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Biology

Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata

Published: January 17, 2021 doi: 10.3791/61702

Summary

Questo studio presenta metodologie per studiare i meccanismi patologici e molecolari alla base dell'interazionececi- Rhizoctonia bataticola. Il metodo della carta assorbente è utile per studiare rapidamente le risposte al genotipo dei ceci, mentre il metodo malato a base di vaso può essere utilizzato per imporre contemporaneamente siccità e infezione da R. bataticola e schermo per genotipi tolleranti.

Abstract

La malattia del marciume delle radici secche (DRR) è una minaccia emergente di stress biotico per la coltivazione di ceci in tutto il mondo. È causato da un agente patogeno fungino trasportato dal suolo, Rhizoctonia bataticola. In letteratura, i protocolli completi e dettagliati passo dopo passo sui test delle malattie sono scarsi. Questo articolo fornisce dettagli completi sui passaggi necessari per impostare una tecnica di carta assorbente per vagliare rapidamente i genotipi per la resistenza alla DRR. La tecnica della carta assorbente è facile e meno costosa. Un altro metodo, basato sull'approccio del vaso malato, è un imitatore dell'infezione naturale e può essere applicato per studiare i componenti interagenti - pianta, patogeno e ambiente - coinvolti nel triangolo della malattia.

Inoltre, in natura, la DRR si verifica principalmente nelle aree di coltivazione dei ceci piovosi, dove l'umidità del suolo si allontana con l'avanzare della crescita delle colture. Lo stress da siccità è noto per predisporre le piante di ceci alla malattia DRR. La comprensione patomorfologica e molecolare dell'interazione pianta-patogeno sotto stress da siccità può spianare la strada all'identificazione di varietà resistenti alla DRR d'élite dal pool di germoplasma ceci. Questo articolo fornisce una metodologia graduale per la preparazione di un vaso malato e il successivo saggio di malattia. Nel complesso, le informazioni qui presentate aiuteranno i ricercatori a preparare l'inoculo fungino R. bataticola, mantenere questo agente patogeno, impostare la tecnica della carta assorbente, preparare la coltura malata e il vaso malato e valutare l'infezione da agenti patogeni nelle piante di ceci.

Introduction

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Il marciume della radice secca (DRR) è una delle malattie economicamente significative nelceci 1,2. È una malattia specifica della radice causata da Rhizoctonia bataticola (teleomorfo, Macrophomina phaseolina). Le piante infette mancano di radici laterali e possiedono radici di rubinetto fragili e fogliamegiallo 1,3. Drr sotto stress da siccità è stato segnalato come una minaccia emergente per la coltivazione diceci 1,2,3. Inoltre, si dice che l'incidenza della DRR sia aggravata dallo stress da siccità nellecondizioni di campo 1,2,3. La DRR è più diffusa nelle aree piovose che nei campi irrigati4. L'utilizzo di varietà resistenti è il modo per superare la malattia ed aggirare l'uso difungicidi 1,13. Poiché il germoplasma di ceci disponibile in tutto il mondo ospita variazioni genetiche per il tratto5, lo screening e l'identificazione di genotipi resistenti / sensibili sono fondamentali per l'allevamento molecolare per il miglioramento delle colture.

Test di malattia robusti, facili ed efficaci in termini di costi sono essenziali per indagare i modelli di infezione da R. bataticola nei ceci. Il test della malattia primaria utilizzato per osservare la risposta dei genotipi di ceci all'infezione da R. bataticola è la tecnica della cartaassorbente 1,4. È una tecnica semplice e può essere eseguita utilizzando inoculo fungino liquido, piantine con radici e carta assorbente sterile. Tuttavia, questa tecnica non è stata utilizzata al massimo perché non è disponibile alcun protocollo passo-passo in letteratura.

Nel frattempo, la tecnica del vaso malato prevede la preparazione di una potenziale cultura malata e l'imposizione dello stress da siccità. Dato che lo stress da siccità aggrava l'incidenza della malattia DRR3, è essenziale studiare l'interazione pianta-patogeno sotto lo stress dasiccità 6,7. La tecnica del vaso malato fornisce la piattaforma per uno studio così simultaneo, promuovendo migliori possibilità per lo screening del germoplasma e comprendendo le basi meccaniche dell'interazione. I cambiamenti patologici, ad esempio l'aumento della lunghezza delle radici e la riduzione del numero di radici laterale, inerenti alla malattia DRR, possono essere affrontati utilizzando la tecnica delvaso malato 1,3,7.

