Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحضير اللقاح المخصب بالفيروسات للعدوى الفموية لنحل العسل (Apis mellifera)

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61725
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

Summary

هنا نصف بروتوكولين: الأول لنشر واستخراج وتنقية وقياس كميات كبيرة من جزيئات فيروس نحل العسل غير المغلفة ، بما في ذلك طريقة لإزالة شرانق نحل العسل وثانيا لاختبار آثار العدوى الفيروسية باستخدام فحص حيوي قفص عالي التكرار وعالي الإنتاجية.

Abstract

يتمتع نحل العسل بأهمية بيئية وزراعية كبيرة في جميع أنحاء العالم ولكنه يخضع أيضا لمجموعة متنوعة من الضغوط التي تؤثر سلبا على صحة النحل ، بما في ذلك التعرض لمسببات الأمراض الفيروسية. يمكن أن تسبب هذه الفيروسات مجموعة واسعة من الآثار المدمرة ويمكن أن يكون من الصعب دراستها في كثير من الأحيان بسبب عوامل متعددة تجعل من الصعب فصل آثار العلاجات التجريبية عن عدوى الخلفية الموجودة مسبقا. نقدم هنا طريقة لإنتاج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس إلى جانب فحص حيوي عالي الإنتاجية لاختبار العدوى الفيروسية وآثارها. وبسبب النقص الحالي في خط خلايا نحل العسل المستمر والخالي من الفيروسات، يتم تضخيم الجسيمات الفيروسية في الجسم الحي باستخدام شرانق نحل العسل، والتي يتم استخراجها من الخلية بكميات كبيرة باستخدام منهجية الحد الأدنى من الإجهاد. يمكن بعد ذلك استخدام جزيئات الفيروس هذه في المقايسات الحيوية لأقفاص نحل العسل لاختبار صلاحية التلقيح ، بالإضافة إلى العديد من ديناميكيات عدوى الفيروس الأخرى ، بما في ذلك التفاعلات مع التغذية والمبيدات الحشرية ومسببات الأمراض الأخرى. ومن المزايا الرئيسية لاستخدام هذه الجسيمات أنها تقلل إلى حد كبير من فرص إدخال متغيرات غير معروفة في التجارب اللاحقة عند مقارنتها بالبدائل الحالية، مثل العدوى عن طريق هيموليمفاوية النحل المصابة أو المتجانسة، على الرغم من أنه لا يزال ينبغي توخي الحذر عند الحصول على النحل، لتقليل تلوث الفيروسات في الخلفية. واختبارات الأقفاص ليست بديلا عن التجارب الميدانية الواقعية واسعة النطاق التي تختبر آثار عدوى الفيروس على مستوى المستعمرة، ولكنها تعمل بدلا من ذلك كطريقة لإنشاء استجابات فيروسية أساسية يمكن أن تكون بمثابة أدوات مهمة لدراسة الأبعاد المختلفة للتفاعلات الفسيولوجية بين نحل العسل وفيروس العسل.

Introduction

يلعب نحل العسل (Apis mellifera) دورا حاسما في المشهد الزراعي العالمي الحديث ولكنه يعاني حاليا من مزيج من الضغوطات الحيوية وغير الحيوية ، بما في ذلك التعرض لمبيدات الآفات والأعلاف الفقيرة والطفيليات ومسببات الأمراض 1,2. واحدة من أهم مسببات الأمراض المثيرة للقلق هي الفيروسات ، وكثير منها ينتقل بواسطة آخر من الضغوطات الرئيسية لنحل العسل ، سوس الفاروا الطفيلي (Varroa destructor). يمكن أن تسبب هذه الفيروسات مجموعة من الآثار السلبية في نحل العسل بما في ذلك انخفاض بقاء الحضنة ، وعيوب النمو ، والشلل الذي يمكن أن يؤدي إلى انهيار الخلية الكلي قبل وبعد فترات الشتاء3،4،5. على الرغم من وجود تقدم واعد في تطوير التقنيات المستخدمة لمكافحة عدوى الفيروس6،7،8،9 ، إلا أن الديناميكيات التي تنتشر بها العديد من الفيروسات وتنتشر وتتفاعل داخل نحلة العسل أو المستعمرة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد 5,10 . إن فهم البيولوجيا الأساسية لنحل العسل وتفاعلات الفيروسات وعلاقاتها مع العوامل البيئية الأخرى أمر بالغ الأهمية لتطوير تقنيات فعالة لإدارة الفيروسات.

ومع ذلك ، فإن دراسة التفاعلات بين نحل العسل وفيروسه تشكل تحديات مع العديد من العوامل المعروفة وغير المعروفة التي تعقد العملية. وتشمل هذه التفاعلات مع النظام الغذائي11،12 ، والتعرض لمبيدات الآفات13 ، والخلفية الوراثية للنحل14،15. حتى عند التركيز على عدوى الفيروس وحدها ، فإن المضاعفات شائعة لأن مجموعات نحل العسل ، سواء المدارة أو البرية ، لديها دائما درجة معينة من عدوى الفيروس الخلفية ، على الرغم من أنها غالبا ما تكون دون إظهار أعراض حادة16,17 ، وآثار العدوى المشتركة للفيروس ليست مفهومة جيدا 18. وقد جعل هذا من الصعب فصل دراسة آثار فيروس نحل العسل.

