Summary
Desenvolvemos um modelo de rato de degeneração de disco intervertebral lombar por ressecção de processos spinous L3–L5, juntamente com ligamentos supra e inter-espinhosos e desprendimento de músculos paraspinos.
Abstract
A degeneração do disco intervertebral (IDD) é uma mudança patológica comum que leva à dor lombar. São desejados modelos animais adequados para entender os processos patológicos e avaliar novas drogas. Aqui, introduzimos um modelo de mouse de instabilidade lombar (LSI) induzido cirurgicamente que desenvolve IDD a partir de 1 semana após a operação. Em detalhes, o camundongo submetido à anestesia foi operado por incisão lombar, exposição de processos espinhosos L3-L5, descolamento de músculos paraspinos, ressecção de processos e ligamentos e fechamento da pele. Foram escolhidos para observação os IVDs L4-L5. O modelo LSI desenvolve IDD lombar por porosidade e hipertrofia em placas finais em estágio inicial, diminuição no volume de disco intervertebral, encolhimento na pulposo do núcleo em um estágio intermediário e perda óssea em vértebras lombares (L5) em um estágio posterior. O modelo de mouse LSI tem as vantagens da forte operabilidade, sem exigência de equipamentos especiais, reprodutibilidade, inexpensivo e período relativamente curto de desenvolvimento de IDD. No entanto, a operação LSI ainda é um trauma que causa inflamação na primeira semana após a operação. Assim, este modelo animal é adequado para estudo de IDD lombar.
Introduction
A degeneração do disco intervertebral (IDD) é comumente vista no envelhecimento e até mesmo em jovens causada por muitos fatores1. A cirurgia para pacientes que sofrem de IDD, causando dor lombar e movimento prejudicado, geralmente é realizada em estágio posterior ou em casos graves e tem riscos potenciais como não-união ou infecção2. O tratamento não-operacional ideal requer uma compreensão abrangente do mecanismo de IDD. O modelo animal IDD serve como ferramenta crucial para estudos do mecanismo de IDD e avaliação do tratamento do IDD.
Animais maiores foram escolhidos para modelos de IDD, como primatas, ovinos, cabras, cães e coelhos devido à sua semelhança com a estrutura anatômica humana em grande medida e à forte operabilidade em termos de tamanho de discos interverteberais (IVDs)3,4,5,6,7,8. No entanto, esses modelos animais são demorados e intensivos emcustos 9. O IVD do Rato é uma representação ruim do IVD humano com base em medições geométricas da proporção, razão de pulposo de núcleo para área discal, e altura normalizada10. Apesar da diferença de tamanho, o segmento ivD lombar do rato exibe propriedades mecânicas semelhantes ao IVD humano, como compressão e rigidez de torção11. Além disso, o modelo de IDD do mouse tem a vantagem do baixo custo, desenvolvimento de IDD relativamente curto e mais opções para animais e anticorpos geneticamente modificados utilizados em estudos mais mecanicistas12,13,14,15.
Os modelos de IDD induzidos por experimentais variam de indutores e aplicações. Por exemplo, a degeneração da matriz extracelular induzida pela colagem (ECM) é apropriada para a pesquisa de regeneração de ECM16. Fenótipo geneticamente modificado são adequados para estudar a função genética no processo de IDD e em terapias genéticas17. Modelos de incisão fibrosa e fumaça de Annulus imitam trauma e não inflamação induzida iDD12,18.
A instabilidade espinhal (SI) leva a uma coluna instável que não está em um estado de equilíbrio ideal. Pode ser causada pelo movimento anormal de um segmento de movimento lombar devido à fraqueza do tecido de apoio circundante, como ligamentos e músculos. Também é comumente visto após a operação de fusãoespinhal 19. O SI é considerado como a principal causa do IDD. Por isso, buscamos desenvolver um modelo de camundongos SI (focado na coluna lombar) que imita o processo de IDD humano20,21.
No protocolo, introduziu-se o procedimento de estabelecimento do modelo de camundongos de instabilidade lombar (LSI) pela ressecção do terço lombar (L3) para o quinto lombar (L5) processos espinhosos, juntamente com os ligamentos supraespinhals e interspinos(Figura 1A,B). O modelo animal desenvolve IDD já em uma semana pós-cirurgia, como mostrado pela hipertrofia e porosidade em placas finais (EPs). O volume de IVD começa a diminuir 2 semanas após a cirurgia até 16 semanas, juntamente com o aumento do escore de IVD, o que indica o grau de IDD. Acreditamos que o procedimento detalhado e visualizado é útil para os pesquisadores estabelecerem o modelo de camundongos LSI em seu laboratório e aplicarem-se à pesquisa de IDD conforme necessário.
