Summary

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: eine detaillierte Methodik

Published: January 17, 2021
doi:

Summary

Diese Studie stellt Methoden zur Untersuchung der pathomorphologischen und molekularen Mechanismen vor, die der Kichererbsen–Rhizoctonia-Bataticola-Interaktion zugrunde liegen. Die Blotting-Papier-Methode ist nützlich, um Kichererbsen-Genotyp-Antworten schnell zu studieren, während die kranke Topf-basierte Methode verwendet werden kann, um gleichzeitig Dürre und R. Bataticola-Infektion und Bildschirm für tolerante Genotypen aufzuerlegen.

Abstract

Die Trockenwurzelfäule (DRR)-Krankheit ist eine sich abzeichnende biotische Stressgefahr für den Kichererbsenanbau auf der ganzen Welt. Es wird durch einen bodengestützten Pilzerreger, Rhizoctonia bataticolaverursacht. In der Literatur sind umfassende und detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle zu Krankheitsassays spärlich. Dieser Artikel enthält vollständige Details zu den Schritten bei der Einrichtung einer Blotting-Papiertechnik zum schnellen Screening von Genotypen auf DRR-Resistenz. Die Blotting-Papiertechnik ist einfach und kostengünstiger. Eine andere Methode, die auf dem Krankentopfansatz basiert, ist eine Mimik natürlicher Infektion und kann angewendet werden, um die interagierenden Komponenten – Pflanze, Krankheitserreger und Umwelt – zu untersuchen, die am Krankheitsdreieck beteiligt sind.

Darüber hinaus kommt DRR in der Natur vor allem in regengespeisten Kichererbsenanbaugebieten vor, wo die Bodenfeuchtigkeit mit fortschreitendem Pflanzenwachstum abgeht. Dürrestress ist dafür bekannt, Kichererbsenpflanzen für DIE DRR-Krankheit prädisponieren. Das pathomorphologische und molekulare Verständnis der Pflanzen-Pathogen-Interaktion unter Dürrestress kann den Weg für die Identifizierung von ELITE-DRR-resistenten Sorten aus dem Kichererbsen-Keimplasmapool ebnen. Dieser Artikel enthält eine schrittweise Methodik für die Vorbereitung eines Krankentopfs und den anschließenden Krankheitstest. Insgesamt werden die hier vorgestellten Informationen den Forschern helfen, R. bataticola pilzinoculum vorzubereiten, diesen Erreger zu erhalten, die Blotting-Papier-Technik einzurichten, Krankenkultur und Krankentopf vorzubereiten und Krankheitserreger-Infektionen in Kichererbsenpflanzen zu bewerten.

Introduction

Trockenwurzelfäule (DRR) ist eine der wirtschaftlich signifikanten Krankheiten bei Kichererbsen1,2. Es ist eine wurzelspezifische Krankheit, die durch Rhizoctonia bataticola (Teleomorph, Macrophomina phaseolina)verursacht wird. Infizierte Pflanzen haben seitliche Wurzeln und besitzen spröde Taproots und gelbes Laub1,3. DRR unter Dürrestress wurde berichtet, eine aufkommende Bedrohung für kichererbsenanbau1,2,3. Darüber hinaus wird berichtet, dass die DRR-Inzidenz unter Dürrestress unter Feldbedingungen1,2,3verschlimmert wird. DRR ist in Regengebieten häufiger als in bewässerten Feldern4. Die Verwendung resistenter Sorten ist der Weg, um die Krankheit zu überwinden und Fungizid-Einsatz zu umgehen1,13. Da Kichererbsen-Keimplasma, das auf der ganzen Welt verfügbar ist, genetische Variationen für das Merkmal5aufweist, sind das Screening und die Identifizierung resistenter/anfälliger Genotypen für die molekulare Züchtung für die Verbesserung der Ernte von entscheidender Bedeutung.