استخدمت العديد من دراسات فيروس نحل العسل عدوى الفيروسات الظرفية للبحث عن التفاعلات مع الضغوطات الأخرى ، مع ملاحظة كيفية تغير العدوى الخلفية مع العلاجات الأخرى12،19،20،21. وفي حين أن هذا النهج كان ناجحا في تحديد الآثار الهامة، وخاصة اكتشاف كيفية تأثير مبيدات الآفات أو العلاجات الغذائية على مستويات الفيروس وتكراره، فإن التلقيح بعلاج الفيروس بمحتوى وتركيز معروفين أمر بالغ الأهمية للاختبار التجريبي لديناميات عدوى الفيروس. ومع ذلك ، فإن فصل العلاج التجريبي عن العدوى الخلفية يمكن أن يشكل أيضا تحديات. في الدراسات الميدانية ، قام الباحثون بالتمييز بين سلالات فيروس الجناح المشوه (DWV) لتقديم أدلة على انتقال الفيروس من نحل العسل إلى النحل الطنان22 ، ولكن استخدام هذا النهج سيكون صعبا داخل نحل العسل وحده. تعد الحيوانات المستنسخة المعدية للفيروسات أداة قوية ، ليس فقط لتتبع العدوى 23،24،25 ولكن لدراسات علم الوراثة العكسية لفيروسات نحل العسل ولأبحاث التفاعل بين الفيروس والمضيف 26،27،28. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، لا تزال هناك حاجة إلى استنساخ المعدية لتحقيق دورة العدوى داخل الخلايا لإنتاج الجسيمات. ويفضل استخدام هذه الجسيمات كلقاح للعلاجات التجريبية لأن عدويتها أعلى من الحمض النووي الريبي الفيروسي العاري والتلقيح بالجينوم المغلف يحاكي العدوى الطبيعية.

كما أن إنتاج لقاح فيروس نحل العسل النقي غير الملوث (سلالات الفيروسات من النوع البري أو تلك المشتقة من الحيوانات المستنسخة المعدية) يشكل أيضا تحديات. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى الصعوبات في الحصول على خط خلايا نحل عسل موثوق به ومتكرر باستمرار وخال من الفيروسات لإنتاج فيروسات سلالة نقية29,30. وفي حين تم إنتاج بعض خطوط الخلايا، لا تزال هذه النظم غير كاملة؛ ومع ذلك ، هناك أمل في إمكانية إنتاج خط خلوي قابل للحياة29 ، مما سيسمح بتحكم أدق في إنتاج الفيروس والتحقيق فيه. وإلى أن يصبح هذا الخط متاحا على نطاق واسع، ستستمر معظم بروتوكولات إنتاج الفيروسات في الاعتماد على استخدام 18،31،32،33،34 في إنتاج وتنقية الفيروسات في الجسم الحي. تتضمن هذه الأساليب تحديد وتنقية جزيئات الفيروس ذات الأهمية (أو إنتاج استنساخ معدي) واستخدامها لإصابة نحل العسل ، عادة ما تكون شرانق. يتم حقن الشرانق مع الفيروس المستهدف ثم التضحية بها ، ويتم استخراج المزيد من الجسيمات وتنقيتها. ومع ذلك ، نظرا لعدم خلو النحل من الفيروسات في البداية ، فهناك دائما درجة معينة من التلوث من آثار الفيروسات الأخرى في أي مركز من هذا القبيل ، وبالتالي ، يجب توخي الحذر الشديد في اختيار النحل مع احتمال منخفض للإصابة بالعدوى في الخلفية. علاوة على ذلك ، فإن طرق إزالة الشرانق من خلايا المشط لاستخدامها في هذه البروتوكولات33 كثيفة العمالة للغاية ويمكن أن تحفز الإجهاد في النحل ، مما يحد من الإنتاج بهذه الوسائل 18,32. هنا ، نبلغ عن طريقة بديلة تسمح بإزالة اليرقات على نطاق واسع مع القليل من العمالة والضغط الميكانيكي الأقل على النحل.

