Tør Root Rot Disease Assays i kikært: en detaljeret metode
Summary
Denne undersøgelse præsenterer metoder til at studere patomorfologiske og molekylære mekanismer, der ligger til grundfor kikært – Rhizoctonia bataticola interaktion. Den blotting papir metode er nyttig til hurtigt at studere kikært genotype svar, mens den syge pot-baserede metode kan bruges til samtidig at pålægge tørke og R. bataticola infektion og skærm for tolerante genotyper.
Abstract
Tør rod rådne (DRR) sygdom er en spirende biotisk stress trussel mod kikært dyrkning rundt om i verden. Det er forårsaget af en jordbåren svampepatogen, Rhizoctonia bataticola. I litteraturen er omfattende og detaljerede trinvise protokoller om sygdomsanalyser sparsomme. Denne artikel indeholder fuldstændige oplysninger om de trin, der er involveret i opsætningen af en blotting papir teknik til hurtigt at screene genotyper for resistens over for DRR. Den blotting papir teknik er let og billigere. En anden metode, baseret på den syge pot tilgang, er en efterligne af naturlig infektion og kan anvendes til at studere de interagerende komponenter-plante, patogen, og miljø-involveret i sygdommen trekant.
Desuden i naturen, DRR forekommer for det meste i rainfed kikært dyrkningsområder, hvor jordens fugtighed aftager som afgrødevækst fremskridt. Tørke stress er kendt for at disponere kikært planter til DRR sygdom. Patomorfologiske og molekylære forståelse af plantepatogen interaktion under tørke stress kan bane vejen for identifikation af elite DRR-resistente sorter fra kikært kimkimplasm pool. Denne artikel indeholder en trinvis metode til fremstilling af en syg gryde og efterfølgende sygdomsanalyse. Samlet set vil de oplysninger, der præsenteres heri hjælpe forskere forberede R. bataticola svampeinokuculum, vedligeholde dette patogen, oprette blotting papir teknik, forberede syge kultur og syge pot, og vurdere patogen infektion i kikærte planter.
Introduction
Tør rodråd (DRR) er en af de økonomisk signifikante sygdomme hoskikært 1,2. Det er en rodspecifik sygdom forårsaget af Rhizoctonia bataticola (teleomorph, Macrophomina phaseolina). Inficerede planter mangler laterale rødder og besidder sprøde taproots og gule blade1,3. DRR under tørke stress er blevet rapporteret at være en spirende trussel mod kikærtdyrkning 1,2,3. Desuden rapporteres forekomsten af drr , der forværres under tørkestress underfeltbetingelserne 1,2,3. DRR er mere udbredt i regnvedte områder end i vandede marker4. Udnyttelsen af resistente sorter er den måde at overvinde sygdommen og omgå fungicid brug1,13. Fordi kikært kimmplasme til rådighed over hele kloden havne genetisk variation for træk5, screening og identifikation af resistente / modtagelige genotyper er afgørende for molekylær avl for afgrøde forbedring.
Robuste, nemme og omkostningseffektive sygdomsanalyser er afgørende for at undersøge R. bataticola infektion mønstre i kikært. Den primære sygdomsanalyse, der anvendes til at observere reaktionen af kikært genotyper til R. bataticola infektion er blotting papir teknik1,4. Det er en simpel teknik og kan udføres ved hjælp af flydende svampeinoculum, planter med rødder og sterilt blotting papir. Men, denne teknik er ikke blevet udnyttet til sit maksimum, fordi ingen trin-for-trin-protokol er tilgængelig i litteraturen.
I mellemtiden, den syge pot teknik indebærer forberedelse af en potentiel syg kultur og indførelse af tørke stress. Da tørkestress forværrer forekomsten af DRR-sygdomme3, er det vigtigt at undersøge samspillet mellem plantepatogener under tørkebelastning6,7. Den syge pot teknik giver platformen for en sådan samtidig undersøgelse, fremme bedre muligheder for kimlasma screening og forståelse af det mekanistiske grundlag for samspillet. Patomorfologiske ændringer såsom en stigning i rodlængde og reduktion i lateral rodtal- iboende drr sygdom-kan løses ved hjælp af syge potteknik 1,3,7.
Heri præsenteres en detaljeret protokol for blotting papir og syge pot teknikker, som kan bruges til at studere samspillet mellem kikært og R. bataticola og skærm kikært kimkimplasm, præsenteret. Oplysningerne om de materialer, der anvendes i undersøgelsen, findes i materialetabellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den blotting papir teknik giver en enkel tilgang til skærmen kikært genotyper under laboratorieforhold. Dipinokulering muliggør undersøgelse af interaktion på tidsbasis med nem kontrol over inokulumbelastningen (supplerende figur 1) og letter in vitro-screening. Desuden kan selv unge planter bruges. Fem dage gamle svampekultur ( Figur1B) kan give nok inoculum til at inficere planterne. Flydende inoculum indeholder både mycelia og mikrosklerroti (Fi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projekter på M.S.K lab støttes af National Institute of Plant Genome Research kernefinansiering. VI anerkender DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Vi takker praktikantstuderende, Miss Rishika, Mr. Jayachendrayan, og Miss Durgadevi for teknisk hjælp under videooptagelse og Mr. Sandeep Dixit, Miss Anjali og Dr. Avanish Rai for kritisk vurdering af rå data og manuskriptfiler. Vi takker Mr. Rahim H Tarafdar og Mr. Sunder Solanki for deres hjælp i laboratoriet. Vi anerkender DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) og NIPGR Bibliotek for at give adgang til e-ressourcer og NIPGR Plant Growth Facility for plantevækst støtte / plads.
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea – where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. . Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. . Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