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la carta assorbente e le tecniche di pentola malata, che può essere utilizzato per studiare l'interazione tra ceci e R. bataticola e germplasma di ceci dello schermo. I dettagli dei materiali utilizzati nello studio sono riportati nella tabella dei materiali.

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Protocol

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1. Isolamento di R. bataticola e stoccaggio

  1. Dettagli del genotipo ceci e dei sintomi drr
    1. Utilizzare piante di ceci (genotipo, JG 62) che generalmente mostrano sintomi tipici della DRR, come radice primaria secca e fragile senza radici laterali e microsclerotia sotto la corteccia e all'interno del midollo1,3.
  2. Raccolta e lavaggio
    1. Piante sradiche che mostrano sintomi come fogliare di colore paglierino secco e radice primaria fragile con microsclerotia sotto lo strato di epidermide. Durante lo sradicamento, una parte importante delle radici rimarrà all'interno del terreno poiché le radici infette sono fragili. Rimuovere i detriti grossolani del terreno attaccati alla radice. Tagliare le radici separatamente e raccoglierle in buste di carta (27,5 cm x 12 cm) con l'etichetta corretta e posizionarle in una scatola di raccolta del campione.
    2. Dopo aver trasportato i campioni in laboratorio, posizionare le radici in un bicchiere da 200 mL e coprire con rete (rete di nylon con dimensioni dei pori di 3 mm di diametro) e lavare accuratamente le radici con acqua di rubinetto corrente per rimuovere le particelle del terreno aderenti.
    3. Utilizzare acqua di osmosi inversa (RO) per risciacquare una volta alla fine.
  3. Sterilizzazione superficiale
    1. Rompere le radici in quattro pezzi con una lunghezza di 2 cm ciascuno con una lama bisturi e metterli in un becher pulito da 200 mL.
    2. Assembla acqua RO autoclavata, NaOCl al 2%, barattolo di scartamento e carta assorbente autoclavata (5 cm2)all'interno della camera di flusso laminare.
    3. Lavare le radici con 50 mL di acqua RO autoclavata tre volte e poi con 50 mL di 2% NaOCl per 10 min. Lavare le radici con 50 mL di acqua RO tre volte di nuovo per rimuovere il NaOCl.
    4. Asciugare le radici posizionando le radici su carta assorbente autoclavata e lasciare fino a quando le radici non vengono asciugate.
  4. Media e incubazione
    1. Rimuovere i bordi delle radici con una lama di bisturi sterilizzata. Dividere le radici usando la lama e utilizzare le forcelle sterilizzate per posizionarle su una piastra di Petri media di destrosio di patate (PDA) contenente solfato di streptomicina (50 mg L-1)e ampicillina (50 mg L-1).
    2. Chiudere la piastra, sigillare con parafilm e incubare in un'incubatrice a 28 °C per due giorni al buio.
  5. Metodo della punta hyphal
    1. Dopo due giorni di incubazione, portare le piastre nella camera di flusso laminare. Tagliare la punta della crescita ifale8 sotto uno stereomicroscopio (stereomicroscopio educativo Leica EZ4) e trasferirla in una piastra PDA fresca con solfato di streptomicina e ampicillina.
    2. Incubare le piastre nell'incubatrice a 28 °C per dieci giorni al buio.
  6. Conservazione e manutenzione dell'inoculo fungino R. bataticola
    1. Fare inclinazioni PDA in provette e trasferire una spina di agar fungina da una piastra di coltura vecchia di dieci giorni utilizzando il circuito di inoculazione sterilizzato a fiamma. Sigillare il tappo della provetta con parafilm.
    2. Incubare le inclinazioni a 28 °C per dieci giorni al buio.
    3. Sigillare nuovamente il cappuccio con parafilm e conservarlo a 4 °C in frigorifero per un uso futuro.
    4. Sottocultura ogni sei mesi per mantenere il fungo.
  7. Mantenimento della virulenza
    1. Infettare le piante con puro inoculo fungino preparato come menzionato nella tecnica del vaso malato3. Isolare lo stesso fungo dalle piante infette (postulati di Koch)9 e utilizzarlo per ulteriori esperimenti.
      NOTA: In questo studio è stato utilizzato un ceppo isolato sul campo del fungo (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Tecnica della carta assorbente

NOTA: La tecnica della carta assorbente comporta la preparazione di inoculo fungino liquido, preparazione delle piantine e valutazione della malattia.