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Protocol
As investigações descritas estão em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Todas as manipulações cirúrgicas foram realizadas sob anestesia profunda e os animais não sentiram dor em nenhum momento durante o procedimento.
1. Preparação para pré-operação
- Esterilização do instrumento: Instrumentos cirúrgicos esterilizados a vapor em uma autoclave (121 °C por 15 min) antes da cirurgia. Embalar instrumentos em um recipiente de metal e mantê-los até que sejam usados na cirurgia.
- Configuração da plataforma de cirurgia: Atribua uma área de banco de pelo menos 60 cm x 60 cm para a operação. Limpe a superfície da área com 75% de álcool e cubra com uma toalha médica descartável. Coloque um pacote de instrumentos cirúrgicos estéreis, reagentes, itens cirúrgicos em uma toalha médica descartável dentro da parte superior de 1/3 da área. Deixe o restante 2/3 da área limpa para operação cirúrgica. Adicione um hotpad por baixo da almofada cirúrgica para suporte térmico.
- Preparação animal
- Coloque o animal (camundongos C57BL/6J, macho, de 8 semanas) na câmara de indução. Ligue o vaporizador a um nível de indução de 4% para isoflurane e 4 L/min para oxigênio. Após o animal ser totalmente anestesiado, mantenha o anestésico com o cone do nariz e o parto anestésico a um nível de 1,5% para isoflurane e 0,4 L/min para oxigênio durante a cirurgia. Monitore o animal para respirar.
- Aplique pomada ocular de clortracícte para evitar o ressecamento da córnea durante a cirurgia.
- Raspe a área cirúrgica na superfície dorsal da região torácica inferior até o topo da região sacral usando um pequeno aparador animal. Remova a pele raspada com lenços umedecidos.
- Aplique creme depilatório na área raspada e deixe-o lá não mais do que 3 min. Retire o creme com gaze e lave com 2 mL de soro fisiológico estéril de 0,9%.
- Coloque uma almofada cilíndrica cirúrgica personalizada(Figura 2A)sob o abdômen do camundongo para elevar a coluna lombar e facilitar o funcionamento cirúrgico.
2. Exposição do terço lombar ao quinto lombar (L3–L5) processos espinhosos
- Use o dedo indicador para tocar os processos espinhosos subcutâneos das vértebras lombares, que são mais externas, e compare com vértebras torácicas e vértebras sacrais para identificar a região lombar.
- Enxágüe a pele usando 75% de álcool. Realize uma incisão de pele média de 3-4 cm sobre a região madeireira da região torácica média até o quadril usando uma lâmina de bisturi para expor a fáscia.
- Identifique a coluna lombar pela morfologia da fáscia posterior inserida nas pontas dos processos espinhosos. Em detalhes, a terceira lombar (L3) para o primeiro sacral (S1) fasciae são distintas de outras fáscias por suas formas "V". A última dica "V" se conecta à primeira fáscia sacral (S1) e a primeira dica "V" corresponde ao processo spinous L3 (Figura 2B).
- Faça as incisões musculares paraspinos posteriores ao longo dos processos espinhosos de L3 a L5 em ambos os lados lateralmente com uma lâmina de bisturi(Figura 2C). Controle a profundidade da incisão em direção às facetas para reduzir a hemorragia.
- Separe as camadas musculares usando duas fórceps oftálmicas para expor processos espinhosos L3 a L5 e ligamentos supraspinos.
3. Ressecção de processos espinhosos L3–L5 junto com os ligamentos
- Separar processos espinhosos individuais cortando ligamentos interspinos usando tesouras de Vênus(Figura 2D).
- Ressecante os processos spinous L3–L5 juntamente com os ligamentos interspinos com cisalhamento de Vênus(Figura 2E).
- Suturar a incisão da pele com tranças de seda estéril (tamanho sutura 5.0) sem recolocar os músculos paravertebral.
- Aplique a Pomada Ocular do Cloridrato de Clortracíctada no local cirúrgico.
- Administre buprenorfina-SR (25 L por grama de peso do rato) imediatamente após a cirurgia de LSI para analgesia.
- Coloque os animais em uma câmara quente e monitore durante a recuperação da anestesia. Monitore a ingestão de alimentos e água antes de devolver os animais à gaiola.