بمجرد الحصول على الشرانق وحقنها بلقاح الفيروس المبتدئ ، يجب تحضينها لتوفير وقت الفيروس للتكاثر. في وقت لاحق ، يمكن معالجة جزيئات الفيروس المنتجة في شكل قابل للاستخدام لإصابة النحل التجريبي. هناك العديد من الطرق البسيطة لتحقيق ذلك ، بما في ذلك استخدام متجانس خام 35,36 أو الهيموليمف الناتج عن النحل المصاب بالفيروسات كمصدر للعدوى37. هذه الطرق فعالة ولكنها تواجه فرصة أكبر لإدخال متغيرات غير معروفة من الركيزة الخلفية (على سبيل المثال ، عوامل أخرى في متجانسات النحل الميت). بالإضافة إلى ذلك ، من المستحسن تركيز الجسيمات إذا كانت التجربة تتطلب إعطاء جرعة كبيرة ومعروفة من الفيروس في فترة زمنية قصيرة. لذلك ، من أجل تحكم أفضل ، من الأفضل استخدام طرق تسمح بمستوى معين من تنقية وتركيز جزيئات الفيروس. وعموما، ستؤدي سلسلة من خطوات هطول الأمطار والطرد المركزي إلى إزالة جميع مواد الفيروس غير المستهدفة المحتملة تقريبا33.

بعد إنتاج هذا اللقاح المركز ، من المفيد تحديد كمية العيار الفيروسي (qPCR) وتوصيفه بالفحوصات الحيوية في الجسم الحي لاختبار قدرته على البقاء وقدرته على التسبب في الوفيات ، وكذلك للتأكد من أنه يتم الحصول على عيار الفيروس المتزايد بعد الإصابة. يمكن تحقيق ذلك من خلال تجارب الحقن (إما في الشرانق أو البالغين) أو تجارب التغذية (في اليرقات أو البالغين). في حين أن كل هذه الأساليب ممكنة ، فإن التغذية لمجموعات من النحل البالغ في قفص غالبا ما تكون الأسرع والأبسط. تستخدم طريقة فحص القفص أيضا على نطاق واسع لاختبار مختلف العلاجات الأخرى على النحل بما في ذلك سمية المبيداتالحشرية 38 ، وتطور المبيض39 ، والتأثير الغذائي على السلوك40,41 ، وبالتالي ، يمكن أن تشكل أساسا جيدا للتجارب التي تربط عدوى الفيروس بعوامل أخرى 42.

هنا نصف طريقة موثوقة لإنتاج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس شبه النقية وعالية التخصيب دون استخدام جهاز طرد مركزي فائق التكلفة ، بما في ذلك طريقة لإزالة الشرانق التي تقلل من العمالة والضغط الميكانيكي على النحل واختبار حيوي عالي الإنتاجية قابل للتكرار للغاية لاختبار العدوى الفيروسية وآثارها. من خلال التحكم بإحكام في نقاء اللقاح الفيروسي ، يستطيع الباحثون تقليل التباين في الاستجابة الفيروسية لنحل العسل مقارنة بطرق التلقيح الفيروسي الأخرى. علاوة على ذلك ، يمكن للفحص البيولوجي فحص التأثيرات الفيروسية على مستوى مجموعات صغيرة باستخدام وحدات تجريبية قابلة للتكرار للغاية قبل التوسع إلى إعدادات واقعية ميدانية ، والتي هي أكثر كثافة في العمالة لإدارتها. في تركيبة ، توفر هاتان الطريقتان الأدوات اللازمة للدراسات التي يمكن أن تساعد في تحسين فهمنا العام للتفاعلات الفسيولوجية بين نحل العسل وفيروس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خيار استخراج النحل الجماعي 1: الإزالة الذاتية لليرقات