  1. Preparazione del liquido R. bataticola inoculum
    NOTA: L'inoculo fungino liquido R. bataticola contiene sia micelia che microsclerotia. Entrambe queste strutture fungono da inoculo primario.
    1. Preparare 500 mL di supporti PDB in un pallone da 1.000 ml e autoclave a 121 libbre per 15 minuti.
    2. Dopo che il supporto è stato raffreddato, inoculare il brodo con un loopful di spina di agar fungino da una coltura fungina e incubare a 28 °C per cinque giorni in uno shaker a 180 giri/min al buio.
    3. Assembla un imbuto in vetro autoclavato o plastica (10 cm), un pallone conico da un litro e due strati di rete (dimensioni 10 cm2) (rete di nylon con la dimensione dei pori di 3 mm di diametro) sul tavolo. Filtrare la micelia fungina e la microsclerotia usando la rete. Asciugare il fungo in carta assorbente autoclavata.
    4. Pesare 100 g di mecelia per il 50% di inoculo e mantenere a temperatura ambiente.
  2. Preparazione della pianta di ceci
    1. Selezionare 50 semi sani (in questo studio è stato utilizzato il genotipo JG 62 suscettibile alla DRR), metterli in un becher da 100 mL e coprire con una rete.
    2. Lavare prima i semi con acqua del rubinetto per rimuovere i detriti del terreno.
    3. Portare il becher con i semi nella camera di flusso laminare e lavarli con 50 mL sterilizzati di acqua RO tre volte per 1 minuto per lavaggio.
    4. Sterilizzare i semi con 50 mL di NaOCl acquoso al 2% per 2 minuti con scuotimento continuo e lavare i semi con 50 mL di acqua sterilizzata cinque volte per 1 minuto ciascuno.
    5. Riempire un sacchetto di politene (47,5 cm x 25 cm) con Soilrite (una miscela di perlite espansa di grado orticolo, muschio di torba irlandese e vermiculite esfoliata in rapporto uguale, cioè, 1/3:1/3:1/3), seminare i semi sterilizzati in superficie 50 semi due cm di profondità e conservare in una camera di crescita/stanza con 28 °C ± 2 °C di temperatura, 16 h fotoperiodo con un'intensità luminosa di 150 μmol m−2 s−1e umidità relativa del 70%. Innaffiarli con acqua RO e sradicare le piante otto giorni dopo la semina.
    6. Lavare le radici nell'acqua del rubinetto per rimuovere le particelle di Soilrite. Risciacquare le radici con acqua RO sterilizzata e tenerle nell'acqua RO in un bicchiere da 1000 mL.
  3. Preparazione della carta assorbente in vassoi
    1. Prendi una carta assorbente e tagliali a pezzi (30 cm × 23 cm) in numero sufficiente per soddisfare le repliche.
    2. Imballare le lenzuola in un sacchetto di polietilene autoclavabile e autoclavarle a 121 libbre per 15 minuti e tenerle in un forno ad aria calda per l'asciugatura.
    3. Piegare ogni foglio di carta assorbente a metà.
    4. Posizionare la carta su un vassoio di plastica pulito e pulito dallo spirito, come illustrato nella figura 2i-iv.
  4. Inoculazione delle piante mediante immersione
    1. Sciogliere 100 g di inoculo fungino in acqua RO autoclavata da 200 mL in un bicchiere da 200 mL per ottenere il 50% di inoculo.
    2. Immergere le radici della pianta nell'inoculo preparato per 1 minuto con movimento intermittente su e giù per garantire un attacco uniforme dell'inoculo fungino.
  5. Posizionare le piante nella carta assorbente
    1. Bagnare il lato inferiore della carta assorbente posta sul vassoio con acqua RO sterile. Posizionare le piante sulla carta in un modo in cui solo le radici sono coperte dalla carta e i germogli vengono lasciati fuori.
    2. Chiuderlo piegando il lato superiore della carta assorbente e bagnare l'intera carta per fornire abbastanza acqua per sostenere la crescita delle piante.
    3. Innaffia il vassoio una volta al giorno e tieni i vassoi a 28 °C. Osserva quotidianamente i sintomi come necrosi, marciume radicale e ingiallimento delle foglie.