- Monitore o animal uma vez por dia durante os primeiros 3 dias após a operação. O animal deve ser capaz de ter um apetite normal e deve curar sem sinal de pus, hemorragia ou inchaço. Eles podem ter um pequeno prejuízo na locomoção.
- Realizar operações falsas apenas pelo desprendimento dos músculos paravertebral posteriores das vértebras L3-L5.
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Representative Results
O modelo de mouse LSI é aplicado nos estudos do mecanismo IDD, tratamento de IDD, degeneração da placa endplata (EP), como esclerose, e inervação sensorial em EP20,21,22,23. O mouse LSI desenvolve alterações degenerativas de IDD e EP, conforme identificado, pela diminuição do volume e altura do IVD, aumento do volume de EP e aumento das pontuações de IVD e EP.
A coluna torácica inferior dissecada e fixa foi examinada por tomografia micro computada de alta resolução (μCT) como descrito anteriormente20,21. A lombar torácica inferior com costelas foi incluída para identificação de vértebras L3–L5 (Figura 3A). Raios-X da coluna L3–L5 em uma visão lateral indicam existência e inexistência de processos espinhosos em grupos Sham e LSI(Figura 3B). Os resultados são mais claros pela reconstrução 3D da coluna L3–L5 em uma visão oblíqua anterior esquerda(Figura 3C) e pela imagem transversal de uma vértebra L3–L5 (Figura 3D).
Foram utilizadas imagens coronais do L4–L5 IVD para a realização de análises histomorfométricas 3D de IVD20 (Figura 4A). O volume IVD é definido como a região de interesse (ROI) cobrindo todo o espaço invisível entre as vértebras L4 e L5. Parâmetro: TV (volume total de tecido) foi utilizado para análise estrutural 3D(Figura 4B). O volume de IVD aumentou significativamente 1 semana após a cirurgia e começou a diminuir de 2 semanas para 16 semanas após a operação, como observado na Figura 4C.
A altura do espaço IVD variou do anterior ao posterior (Figura 4E,G). O LSI teve um efeito significativo no local traseiro. Assim, foi escolhido o plano coronal posterior de um terço do espaço IVD para a medição da altura ivd(Figura 4D,E). A altura do IVD diminuiu de 2 semanas para 16 semanas após a cirurgia(Figura 4F),o que foi consistente com os achados no volume de IVD(Figura 4C).
Imagens coronais do espaço L4–L5 IVD foram aplicadas a análises histomorfométricas 3D de placas finais cranianas e caudais (Eps)(Figura 5A). O volume da placa endplate (EP) é definido para cobrir a placa óssea visível perto das vértebras(Figura 5A,B)21. O plano coronal anterior de cinco imagens consecutivas de EP craniano foi utilizado para a reconstrução 3D(Figura 5C),que mostrou aumento das cavidades dentro do EP craniano em camundongos LSI(Figura 5D). Os resultados também foram indicados por um percentual aumentado de valores de separação trabecular que foram maiores ou iguais a 0,089 (Figura 5E). Enquanto isso, os volumes de EP aumentaram significativamente após a cirurgia(Figura 5F). Os EPs caudais apresentam fenótipo semelhante por LSI (Figura 5G,H),indicando que lSI leva à hipertrofia do EP e aumento das cavidades.
Os corpos vertebrais L5 foram reconstruídos desenhando o contorno de todas as seções transversais de cada corpo vertebral L5 sem acessórios e convertendo todas as imagens 2D em um modelo 3D. A construção e análise foram feitas com software comercial (por exemplo, NRecon v1.6 e CTAn v1.9, respectivamente). Os volumes de vértebra L5 aumentam ligeiramente após a cirurgia, mas só têm diferença estatística entre grupo falso e grupo LSI de 16 semanas(Figura 6B). Uma redução significativa no VB/TV também esteve presente 16 semanas após a cirurgia, indicando que o LSI causa perda óssea vertebral em um estágio posterior(Figura 6A,C).
O LSI induz a degeneração do IVD e a degeneração do EP, conforme indicado pelo aumento das notas ivd e EP24 (Figura 7A,C). A redução dos vacuoles intracelulares das células de pulposo do núcleo foi acelerada em grupos de LSI(Figura 7B). Cavidades aumentam em EPs LSI (Figura 7D) acompanhadas de aumento do número de osteoclartos, conforme indicado pela coloração da armadilha(Figura 7E,F).