  1. قفص ملكة نحل العسل على إطار لانغستروث فارغ وممتد وأعادها إلى مستعمرتها. اسمح للملكة بوضع البيض على هذا الإطار لمدة 24 ساعة.
    1. تحقق من الإطار بعد 24 ساعة للتأكد من أن معظم خلايا المشط تحتوي على بيض تم وضعه حديثا. اعتمادا على الملكة والمستعمرة ، لا يتم وضع البيض في بعض الأحيان بشكل جيد للغاية في أول 24 ساعة. إذا حدث هذا ، فاسمح ب 24 ساعة إضافية واضبط الوقت حسب الضرورة.
  2. بعد فترة وضع البيض لمدة 24 ساعة ، أطلق سراح الملكة. ضع علامة على الإطار بوضوح وأعده إلى المستعمرة.
  3. بالضبط 192 ساعة (8 أيام) بعد حبس الملكة (على افتراض وضع البيض الطبيعي خلال أول 24 ساعة ؛ 8 أيام تحدد النقطة قبل الجرو مباشرة) ، قم بإزالة الإطار المميز من المستعمرة. تخلص من جميع النحل البالغ وانقل الإطار إلى حاضنة تتوافق مع الظروف الداخلية للخلية (34 درجة مئوية ورطوبة نسبية 50٪ (RH)).
    1. تحقق للتأكد من أن معظم الإطار مملوء بيرقات instar5th ، والتي يمكن التعرف عليها من خلال أجسامها الكبيرة البيضاء على شكل حرف C المضغوطة بإحكام على الحواف السفلية لخلايا المشط. من المحتمل أيضا أن يكون هناك عدد قليل من الخلايا المغطاة بالفعل بغطاء الشمع ، خاصة بالقرب من وسط الإطار.
  4. قم بإعداد حاويات مطابقة لارتفاع وعرض الإطار المملوء باليرقات لاستقباليرقات النجمة 5 عن طريق تنظيف الأسطح الداخلية والخارجية جيدا بالماء والصابون ، يليه محلول تبييض ، وأخيرا الإيثانول. جفف الحاوية جيدا قبل المتابعة.
    1. خط الجزء السفلي من الحاويات مع عدة طبقات من المناشف الورقية. ثم أضف عدة طبقات متداخلة من مناديل التنظيف الرقيقة والماصة (على سبيل المثال، مساحات المهام الحساسة) أو ورق التصفية. يجب أن تكون المادة ماصة. تجنب تداخل الطبقة العليا لتحسين سهولة نقل اليرقات في المستقبل.
  5. ضع الإطارات متجهة لأسفل (مع توجيه اليرقات البؤرية لأسفل) أعلى الحاويات بحيث يمكن أن تسقط اليرقات على طبقة مناديل التنظيف.
    1. قم بتغطية الحاوية والإطار بقطعة خيمة من رقائق الألومنيوم أو أي غطاء آخر للاحتفاظ بالرطوبة وإعادة الإعداد إلى الحاضنة. اترك الإعداد طوال الليل. ستتسبب الميول الطبيعية للبحث عن الغذاء في اليرقات في زحفها من خلاياها وسقوطها على السطح المبطن أدناه.
  6. قم بإعداد صواني نقل منفصلة عن طريق تنظيفها جيدا باستخدام نفس الخطوات المفصلة في 1.4. اتركي الصواني لتجف وطبقي القيعان بمناديل التنظيف. لا تحتاج الصواني إلى مطابقة أي أبعاد محددة ، ولكن الصواني الضحلة ستسمح بالتلاعب باليرقات بشكل أسهل.
    1. ابدأ في نقل اليرقات من الحاويات إلى الصواني عن طريق رفع المناديل الفردية بعناية من الطبقة العليا في الحاويات وصب اليرقات بلطف على الصواني. يجب أن تكون اليرقات قد سقطت في الحاويات بين عشية وضحاها ، وشكلت عدة كتل لزجة (الشكل 1A).
    2. استخدم ملقط ناعم حاد لفصل اليرقات ووضعها عبر سطح الصواني. لا تحتاج إلى أن تكون متباعدة بالتساوي ويمكن أن تكون قريبة من بعضها البعض ولكن لا ينبغي أن تكون مؤثرة. انظر الشكل 1 باء للحصول على تصوير مرئي لليرقات المنفصلة.
    3. اغتنم هذه الفرصة لإزالة أي يرقات تالفة (متغيرة اللون) أو أقل من متوسط الحجم. هذه هي أكثر عرضة للموت أثناء عملية النضج ويمكن أن تجلب العدوى / نمو الفطريات في جميع أنحاء الدرج.
  7. قم بتغطية الدرج بورق الألومنيوم الخيام للاحتفاظ بالرطوبة وإعادة الإعداد إلى الحاضنة.
  8. تحقق من اليرقات يوميا وقم بإزالة أي منها يتغير لونها (بني داكن أو أسود).
    ملاحظة: سوف تتغوط اليرقات / الشرانق السابقة على مناديل التنظيف ، وتظهر على شكل بقع بنية صغيرة. قد ينتجون أيضا كميات صغيرة من الشريط الأبيض الغامض كجزء من عملية التغطية. لا يتطلب أي من هذين الحدثين استبدال مناديل التنظيف ، طالما أنها ماصة.
  9. السماح لليرقات بالجرو والنضج إلى مرحلة العين البيضاء ، والتي يمكن تحديدها من خلال شكلها العام المطابق لشكل النحلة البالغة بينما لا تزال تفتقر إلى التصبغ في عيونها ومعظم بقية جسمها. يجب أن يحدث هذا بين 14 إلى 15 يوما بعد حبس الملكة. الشرانق جاهزة الآن لحقن الفيروسات. الشكل 1C ، 1D لأمثلة على الشرانق ذات العين البيضاء.

2. خيار استخراج النحل الجماعي 2: استئصال العذراء يدويا

ملاحظة: على الرغم من أن الخيار 2 (استئصال العذراء) هو طريقة قابلة للتطبيق لاستخراج النحل، فإنه يتميز أيضا بالعديد من العيوب عند مقارنته بالخيار 1 (الإزالة الذاتية لليرقات). الخيار 2 هو أكثر كثافة في العمالة ، ويصعب التحكم فيه لعمر العذراء ، وأكثر إرهاقا بشكل عام على النحل نفسه. ويوصى بالخيار 1 كلما أمكن ذلك.