3. Tecnica del vaso malato

NOTA: La tecnica del vaso malato comporta la preparazione di inoculo virulento e una pentola malata, il mantenimento del livello di umidità e la valutazione dei sintomi della malattia.

  1. Preparazione del substrato
    1. Prendi un kg di qualsiasi semi di ceci disponibile in commercio. Rimuovere i semi infetti (semi con crescita fungina, macchie di infezione e danni agli insetti). Metterli in becher di plastica da 5 L e lavare accuratamente con acqua del rubinetto 3-4 volte per rimuovere i detriti principali.
    2. Lavare i semi con 2 L di acqua RO tre volte e immergere i semi da 1 kg in un bicchiere da 5 L con tre volte più acqua per cinque ore.
    3. Una volta che i semi hanno assorbito l'acqua, lavarli nuovamente con acqua RO per rimuovere gli essudati del seme.
    4. Rimuovere completamente l'acqua e imballare i semi in bottiglie di marmellata (300 mL, 12 cm di altezza, 6 cm di diametro e 155 g di peso) a circa 1/4di capacità (100 g per flacone di marmellata) e chiudere le bottiglie con tappi. Imballare dieci bottiglie di marmellata in un sacchetto di plastica autoclavabile (48 cm x 30 cm) autoclave due volte a 121 libbre per 15 minuti ininterrottamente.
    5. Asciugare i semi a 40 °C in forno durante la notte per rimuovere le goccioline d'acqua all'interno della bottiglia.
  2. Preparazione della cultura malata
    1. Accendere la camera di flusso laminare a livello BSL-2. Pulire accuratamente il pavimento con il 70% di etanolo e accendere l'UV per 15 minuti. Quindi, tenere i semi all'interno della camera di flusso laminare.
    2. Prendi la cultura R. bataticola appena isolata di 10 giorni (parte 1). Quindi, prendere tre tappi di agar fungino (diametro 4 mm) utilizzando una punta sterile di pipetta o una borsista di sughero e metterli in bottiglie di marmellata a livello aettico. Coprire le bottiglie con tappi e sigillare con parafilm.
    3. Agitare le bottiglie per mescolare il disco fungino con i semi di ceci in modo uniforme.
    4. Incubare le bottiglie a 30 °C per 15 giorni al buio.
    5. Prendere le bottiglie di marmellata con crescita fungina nera(Figura 4iii)e trasferire la coltura malata (semi con microsclerotia) dalle bottiglie di marmellata a una piastra di Petri di vetro utilizzando forcep sterili. Asciugarli a temperatura ambiente per due giorni in una piastra di Petri di vetro.
    6. In polvere la massa fungina usando un mortaio e un pestello e conservare la polvere a 4 °C.
    7. Autoclave Soilrite due volte a 121 libbre per 15 min.
    8. Asciugare il mix di Soilrite autoclavato sotto un ombrellone.
    9. Mescolare la polvere fungina con Soilrite al 50% w/w, riempire i vasi con la miscela e mantenerli a temperatura ambiente per un giorno.
    10. Seminare un seme di ceci resistente alla DRR sterilizzato in superficie per vaso (vasi rotondi di 10 cm)(Tabella dei materiali)e mantenere un livello di umidità dell'80% di capacità di campo (FC).
    11. Osserva i sintomi come necrosi e marciume radicale sradicando le piante dopo la germinazione.
  3. Valutazione dell'efficienza del vaso malato
    NOTA: Le piante mostrano sintomi fogliari gialli quando le radici sono completamente marce.
    1. Sviluppare un punteggio di malattia basato sui numeri della lesione (macchie necrotiche) (Figura supplementare 2C) e sulla gravità del marciume radicale. Vasi malati che mostrano il 90% di morte vegetale possono essere utilizzati ulteriormente.
  4. Screening genotipo
    1. Preparare la coltura malata in grandi quantità e mescolarla con Soilrite sterilizzata o terreno di campo (5% w/w) in vasi alti 30 cm. Innaffiare le pentole per bagnare la superficie e lasciarle indisturbate per sette giorni.
    2. Seminare un seme sterilizzato in superficie per 10 cm di pentola rotonda e tre semi per vasi rotondi di 30 cm e annaffiarli adeguatamente.
    3. Osservare i sintomi del marciume fogliare e radicale giallo.
  5. Siccità combinata e infezione da R. bataticola
    1. Imporre lo stress da siccità seguendo i protocolli menzionati in Sinha et al.