Os dados foram mostrados como ± S.D. A significância estatística foi determinada pelo teste t de um aluno. O nível de significância foi definido como p < 0,05. Todas as análises dos dados foram realizadas utilizando-se o SPSS 15.0.
Figura 1: Esquema do modelo de mouse LSI. (A) Anatomia de L3–L5 vértebras na área inferior traseira do mouse. (B) Ressecção de processos espinhosos juntamente com ligamentos interspinos e ligamentos supraspinos (marcados pálidos). Uma linha pontilhada vermelha indica um plano de seção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exposição de processos l3–L5 e operação LSI. (A) Uma almofada cilíndrica feita sob medida é colocada sob o abdômen do mouse. (B) Exposição da fáscia lombar e identificação de processos spinous L3 a S1 por formas "V". (C) Incisões musculares paraspinosas laterais em ambos os lados dos processos espinhosos L3 a L5. (D) Exposição de processos espinhosos individuais cortando ligamentos interspinosos. (E) Ressecção de processos espinhosos L3–L5 com ligamentos inter e supra-espinhosos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Identificação LSI por μCT. (A) Localização de vértebras L3-L5 por costelas com vértebras torácicas em raios-X. (B) Raios-X em uma visão lateral e (C) reconstrução 3D em uma visão oblíqua anterior esquerda de L3-L5 em grupos Sham e LSI. (D) Plano transverso de vértebra lombar com a ressecção do processo espinhoso. (D) foi modificado a partir de Bian et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O LSI reduz o volume de IVD. (A) Imagens consecutivas do espaço invisível (Vermelho) entre L4 e L5 EPs são usadas para reconstrução 3D. (B) O volume ivd é definido pela TV de (A). (C) Quantificação do volume L4–L5 IVD em cinco pontos de tempo pós-operação. N = 8 por grupo. Os dados são mostrados como ± médias *p < 0,05, **p < 0,01 contra Sham. (D) Avião transverso e(E)plano sagital médio de corpos vertebrais lombares. Setas duplas azuis indicam diâmetro anteroposterior. Linha amarela indica plano 1/3 posterior. (F) Reconstrução de EPs cranianos e caudais utilizando cinco imagens consecutivas de plano coronal posterior de 1/3 de L4–L5. Vermelho indica espaço IVD. (G) Plano de sagiário médio de L4–L5. (C) foi modificado a partir de Bian et al.20. (F,G) foram modificados de Bian et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: LSI induz hipertrofia e porosidade do EP. (A) Plano Coronal de L4–L5. Linha pontilhada vermelha indica imagem de EP caudal usado para construção 3D. (B) Reconstrução do caudal L4 e cranial L5. Desenho animado azul indica EP caudal de L4–L5. (C) Plano de sagitar de L4–L5. Setas duplas azuis indicam diâmetro anteroposterior. Linha amarela indica plano 1/4 anterior. (D) Reconstrução de EPs cranianos por cinco imagens consecutivas do plano 1/4 anterior de L4–L5. (E,G) Percentual de distribuição de separação trabecular de Eps cranianos (E) e caudal(G)obtidos a partir de análises μCT. (F,H) Quantificação de cranial (F) e caudal (H). L4–L5 EP volume em pontos de tempo indicados. N = 8 por grupo. Os dados são mostrados como ± média p < 0,05 versus. Farsa. (D-H) foram modificados a partir de Bian et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: LSI causa perda óssea vertebral em estágio tardio. (A) Reconstrução de corpos vertebrais L5 em grupos sham e LSI de 16 semanas. (B,C) Quantificação da TV vértebra L5 (B) e BV/TV(C). N = 8 por grupo. Os dados são mostrados como ± médias p < 0,05, ** p < 0,01 contra. Farsa. (B) foi modificado a partir de Bian et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: LSI leva à degeneração de IVD e EP. (A) Escore de IVD em LSI ou camundongos falsos como indicação de degeneração do IVD. (B) Imagens representativas de Safranin O coloração para NPs em L4-L5 IVD. Branco indica vacuoles. Vermelho indica proteoglycan. (C) Escore de EP em LSI ou grupo falso como indicação de degeneração do EP. (D) Imagens representativas da mancha verde Safranin O-Fast para EPs caudal L4-L5. Manchas verdes/azuis calcificam cavidades. (E) Imagens representativas da coloração da armadilha para ePs caudal L4-L5. Roxo indica Armadilha+. N = 6 por grupo. Os dados são mostrados como ± médias p < 0,05, ** p < 0,01 contra. Farsa. (F) Quantificação da Armadilha+ osteoclastos em (E). (A,B) foram modificados a partir de Bian et al.20. (C–F) foram modificados a partir de Bian et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Desenvolvemos o modelo de camundongo de instabilidade lombar baseado no modelo de camundongos espondilose cervical no qual os músculos paravertebral posteriores das vértebras foram separados e os processos espinhosos, juntamente com os ligamentos supraspinos e interspinos foram ressecados25. Realizamos uma operação semelhante na coluna lombar, que tem processos espinhosos mais proeminentes. O modelo de mouse LSI desenvolveu IDD semelhante na coluna lombar.
