך הכל, המידע המוצג בזאת יסייע לחוקרים להכין את האנוקולום פטרייתי R. bataticola, לשמור על פתוגן זה, להגדיר את טכניקת נייר הכתמים, להכין תרבות חולה וסיר חולה, ולהעריך זיהום פתוגן בצמחי חומוס.

Introduction

ריקבון שורש יבש (DRR) היא אחת המחלות המשמעותיות מבחינה כלכלית חומוס1,2. זוהי מחלה ספציפית שורש הנגרמת על ידי רזוקטוניה bataticola (טלומורפ, Phaseomina). צמחים נגועים חסר שורשים לחוץ ויש להם טפירים שבירים ועלווה צהובה1,3. DRR תחת לחץ בצורת דווח להיות איום המתעוררים על גידולחומוס 1,2,3. יתר על כן, שכיחות DRR מדווח להיות מחמיר תחת לחץ בצורת בתנאי שדה1,2,3. DRR נפוץ יותר באזורי גשם מאשר בשדות שוריים4. ניצול זנים עמידים היא הדרך להתגבר על המחלה ולעוקף את השימוש בקוטל פטריות1,13. מכיוון שחיידקי חומוס הזמינים ברחבי העולם מטמינים וריאציהגנטית עבור התכונה 5, ההקרנה והזיהוי של גנוטיפים עמידים/רגישים הם קריטיים לרבייה מולקולרית לשיפור היבול.

תבניות מחלה חזקות, קלות וחסכונית חיוניות כדי לחקור את דפוסי הזיהום של ר. באטיקולה בגוזל. המחלה העיקרית assay משמש כדי לצפות בתגובה של גנוטיפים חומוס לזיהום R. bataticola היא טכניקת ניירכתמים 1,4. זוהי טכניקה פשוטה, ניתן לבצע באמצעות אינוקולום פטרייתי נוזלי, שתילים עם שורשים, ונייר כתם סטרילי. עם זאת, טכניקה זו לא נוצלה למקסימום שלה מכיוון שאין פרוטוקול שלב אחר שלב זמין בספרות.

בינתיים, טכניקת החשיש החולה כרוכה בהכנת תרבות חולה פוטנציאלית והטלת לחץ בצורת. בהתחשב בכך שלחץ בצורת מחמיר אתשכיחותמחלת DRR 3 , זה חיוני כדי ללמוד את האינטראקציה צמח-פתוגן תחתלחץ בצורת 6,7. טכניקת סיר חולה מספקת את הפלטפורמה למחקר כזה בו זמנית, קידום אפשרויות טובות יותר עבור הקרנת חיידקים והבנת הבסיס המכני של האינטראקציה. ניתן לטפל בשינויים פתומורפיים כגון עלייה באורך השורש וצמצום מספר השורשים הניגבים – הטבועים במחלת DRR – באמצעות טכניקתסיר חולה 1,3,7.

בזאת, פרוטוקול מפורט עבור נייר כתמים וטכניקות סיר חולה, אשר ניתן להשתמש כדי ללמוד את האינטראקציה בין חומוס ו R. bataticola ו germplasm חומוס מסך, מוצג. פרטי החומרים המשמשים במחקר ניתנים בטבלת החומרים.

Protocol

1. בידוד ר. באטיקולה ואחסון פרטים על הגנוטיפ של גרגירי החומוס ותסמיני DRR השתמש בצמחי חומוס (גנוטיפ, JG 62) כי בדרך כלל להראות סימפטומים DRR טיפוסי, כגון יבש, שורש ראשי שביר ללא שורשים לחוץ microsclerotia מתחת לקליפה ובתוך pith1,3. איסוף ושטיפה …

Representative Results

מחקר זה נועד להפגין טכניקות כגון נייר כתמים וטכניקות סיר חולה כדי להקל על הבנה פתומורפולוגית ומולקולרית של אינטראקציה צמח-פתוגן תחת לחץ בצורת. כדי להשיג זאת, צמחים המציגים תסמיני DRR1,3,4 נאספומתוך שדה חומוס, והפטרייה הייתה מבודדת באמצעות ש?…

Discussion

טכניקת הנייר הנוהקת מספקת גישה פשוטה לגנוטיפים של חומוס על המסך בתנאי מעבדה. מחיסון מטבל מאפשר חקירה של אינטראקציה על בסיס זמני עם שליטה קלה על עומס inoculum (דמות משלימה 1) ומאפשר בהקרנה חוץית. יתר על כן, אפילו שתילים צעירים יכולים לשמש. תרבות פטרייתית בת חמישה ימים(איור 1B)</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקטים במעבדת M.S.K נתמכים על ידי המכון הלאומי למימון הליבה של מחקר הגנום של הצמח. VI מאשרת DBT-JRF (DBT/2015/NIPGR/430). אנו מודים לסטודנטים מתאמנים, מיס רישיקה, מר ג’ייאכנדריאן ומיס דורגדבי על עזרה טכנית במהלך צילומי וידאו ומר סנדיפ דיקסיט, מיס אנג’אלי וד”ר אווניש ראי על הערכה ביקורתית של נתונים גולמיים וקבצי כתב היד. אנו מודים למר רחים ה. טראפדר ולמר סונדר סולנקי על עזרתם במעבדה. אנו מכירים DBT-eLibrary קונסורציום (DeLCON) ו ספריית NIPGR למתן גישה למשאבים אלקטרוניים ומתקן צמיחה צמח NIPGR עבור תמיכה צמח צמיחה / שטח.

Materials

Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

References

  1. Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea – where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
  2. Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  3. Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
  4. Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
  5. Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  6. Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
  7. Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
  8. Agrios, G. . Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
  9. Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
  10. Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. . Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
  11. Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
  12. Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).

Play Video

Cite This Article
Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

View Video