  1. حدد إطارا من حضنة نحل العسل المغطاة التي تحتوي على شرانق في مرحلة العين البيضاء أو بالقرب منها (انظر 1.9 للحصول على وصف) من مستعمرة مناسبة. قم بإزالة الغطاء من خلايا المشط الموجودة بالقرب من مركز وحواف الإطار للتأكد من وجود مرحلة النمو المناسبة.
  2. انقل الإطار إلى حاضنة تم ضبطها على 34 درجة مئوية ورطوبة نسبية 50٪. قم دائما بإعادة الإطار إلى الحاضنة عندما لا يكون قيد الاستخدام الفوري.
  3. قم بإعداد وتنظيف صواني النقل المطابقة لتلك الموضحة في 1.6.
  4. قم بإزالة الإطار من الحاضنة واضبطه على حامل بزاوية أسفل مصدر ضوء. بلل كومة صغيرة من المناشف الورقية بالماء.
  5. نظف زوجا من الملقط الصلب الحاد باستخدام الإيثانول. باستخدام الملقط النظيف ، قم بإزالة الغطاء من الخلايا التي تحتوي على شرانق العين البيضاء ، مع الحرص على عدم إتلاف الشرانق في هذه العملية.
  6. واحدة تلو الأخرى ، قم باستئصال الشرانق بلطف من خلايا المشط. من الأسلم الإمساك بالشرانق حول الصدر والبطن باستخدام أطراف الملقط ، إذا كانت هناك مساحة كافية. ومع ذلك ، إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيمكن أيضا إزالة الشرانق عن طريق الإمساك بالرأس وتذبذبه ببطء بعيدا بما يكفي ليتم الإمساك به حول الجسم.
    1. قم بتغطية أجزاء الإطار التي لا يتم الوصول إليها على الفور بمناشف ورقية مبللة للاحتفاظ بالرطوبة. قم بإزالته واستبداله حسب الضرورة أثناء عملية الختان.
  7. ضع الشرانق المستثناة على طول مناديل التنظيف في صواني النقل ، مع التأكد من عدم لمس أي منها. يجب التخلص من أي شرانق مشوهة أو متغيرة اللون. الشرانق جاهزة الآن لحقن الفيروسات.
    1. تخلص من الشرانق التي تطلق السوائل عند ملامستها للمناديل المبللة ؛ من المحتمل أن تكون قد ثقبت. في بعض الأحيان ، ستظهر الشرانق بقع داكنة صغيرة من الميلانين بالقرب من نقاط الاتصال مع الملقط في غضون 1 ساعة عند الإزالة. هذا لا ينبغي أن يؤثر على البقاء على قيد الحياة. إذا ظهرت بقع كبيرة من الميلانين ، فيجب التخلص من الشرانق المصابة.

3. حقن فيروس العذراء

ملاحظة: في حالة تنفيذ هذا البروتوكول لأول مرة (أي بدون مخزون سابق من التلقيح الفيروسي) ، قم أولا باستخراج الجسيمات وتركيزها باستخدام البالغين أو الشرانق أو اليرقات من مستعمرة يشتبه في إصابتها بالعدوى. قم بقياس العيار الفيروسي في اللقاح الناتج كما هو موضح في الخطوة 5 وحدد الجسيمات التي يجب أن تنتشر أكثر.