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Representative Results

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Questo studio mirava a dimostrare tecniche come la carta assorbente e le tecniche del vaso malato per facilitare la comprensione patologica e molecolare dell'interazione pianta-patogeno sotto stress da siccità. Per raggiungere questo obiettivo, le piante che mostravano sintomi DRR1,3,4 sono state raccolte da un campo di ceci e il fungo è stato isolato usando il metodo della punta ifale8. La coltura fungina di R. bataticola appare grigio scuro sulla piastra PDA e inclinata quattro giorni dopo l'incubazione (Figura 1A e C) e più scura nel colore grigio nel mezzo PDB cinque giorni dopo l'incubazione (Figura 1B). R. bataticola ha setto micelia (Figura 1D), e produce microsclerotia (Figura 1E), che agiscono come inoculo primario nel terreno10.

I passaggi indicati nella figura 2 sono stati seguiti per eseguire la tecnica della carta assorbente. Le piante di otto giorni sono state infettate da inoculo liquido (50%) e otto giorni dopo l'infezione, le piante sono state osservate per i sintomi. Le piante hanno mostrato marciume radicale a causa della necrosi estesa, così come l'ingiallimento delle foglie, che è il tipico sintomo radicale e fogliare della malattia DRR(Figura 3B e Figura supplementare 1A).

La tecnica del vaso malato è stata eseguita utilizzando i passaggi mostrati nella figura 4. Le concentrazioni di inoculo fungino nella Soilrite e nel terreno di campo erano rispettivamente del 10% e del 5%. I semi sensibili alla DRR mostrano i sintomi tipici della DRR come marciume radicale, mancanza di radici laterali, ingiallimento delle foglie e morte prematura, rispetto alle piante di controllo(Figura 5A e B). Le piante sottoposte a infezione nel vaso malato fatto con Soilrite sono morte e hanno mostrato marciume radicale sette giorni dopo la semina(figura 5C e figura supplementare 2C). Nel frattempo, le piante che crescono nel vaso malato fatto con terreno di campo hanno mostrato sintomi fogliari tipici, cioè fogliame color paglia 48 giorni dopo la semina (Figura 5E).

L'influenza della siccità sulla malattia DRR è stata studiata anche nel vaso malato in condizioni di laboratorio. Lo stress da siccità è stato imposto trattenendol'acqua 3. Le piante sotto stress da siccità (30% FC) hanno mostrato un'incidenza aggravata della malattia rispetto alle piante trattate solo con agenti patogeni (90% FC)(figura 6A e B). Il controllo e le piante trattate con siccità non hanno mostrato alcun sintomo(figure 6A e B). Le radici sotto stress combinato avevano più macchie necrotiche e marciume rispetto alle piante solo patogene (Figura 6B).