As vantagens do modelo LSI incluem forte operabilidade, não há exigência de um equipamento especial, reprodutibilidade e um período relativamente curto de desenvolvimento de IDD.
Alguns pontos-chave são apresentados aqui para ajudar a melhorar a taxa de sucesso durante a operação. Estes também são os passos críticos. Primeiro, remova o cabelo na parte inferior das costas, o mais claro possível, porque qualquer cabelo raspado deixado na ferida pode causar reação anafilática. Em segundo lugar, recomenda-se uma almofada cilíndrica ou qualquer outra almofada para levantar as vértebras lombares. Terceiro, use micro tesoura para controlar a profundidade da incisão e a hemorragia. Quando a hematomatocoelia é notada durante a operação, pare a operação e sacrifique o rato, já que o rato não sobreviverá durante ou após a cirurgia. Em quarto lugar, o reapego do músculo paraspinous não é recomendado porque o reapego pode compensar a instabilidade. Em quinto lugar, uma ressecção completa de todos os processos spinous L3–L5 reduz a variabilidade no modelo individual. Em sexto lugar, evite ferir nervos e vasos sanguíneos circundantes, caso contrário, o rato pode desenvolver alterações patológicas não canônicas. Se os modelos não apresentarem o fenótipo típico como mostrado nos resultados, verifique os seis pontos acima.
O sucesso deste modelo LSI pode ser avaliado por duas normas áureas, incluindo o volume de IVD reduzido medido por ressonância magnética animal de pequeno porte ou por μCT, e um escore ivD baseado na observação histológica. O modelo LSI desenvolve IDD já em 2 semanas após a cirurgia LSI, mas desenvolve porosidade na placa final já em 1 semana, como observado. É adequado para estudo sobre encolhimento polpado do núcleo, esclerose endplata, IDD relacionado a citocinas induzidas por osteoclatos, osteoporose induzida por IDD (16 semanas após LSI) etc.
Existem algumas limitações no modelo LSI. A operação LSI é um trauma relativamente grande para o rato. A inflamação é inevitável e geralmente vista dentro de 7 dias após a operação. Assim, este modelo não é adequado para observar as primeiras alterações patológicas do IDD, especialmente no prazo de 7 dias causadas por alterações mecânicas de carga.
O modelo pode ser modificado mirando em diferentes vértebras lombares, comoapenas L 5 ou de L1 a L5. O controle saudável também é recomendado, além de grupos falsos.
Em resumo, desenvolvemos um modelo de camundongos de IDD lombar induzidos por cirurgia e temos o procedimento visualizado para ajudar outras pessoas a reproduzir o modelo animal e aplicá-lo em estudos de IDD.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81973607) e Essential Drug Research and Development (2019ZX09201004-003-032) do Ministério da Ciência e Tecnologia da China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chlortetracycline Hydrochloride Eye Ointment | Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd. | H31021931 | Prevent eye dry, Prevent wound infection |
| C57BL/6J male mice | Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN) | SCXK2018-0004 | Animal model |
| Disposable medical towel | Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd. | 20160090 | Platform for surgical operation |
| Inhalant anesthesia equipment | MIDMARK | Matrx 3000 | Anesthesia |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd. | 1903715 | Anesthesia |
| Lidocaine hydrochloride | Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd. | H37022839 | Pain relief |
| Medical suture needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 20S0401J | Suture skin |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | JD1050 | Clip the skin |
| Ophthalmic scissors(10cm) | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | Y00030 | Skin incision |
| silk braided | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 11V0820 | Suture skin |
| Small animal trimmer | Shanghai Feike Electric Co., Ltd. | FC5910 | Hair removal |
| Sterile surgical blades(12#) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 35T0707 | Muscle incision |
| Veet hair removal cream | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Hair removal |
| Venus shears | Mingren medical equipment | Length:12.5cm | Clip the muscle and spinous process |
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