  1. تعقيم جميع أسطح العمل باستخدام مياه التبييض والإيثانول قبل البدء في العمل مع فيروسات نحل العسل. يجب ارتداء قفازات النتريل أثناء العملية بأكملها.
  2. إعداد جهاز حاقن قادر على حقن السوائل في ~ 1 ميكرولتر.
    ملاحظة: تتمثل إحدى الطرق غير المكلفة والفعالة في إنشاء جهاز مصنوع يدويا عن طريق توصيل إبرة تحت الجلد بسعة 30 جم بطرف طرف موزع متعدد الموزعات سعة 100 ميكرولتر (انظر جدول المواد) باستخدام الإيبوكسي المرن أو مادة لاصقة سائلة أخرى. تأكد من أن حواف غطاء الإبرة مغلقة بإحكام ضد طرف الموزع المتعدد واسمح للجهاز بالجفاف. انظر الشكل 2 للحصول على تصوير مرئي لمثال جهاز حاقن.
  3. قم بإعداد محلول تخفيف حقن الفيروس عن طريق خلط النوع المطلوب من جزيئات الفيروس مع 1x PBS المعقم (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) في أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 مل. تعتمد الكمية الإجمالية اللازمة على عدد الشرانق التي تحتاج إلى حقن ، حيث تتطلب كل خادرة حقنة 1 ميكرولتر (على سبيل المثال ، 500 شرنقة = 5 ميكرولتر من جزيئات الفيروس + 495 ميكرولتر PBS).
  4. قم بتوصيل جهاز الحاقن بماصة متعددة يدوية واختبر الفعالية عن طريق سحب 100 ميكرولتر من الماء من كوب منفصل وتوزيعه بجرعات 1 ميكرولتر. تأكد من أن كل كمية يتم صرفها متساوية ، وقم بتبديل جهاز الحاقن حسب الضرورة. مسح أي ماء متبقي من الحاقان.
  5. استرجع صواني الشرانق المتولدة في الخطوة 1 أو الخطوة 2 من الحاضنة وقم بإزالة غطاء رقائق الألومنيوم.
  6. نظف زوجا من الملقط الصلب الحاد باستخدام الإيثانول. أمسك الخادرة الفردية بلطف على طول الصدر ، مع تطبيق ضغط كاف فقط لإجبار السوائل الداخلية على البطن. وهذا من شأنه أن يجعل التقسيمات التيرجيت أكثر وضوحا.
  7. ارسم 100 ميكرولتر من محلول جسيمات الفيروس باستخدام الماصة المتعددة ، وأدخل الإبرة بين tergites البطنية الثالثة والرابعة ، وحقن 1 ميكرولتر من محلول الفيروس. كرر لكل خادرة وضعت على الصواني ، مع الحرص على تجنب تكرار الحقن. يجب التخلص من أي شرانق تالفة أثناء العملية.
    تنبيه: يتم تصنيف جميع المواد المتعلقة بتحضير الفيروس على أنها مخاطر بيولوجية ويجب تعقيمها والتخلص منها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. وينبغي أيضا التخلص من الإبر باتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية.
  8. قم بتغطية صواني الشرانق المحقونة بورق الألومنيوم والعودة إلى الحاضنة. اسمح لجزيئات الفيروس بالانتشار داخل الشرانق لمدة 3-5 أيام.
    1. إجراء عمليات تفتيش يومية على الشرانق وإزالة أي عينات ميتة أو متعفنة لمنع تراكم البكتيريا أو الفطريات. قد تظهر نقاط صغيرة من الميلانين في موقع الحقن على البطن ولكن لا ينبغي أن تؤثر على البقاء على قيد الحياة.
  9. قم بأخذ عينات من الشرانق في أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 50 مل ودوامة لتجانس المحتويات، مع الحرص على أخذ عينات من الشرانق إلى أنابيب حسب مصدر المستعمرة لتقليل التلوث من الفيروسات غير المستهدفة. تأكد من عدم بقاء الشرانق الكاملة ونقل الأنابيب إلى ثلاجة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لهطول جسيمات الفيروس وتركيزها.

4. تركيز جسيمات الفيروس

ملاحظة: لم يتم اختبار هذا البروتوكول لاستعادة الفيروسات المغلفة.