Figure 1
Figura 1: Caratteristiche morfologiche della Rhizoctonia bataticolaL'agente causale del marciume della radicesecca (Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) è stato isolato dal campo (Istituto Nazionale di Ricerca sul Genoma Vegetale, Nuova Delhi, 28.6139°N, 77.2090°E). Dalle colture, il fungo è stato isolato usando il metodo della punta ifale8. Le immagini mostrano la coltura di R. bataticola di 4 giorni in agar di destrosio di patate in una piastra di Petri(A),coltura liquida di 5 giorni(B)e cultura dell'inclinazione di 10 giorni(C). La micelia fungina (D) e la microsclerotia (frecce nere) (E) sono state prese in giro su uno scivolo al microscopio e macchiate rispettivamente di WGA-FITC e blu anilina. Le immagini (E, F, barra di scala, 20 e 50 μm) sono state catturate sotto la lente obiettivo 20x e 40x di un microscopio epifluorescente. Le frecce bianche mostrano le pareti trasversali nella micelia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Fasi coinvolte nell'inoculazione di R. bataticola e nei saggi DRR nella tecnica della carta assorbente. La superficie sterilizza i semi passandoli attraverso l'acqua corrente del rubinetto e lavando con il 2% di ipoclorito di sodio, seguita da lavaggio con acqua RO sterile 3-4 volte (fase 1). Quindi, seminare 30 semi in vasi alti 15 cm contenenti Soilrite (fase 2) e lasciare crescere i semi per otto giorni in una sala di crescita con 28 °C ± 2 °C di temperatura, fotoperiodo di 16 ore con un'intensità luminosa di 150 μmol m−2 s−1e umidità relativa del 70% (fase 3). Sradicare le piante e lavarle con acqua sterilizzata (fase 4). Preparare l'inoculo fungino inoculando i supporti PDB da 500 mL con funghi (fase 5). Per l'infezione, utilizzare la cultura del brodo fungino di 5 giorni. Quindi, inoculare le piante immergere le radici nell'inoculo fungino in un becher per 30 s e rimuovere l'inoculo in eccesso toccando la parete laterale interna del becher (fase 6). Dopo l'infezione, posizionare piante inoculate fungine e finte inoculate in diverse carte gonfie in vassoi puliti separati (fase 7). Inumidire quotidianamente la carta assorbente con acqua sterile adeguata e osservare i sintomi, vale a dire lo spargimento di radici lateralmente, l'ingiallimento e l'appassimento di foglie vegetali, semi marci e marciume radicale a otto giorni dopo l'infezione (fase 8)(A). Le immagini rappresentano passaggi essenziali (passaggi 3-7) (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Sintomi della malattia DRR nei ceci basati sulla tecnica della carta assorbente. Seguendo il protocollo descritto nella figura 2, le piante sensibili alla DRR (genotipo, JG 62) sono state sottoposte a infezione usando la tecnica della carta assorbente e i sintomi sono stati catturati otto giorni dopo l'infezione. Le immagini mostrano le piante di controllo rappresentative (mock-inoculated) con germogli sani (freccia rossa) e radici con radici più laterali (freccia gialla) (A). Le immagini mostrano le piante infette rappresentative con sintomi tipici, come l'appassimento, l'ingiallimento e l'essiccazione delle foglie (frecce blu) e radici essiccate / necrotiche con meno radici laterali (frecce bianche) (B). La barra di scala è di 1 cm. Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno cinque volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Panoramica della preparazione di vasi malati per l'inoculazione di R. bataticola e i test della malattia DRR. Preparare l'inoculo fungino inoculando una piastra PDA con un disco fungino da 5 mm di coltura fungina in crescita attiva e incubare a 28 °C per dieci giorni. Quindi, per preparare il substrato, lavare i semi di ceci con acqua del rubinetto, immergere i semi in acqua durante la notte e autoclave a 121 libbre per 15 minuti. Quindi, inoculare 100 g del substrato con tre tappi di agar della cultura di 10 giorni e mescolare bene. Quindi, incubare il substrato inoculato a 30 °C per 15 giorni in un'incubatrice. Schiacciare la coltura malata (substrato coltivato fungino), asciugarla e polverizzarla e conservarla a 4 °C. Quindi, mescolare 50 g di coltura malata con 100 g di Soilrite secca accuratamente (pentola malata)(A). Quindi, seminare i semi di ceci sensibili sterilizzati in superficie e osservare i sintomi, vale a dire, marciume della radice del rubinetto, necrosi della radice laterale e ingiallimento delle foglie. Assimilare le piante mostrando sintomi nello stesso vaso. Per ulteriori esperimenti, utilizzare i vasi che mostrano il 90% di infezione come genotipo suscettibile. Le immagini rappresentano l'inoculo (i), il substrato (ii) e il controllo e la coltura malata inoculata (iii) (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Sintomi della malattia