Dry Root Rot Disease Analyser i Kikærter: en detaljert metodikk
Summary
Denne studien presenterer metoder for å studere patomorfologiske og molekylære mekanismer underliggendekikærter- Rhizoctonia bataticola interaksjon. Blotting papir metoden er nyttig for å raskt studere kikærter genotype svar, mens syke potten-basert metode kan brukes til å samtidig pålegge tørke og R. bataticola infeksjon og skjerm for tolerant genotyper.
Abstract
Tørr rot råte (DRR) sykdom er en fremvoksende biotisk stress trussel mot kikært dyrking rundt om i verden. Det er forårsaket av et jordbåren sopppatogen, Rhizoctonia bataticola. I litteraturen er omfattende og detaljerte trinnvise protokoller om sykdomsanalyser sparsomme. Denne artikkelen inneholder fullstendige detaljer om trinnene som er involvert i å sette opp en blotting papir teknikk for raskt screening genotyper for motstand mot DRR. Blotting papir teknikken er enkel og billigere. En annen metode, basert på den syke potten tilnærming, er en etterligning av naturlig infeksjon og kan brukes til å studere de interagerende komponentene- plante, patogen og miljø- involvert i sykdommen trekanten.
Videre, i naturen, drr forekommer det meste i rainfed kikært dyrking områder, hvor jord fuktighet trekker seg tilbake som avling vekst fremskritt. Tørke stress er kjent for å predisponere kikærter planter til DRR sykdom. Patologisk og molekylær forståelse av plante-patogen interaksjon under tørke stress kan bane vei for identifisering av elite DRR-resistente varianter fra kikærter germplasm bassenget. Denne artikkelen gir en trinnvis metodikk for fremstilling av en sykepotte og påfølgende sykdomsanalyse. Samlet sett vil informasjonen som presenteres her, hjelpe forskere med å forberede R. bataticola soppinokuleum, opprettholde dette patogenet, sette opp blotting papirteknikken, forberede sykekultur og sykepott, og vurdere patogen infeksjon i kikærtplanter.
Introduction
Tørr rot råte (DRR) er en av de økonomisk signifikante sykdommene i kikært1,2. Det er en rotspesifikk sykdom forårsaket av Rhizoctonia bataticola (teleomorph, Macrophomina phaseolina). Infiserte planter mangler laterale røtter og har sprø taproots og gult løvverk1,3. DRR under tørke stress har blitt rapportert å være en fremvoksende trussel mot kikært dyrking1,2,3. Videre er DRR forekomsten rapportert å bli forverret under tørke stress under feltforhold1,2,3. DRR er mer utbredt i regnvær enn i vanning felt4. Utnyttelsen av resistente varianter er måten å overvinne sykdommen og omgå soppdrepende bruk1,13. Fordi kikærter germplasm tilgjengelig over hele verden havner genetisk variasjon for egenskapen5,screening og identifisering av resistente / utsatt genotyper er avgjørende for molekylær avl for avling forbedring.
Robuste, enkle og kostnadseffektive sykdomsanalyser er avgjørende for å undersøke R. bataticola infeksjonsmønstre i kikærter. Den primære sykdomsanalysen som brukes til å observere responsen fra kikærtgenotyper til R. bataticolainfeksjon er blotting papirteknikk1,4. Det er en enkel teknikk og kan utføres ved hjelp av flytende soppinokuleum, frøplanter med røtter og sterilt blottingpapir. Denne teknikken har imidlertid ikke blitt brukt til det maksimale fordi ingen trinnvis-protokoll er tilgjengelig i litteraturen.
I mellomtiden innebærer sykepottteknikken utarbeidelse av en potensiell syk kultur og ileggelse av tørkestress. Gitt at tørkestress forverrer DRR sykdomsforekomst3, er det viktig å studere plante-patogene interaksjon under tørke stress6,7. Sykepotteteknikken gir plattformen for en slik samtidig studie, noe som fremmer bedre muligheter for germplasmscreening og forståelse av det mekanistiske grunnlaget for samspillet. Patologiske endringer som en økning i rotlengde og reduksjon i lateral rotnummer – iboende til DRR sykdom – kan løses ved hjelp av syke pottenteknikk 1,3,7.
Her presenteres en detaljert protokoll for blotting papir og sykepotteteknikker, som kan brukes til å studere samspillet mellom kikærter og R. bataticola og screen kikærterkimplasm. Detaljene i materialene som brukes i studien er gitt i Materials tabell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blotting papir teknikken gir en enkel tilnærming til skjermen kikærter genotyper under laboratorieforhold. Dip inokulasjon muliggjør utredning av interaksjon på timelig basis med enkel kontroll over inoculum belastning (Supplerende figur 1) og forenkler in vitro screening. Videre kan selv unge frøplanter brukes. Fem dager gammel soppkultur ( figur1B) kan gi nok inokuleum til å infisere plantene. Flytende inoculum inneholder både mycelia og mikrosklerotia (<strong clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prosjekter ved M.S.K lab støttes av National Institute of Plant Genome Research kjernefinansiering. VI anerkjenner DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Vi takker traineestudenter, Miss Rishika, Mr. Jayachendrayan og Miss. Durgadevi for teknisk hjelp under videoopptak og Mr. Sandeep Dixit, Miss. Anjali og Dr. Avanish Rai for kritisk vurdering av rådata og manuskriptfilene. Vi takker Mr. Rahim H Tarafdar og Mr. Sunder Solanki for deres hjelp i laboratoriet. Vi anerkjenner DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) og NIPGR Library for å gi tilgang til e-ressurser og NIPGR Plant Growth Facility for plantevekststøtte / plass.
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea – where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. . Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. . Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