Robuste, einfache und kostengünstige Krankheitstests sind unerlässlich, um R. bataticola Infektionsmuster in Kichererbsen zu untersuchen. Die primäre Krankheit Assay verwendet, um die Reaktion von Kichererbsen-Genotypen auf R. Bataticola-Infektion zu beobachten ist die Blotting-Papier-Technik1,4. Es ist eine einfache Technik und kann mit flüssigem Pilzinokulum, Sämlingen mit Wurzeln und sterilem Blotting-Papier ausgeführt werden. Diese Technik wurde jedoch nicht maximal verwendet, da in der Literatur kein Step-by-Step-Protokoll verfügbar ist.

In der Zwischenzeit beinhaltet die Kranke Topftechnik die Vorbereitung einer potentiellen Krankenkultur und die Auferlegung von Dürrestress. Angesichts der Tatsache, dass Dürrestress die InzidenzderDRR-Krankheit 3 verschlimmert, ist es wichtig, die Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkung unter Dürrestress zu untersuchen6,7. Die Sick-Topf-Technik bietet die Plattform für eine solche simultane Studie, fördert bessere Möglichkeiten für das Keimplasma-Screening und das Verständnis der mechanistischen Basis der Interaktion. Pathomorphologische Veränderungen wie eine Erhöhung der Wurzellänge und eine Verringerung der lateralen Wurzelzahl – inhärent für DIE DRR-Krankheit – können mit der Krankentopftechnik1,3,7angegangen werden.

Hierin wird ein detailliertes Protokoll zum Blotting von Papier und Krankentopftechniken vorgestellt, mit dem die Wechselwirkung zwischen Kichererbsen und R. Bataticola und Screen-Kichererbsen-Keimplasma untersucht werden kann. Die Einzelheiten der in der Studie verwendeten Materialien sind in der Tabelle der Materialienangegeben.

Protocol

1. Isolierung von R. bataticola und Lagerung Details zum Kichererbsengenotyp und DRR-Symptomen Verwenden Sie Kichererbsenpflanzen (Genotyp, JG 62), die in der Regel typische DRR-Symptome zeigen, wie trockene, spröde Primärwurzel ohne laterale Wurzeln und Mikrosklerotie unter der Rinde und innerhalb der Pith1,3. Abholung und Waschen Entwurzelung stagnieren Pflanzen, die Symptome wie trockene strohfarbene …

Representative Results

Diese Studie zielte darauf ab, Techniken wie das Bloten von Papier und Kranke Topftechniken zu demonstrieren, um das pathomorphologische und molekulare Verständnis der Pflanzen-Pathogen-Interaktion unter Dürrestress zu erleichtern. Um dies zu erreichen, wurden Pflanzen mit DRR-Symptomen1,3,4 aus einem Kichererbsenfeld gesammelt, und der Pilz wurde mit der Hyphal-Spitzenmethode8isoliert. R. bataticol…

Discussion

Die Blotting-Papier-Technik bietet einen einfachen Ansatz, um Kichererbsen-Genotypen unter Laborbedingungen zu untersuchen. Die Dip-Impfung ermöglicht die untersuchung der Wechselwirkung auf zeitlicher Basis mit einfacher Kontrolle der Inokulumbelastung (Zusatzabbildung 1) und erleichtert das In-vitro-Screening. Darüber hinaus können auch junge Sämlinge verwendet werden. Fünf Tage alte Pilzkultur (Abbildung 1B) kann genug Inokulum liefern, um die Pflanzen zu infizieren….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Projekte im M.S.K-Labor werden vom National Institute of Plant Genome Research unterstützt. VI erkennt DBT- JRF an (DBT/2015/NIPGR/430). Wir danken Den Auszubildenden, Miss. Rishika, Mr. Jayachendrayan und Miss. Durgadevi für die technische Hilfe bei Videoaufnahmen und Herrn Sandeep Dixit, Miss. Anjali und Dr. Avanish Rai für die kritische Bewertung von Rohdaten und den Manuskriptakten. Wir danken Herrn Rahim H Tarafdar und Herrn Sunder Solanki für ihre Hilfe im Labor. Wir würdigen das DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) und die NIPGR Library für den Zugang zu e-Ressourcen und der NIPGR Plant Growth Facility für die Unterstützung/Raum für das Pflanzenwachstum.

Materials

Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

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Cite This Article
Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

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