DRR nei ceci basati sulla tecnica del vaso malato. Per fare una pentola malata, è stato utilizzato il protocollo raffigurato nella figura 4. Quindi, i semi di genotipo di ceci sensibili alla DRR sterilizzati in superficie (JG 62) sono stati seminati nel controllo (A) e nella pentola malata (B). Ogni pianta nel vaso rappresenta una replica, e la crescita delle piante morta o stentata è stata osservata nel vaso malato. Le piante sul lato destro del pannello (C) indicano rispettivamente la presenza e l'assenza di radici laterali (freccia gialla) nel controllo e nel trattamento. Il grafico mostra il numero di piante morte nel trattamento del vaso malato rispetto al controllo (D). Il vaso malato è stato preparato su terreno di campo sterilizzato raccolto dal campo NIPGR, e la coltura malata è stata mescolata. I semi sterilizzati in superficie sono stati seminati e i sintomi della malattia sono stati catturati 48 giorni dopo la semina. L'immagine mostra le piante di controllo (E), e sono indicati i tipici sintomi fogliari DRR, vale a dire l'essiccazione delle piante (frecce bianche). La significatività statistica è stata determinata utilizzando il test tdello studente. La barra rappresenta il SEM di nove repliche biologiche e l'asterisco denota un valore statisticamente significativo in P < 0,0001. La freccia gialla indica radice primaria necrotica/marcia, essiccata senza radici lateralmente. Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno dieci volte, con risultati simili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Il metodo del vaso malato è utile per studiare l'influenza dello stress da siccità sull'interazione pianta-patogeno. Un esperimento in vaso è stato condotto per studiare l'effetto della siccità sull'infezione da R. bataticola. L'esperimento comprendeva il controllo, solo siccità, solo patogeno(R. bataticola, patogeno),e la siccità combinata e lo stress di R. bataticola (stress combinato). Le piante venivano coltivate in una sala di crescita con una temperatura di 28 °C ± 2 °C, un fotoperiodo di 16 ore con un'intensità luminosa di 150 μmol m−2 s−1e il 70% di umidità relativa. Il vaso malato è stato preparato seguendo il protocollo raffigurato nella figura 4. Quindi, i semi di genotipo di ceci sensibili al DDR sterilizzato in superficie (JG 62) sono stati seminati in vaso di controllo e malati. I trattamenti di controllo e patogeni sono stati irrigati durante l'esperimento. Lo stress da siccità è stato imposto alle piante colpite dalla siccità e dal trattamento combinato dello stress. L'acqua è stata trattenuta 18 giorni dopo la semina e il livello di siccità desiderato è stato raggiunto 24 giorni dopo la semina. Le piante sono state osservate per i sintomi 29 giorni dopo la semina. L'immagine mostra i cambiamenti fogliare e radicale sotto i trattamenti (A). Le immagini mostrano radici vegetali non macchiate osservate sotto l'obiettivo 0,5X di uno stereomicroscopio di ricerca SMZ25/SMZ18 (B). La freccia rossa indica le radici laterale non infette e le frecce nere indicano le radici laterali infette. Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno dieci volte, con risultati simili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Dimensione dell'inoculo e riduzione del numero di radici laterale nei ceci. Seguendo il protocollo descritto nella figura 2, le piante sensibili alla DRR (genotipo, JG 62) sono state sottoposte a infezioni con varie dimensioni di inoculo usando la tecnica della carta assorbente e i sintomi sono stati catturati otto giorni dopo l'infezione. Le piante sono state inoculate con varie dimensioni dell'inoculo (0,1%, 1%, 10% e 20% w/v in acqua)Le immagini mostrano le piante infette rappresentative con sintomi tipici come l'appassimento, l'ingiallimento e l'essiccazione di foglie e radici essiccate / necrotiche con radici meno laterale (B). Il grafico mostra il numero di radici laterali nelle piante in infezione da variazione dell'inoculo (B). La barra di scala è 1 cm. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura supplementare S2: Sintomi fogliari di DRR nei ceci nella soilrite. Seguendo il protocollo descritto nella figura 4, sono stati seminati semi sterilizzati in superficie e i sintomi della malattia sono stati catturati 14 giorni dopo la semina. L'immagine rappresentativa mostra le piante di controllo (A) e l'immagine mostra i tipici sintomi fogliari DRR, vale a dire l'essiccazione delle piante (frecce bianche) (B). Il punteggio della malattia è stato sviluppato sulla base di macchie necrotiche sulle radici. Il punteggio è stato sviluppato durante i giorni (C). Le fotografie (A&B) provengono dallo stesso esperimento. Barra di scala= 3 cm. Clicca qui per scaricare questa cifra.