  1. تعقيم جميع المواد والحاويات قبل الاستخدام. يجب ارتداء قفازات النتريل ومعاطف المختبر وحماية العين خلال هذه العملية بأكملها. قم بتعقيم جميع أسطح العمل باستخدام مياه التبييض والإيثانول ومحلول تعطيل RNase قبل البدء.
    1. تحضير 1x TES (Tris-EDTA-salt) المخزن المؤقت: امزج 10 mM Tris-HCL pH 7.5 و 2 mM EDTA و 150 mM NaCl. تعقيم عن طريق التعقيم.
  2. إذابة الشرانق المتجانسة ونقلها إلى زجاجات الطرد المركزي. أضف ما يقرب من ثلاثة مجلدات من 1x PBS (على سبيل المثال ، أضف أنبوبا كاملا سعة 50 مل من الشرانق إلى 150 مل من 1x PBS) وقم بمعادلة الأحجام مع تلك الموجودة في الزجاجة الكاملة.
  3. اخلطي أولا باليد ثم ضعيه على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  4. جهاز طرد مركزي عند 15000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوي. كرر هذه الخطوة حسب الحاجة إذا بقي الحطام الخلوي.
    1. إذا كان لدى السوبرناتانت كريات كبيرة من الدهون تطفو على السطح ، فقم بالتصفية من خلال القماش القطني في زجاجات طرد مركزي معقمة منفصلة قبل المتابعة.
  5. استخراج supernatant مع 0.3 كميات من 24: 1 الكلوروفورم: محلول الكحول isoamyl (على سبيل المثال ، 190 مل من supernatant + 57 مل من الكلوروفورم: كحول isoamill) وتخلط عن طريق الانعكاس. جهاز طرد مركزي عند 21000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    تحذير: تجنب الاتصال المباشر مع الكلوروفورم على الجلد أو العينين. دائما ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. وينبغي التخلص من جميع نفايات الكلوروفورم باتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية.
  6. استرجع المرحلة المائية من كل زجاجة عن طريق صب السوبر نات في أكواب معقمة منفصلة سعة 500 مل في حمام ثلجي أو في غرفة باردة 4 درجات مئوية. احرص على تجنب تلويث المادة الفائقة بالكلوروفورم لأنها ستجعل عملية التنقية أكثر صعوبة ؛ من الأفضل أن تفقد القليل من المرحلة المائية.
  7. أضف الماء الخالي من RNase لجعل كل كوب يصل حجمه إلى 200 مل. ضعي الأكواب على ألواح التحريك المغناطيسية واسقطيها في قضيب تحريك متوسط الحجم. اضبط الأطباق على التحريك في إعداد متوسط إلى منخفض.
  8. أضف كلوريد الصوديوم ببطء إلى كل كوب تحت التحريك اللطيف المستمر ، مما يصل إلى تركيز نهائي قدره 2.3٪ (على سبيل المثال ، 4.6 جم كلوريد الصوديوم لكل 200 مل من supernatant). أضف البولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG) إلى كل كوب حتى التركيز النهائي بنسبة 7٪ (على سبيل المثال ، 14 جم PEG لكل 200 مل من supernatant).
  9. قم بتغطية الأكواب بورق الألومنيوم واستمر في التحريك بسرعة متوسطة إلى منخفضة على الجليد أو في غرفة باردة لمدة 1-5 ساعات لإذابة PEG. كلما زاد الوقت المستغرق في التحريك ، كلما ذاب PEG بشكل أكثر شمولا.
  10. أطفئ لوحات التحريك. احتضن الأكواب المغطاة لمدة 1-3 أيام على الجليد أو في غرفة باردة للسماح لجزيئات الفيروس والبروتينات بالترسب. كلما زاد الوقت الذي تقضيه في الحضانة ، زاد عدد الجسيمات التي ستترسب.
  11. انقل محتويات كل كوب إلى زجاجات طرد مركزي نظيفة منفصلة وأجهزة طرد مركزي عند 15000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لاستعادة حبيبات جسيمات PEG. تخلص من السوبرناتانت.
  12. قم بكشط حبيبات جسيمات PEG بعناية من جوانب الزجاجة وأعد تعليقها بأحجام ضئيلة من 1x TES المخزن المؤقت داخل أكواب نظيفة عن طريق إضافة كميات صغيرة من TES ببطء إلى الكريات (حوالي 10 مل لكل 100 نحلة أصلية).
  13. مرر الكرية المعلقة من خلال إبرة 18 G عشر مرات على الأقل قبل الاقتباس في أنابيب طرد مركزي 2 مل. احتفظ بجميع الأنابيب على الجليد حتى تصبح جاهزة ل 4.14.
  14. أنابيب الطرد المركزي سعة 2 مل عند 13000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة PEG إضافي. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي آخر بسعة 2 مل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وكرر خطوة الطرد المركزي لضمان الإزالة الكاملة لجميع وحدات الطرد الثابت.
  15. ركز الجسيمات المتبقية داخل المادة الفائقة في أنابيب طرد مركزي جديدة باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي (قطع 100 كيلو دالتون) عبر عدة جولات من الطرد المركزي عند 14000 × g في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق لكل منها حتى تصل إلى ما يقرب من خمس التركيز الأصلي (10 مل من محلول الجسيمات TES إلى حوالي 2 مل من الجسيمات المركزة). تأتي وحدات الترشيح بأحجام مختلفة. حدد الأنسب لعدد العينات التي تتم معالجتها. عادة ما تكون الوحدات التي تتناسب مع أنابيب مخروطية بحجم 15 مل هي الأنسب.
  16. أعد تعليق الجسيمات المركزة عن طريق المرور عبر إبرة تحت الجلد 26 جم وأجهزة طرد مركزي عند 14000 × g في RT لمدة 5 دقائق لجولة أخيرة واحدة من إزالة PEG. إذا كان السائل لا يزال غائما ، كرر ذلك حتى تتم إزالة كل راسب PEG.
  17. Aliquot supernatant اللزج في الكميات المطلوبة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

5. استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي وتحديده كميا

  1. استخراج الحمض النووي الريبي من النحل الكامل أو جزيئات الفيروسات المركزة باستخدام أي طريقة مناسبة لاستخراج الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، كاشف استخراج الحمض النووي الريبي TRIzol متبوعا بمعالجة DNase).
  2. حدد كميا عيارات الفيروسات في التلقيح المتولد في الخطوة 5.1 عبر RT-qPCR ، ويفضل استخدام طريقة قائمة على المنحنى القياسي لا تعتمد على التعبير الجيني المضيف18 ، على الرغم من أن الطرق الأخرى قد تسمح أيضا بالتقديرات.