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Discussion

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La tecnica della carta assorbente fornisce un approccio diretto ai genotipi di ceci dello schermo in condizioni di laboratorio. L'inoculazione a immersione consente lo studio dell'interazione su base temporale con un facile controllo del carico di inoculo(figura complementare 1)e facilita lo screening in vitro. Inoltre, possono essere utilizzate anche giovani piantine. La coltura fungina di cinque giorni(figura 1B)può produrre abbastanza inoculo da infettare le piante. L'inoculo liquido contiene sia micelia che microsclerotia(figura 1D & E). I sintomi delmarciume radicale ( Figura 3B) possono essere utilizzati per segnare la malattia e identificare genotipi resistenti. L'insorgenza della DRR è fortemente influenzata dallo stress da siccità1,3,5. Tuttavia, con questa sola tecnica, l'imposizione dello stress da siccità è impossibile e lo screening con questa tecnica non rifletterà le risposte naturali.

La tecnica del vaso malato consente lo studio delle interazioni tra piante, agenti patogeni e stress da siccità. Fornisce un modo per migliorare i genotipi sotto siccità combinata e stress patogeno per identificare genotipi resistenti. In una pentola malata, lo stress da siccità può essere imposto a qualsiasi età della pianta e schermare le piante. Le piante mostrano sintomi tipici della DRR(figura 5C & F e figura complementare 2B & C)nel metodo del vaso malato. Le piante sottoposte a siccità combinata e infezione da agenti patogeni hanno mostrato un forte marciume radicale rispetto al trattamento solo patogeno. Ciò implica che il germoplasma di ceci disponibile deve essere schermato per identificare un genotipo resistente non solo all'agente patogeno, ma anche allo stress da patogeno e siccità combinato. Diversi studi sono stati tentati in precedenza per migliorare i genotipi, ma utilizzando la tecnicadella carta assorbente 11,12. Inoltre, è stato condotto anche lo screening sul campo, ma senza imporre lo stress dasiccità 11. È fondamentale imporre lo stress da siccità durante le diverse fasi del ceci e valutare la risposta del genotipo.

Problemi

Per la tecnica della carta assorbente, il volume dell'inoculo nel becher dovrebbe essere al livello in cui viene imballata l'intera radice della pianta. Inoltre, l'irrigazione in eccesso porterà a marciume umido delle radici delle piante. Non utilizzare acqua del rubinetto per annaffiare le piante perché può causare contaminazione.

Per la tecnica del vaso malato, sono preferibili le varietà di ceci Desi. Il numero di semi può variare a seconda delle esigenze dei ricercatori. Il volume d'acqua utilizzato per immergere i semi dovrebbe essere triplicato di più perché i semi assorbono l'acqua. La crescita batterica si verificherà se il lavaggio non viene eseguito correttamente. L'acqua non autoclavata può essere utilizzata per immergere i semi. Il colore dei semi dopo l'autoclave dovrebbe essere nero anziché marrone, il che indica un'autoclave impropria. L'asciugatura in un forno ad aria calda porta all'essiccazione dei semi; tali semi non possono essere utilizzati per l'inoculazione fungina. L'inoculazione delle bottiglie al di fuori del flusso laminare può causare contaminazione. La crescita fungina bianca nel pasto di ceci inoculato è un segno di autoclave impropria. Le precauzioni di biosicurezza devono essere seguite nello scartamento dell'inoculo usato, della carta assorbente e delle piante infette.

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Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare

Acknowledgments

I progetti del laboratorio M.S.K sono supportati dal finanziamento principale del National Institute of Plant Genome Research. VI riconosce DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Ringraziamo gli studenti tirocinanti, miss Rishika, Jayachendrayan e Miss Durgadevi per l'aiuto tecnico durante le riprese video e il signor Sandeep Dixit, la signorina Anjali e il dottor Avanish Rai per aver valutato criticamente i dati grezzi e i file manoscritti. Ringraziamo il signor Rahim H Tarafdar e il signor Sunder Solanki per il loro aiuto in laboratorio. Riconosciamo il Consorzio DBT-eLibrary (DeLCON) e la Biblioteca NIPGR per aver fornito l'accesso alle risorse e-resources e al NIPGR Plant Growth Facility per il supporto /spazio per la crescita degli impianti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  5. Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. (2006).
  6. Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  7. Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. (2018).
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  9. Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. 9780080473 (2004).
  10. Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. (1971).
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  13. Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata
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Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).More

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

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