6. الفحص الحيوي للتغذية الفيروسية

  1. قم بإعداد جميع المواد اللازمة للفحص الحيوي قبل خطوة جمع الإطار (6.2) أو خلال فترة ظهور النحل على مدار 24 ساعة (6.3).
    1. قم بإعداد أقفاص نظيفة أو حاويات أخرى قادرة على استيعاب عدد النحل اللازم للفحص الحيوي (على سبيل المثال ، أقفاص صندوق أكريليك بقياس 10.16 سم × 10.16 سم × 7.62 سم) عن طريق توصيل جميع ثقوب التغذية بأنبوب طرد مركزي مناسب الحجم (الشكل 3). تحديد العلاجات وتوزيعها عشوائيا بين الأقفاص وتسمية كل منها بالعلاج المخصص لها لتسهيل الرجوع إليها في المستقبل.
    2. تحضير صواني التلقيح عن طريق وضع علامات على قوارب الوزن الفردية متوسطة الحجم مع القفص والعلاج المقابلين.
    3. قم بإعداد محلول التغذية عن طريق خلط الكمية المناسبة من السكروز مع الماء منزوع الأيونات (على سبيل المثال ، 300 غرام من السكروز لكل 1 لتر من الماء لمحلول السكروز بنسبة 30٪) ، مع التأكد من تعقيم الماء قبل وبعد إضافة السكروز. يمكن تخزين محلول السكروز المعقم في ثلاجة 4 درجات مئوية لعدة أسابيع ولكن يجب التخلص منه إذا ظهرت أي غيوم.
    4. قم بإعداد أنابيب التغذية عن طريق ملء أنابيب الطرد المركزي 15 مل جزئيا بمحاليل التغذية المنتجة في 6.1.3 ، وعكسها ، ودس 1-2 ثقوب حول طرف الأنبوب باستخدام إبهام. يمكن أيضا إذابة الثقوب باستخدام إبرة تحت الجلد 18G يتم تسخينها فوق اللهب. تأكد من أن أغطية أنابيب التغذية مشدودة بإحكام شديد لأن الأغطية الفضفاضة يمكن أن تسبب تسربات بطيئة من شأنها أن تغرق سكان الأقفاص بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: يمكن تعديل حلول التغذية وحجم أنبوب التغذية حسب الضرورة لتناسب الاحتياجات التجريبية.
    5. قم بإعداد مجموعة قابلة للاستقبال للنحل الناشئ حديثا عن طريق طلاء حواف حوض كبير بالزيت النباتي أو مادة دهنية مماثلة برفق. بشكل منفصل ، قم بإعداد عدة أكواب صغيرة باستخدام نفس طريقة الطلاء.
  2. حدد وأزل إطارات حضنة نحل العسل على وشك الإكلوسيون مصدرها ثلاث خلايا منفصلة على الأقل. يشبه النحل المسن بشكل مناسب البالغين المصطبغين بالكامل تحت غطاء خلية المشط. من العلامات المؤكدة على استمرار ظهورها ملاحظة سكان الخلايا وهم يمضغون ببطء طريقهم للخروج و / أو الخلايا المفرغة مؤخرا مع علامات مضغ خشنة مميزة على طول غطاء الشمع.
    ملاحظة: تعتمد الكمية الدقيقة للإطارات المطلوبة على حجم التجربة، وكمية الحضنة الناشئة لكل إطار، والوقت من السنة. يحتوي إطار Langstroth العميق القياسي على حوالي 3000 خلية مشط لكل جانب ؛ يمكن لإطار يحتوي على شرانق مغطاة في الغالب ، مع ظهور بعض الأشياء الناشئة التي لوحظت ، أن ينتج بسهولة أكثر من 400 نحلة في 24 ساعة. ضبط طوال الموسم ، حسب الضرورة.
  3. قم بتنظيف جميع النحل البالغ قبل وضع الإطارات في صناديق الظهور ونقلها إلى حاضنة تتوافق مع الظروف الداخلية للخلية (34 درجة مئوية و 50٪ رطوبة نسبية). اسمح للنحل بالظهور لمدة 24 ساعة.
  4. قم بإزالة صناديق الظهور من الحاضنة وفرشاة جميع النحل الذي ظهر حديثا في حوض التجميع. تأكد من إزالة جميع النحل من صناديق الظهور أيضا لمنع إدراج النحل المسن بشكل غير صحيح في أي تفريش لاحق. ظهرت أي نحلة قادرة على الطيران > 24 ساعة ويجب استبعادها من الفحص الحيوي.
  5. إنتاج خليط متجانس من النحل الذي ظهر حديثا عن طريق خلط النحل بلطف في حوض التجميع باليد (لا يمكنهم اللدغة في هذا العمر) لتقليل الآثار الوراثية للخلية من أي مستعمرة فردية. بالنسبة للتطبيقات المحددة ، قد تكون الترتيبات الأخرى لمصدر المستعمرة مرغوبة.
  6. عد 35 نحلة فردية ، وضع كل واحد في نفس الكوب المدهون قبل نقل المحتويات إلى قفص أكريليك. بدلا من ذلك ، قد يكون من الأسهل فصل مضاعفات أصغر من النحل إلى عدة أكواب مدهونة (على سبيل المثال ، 5 أكواب من 7 نحل لكل منها) لتجنب أخطاء سوء العد. يمكن أن يختلف عدد النحل المستخدم بناء على الاحتياجات والتطبيقات.
  7. انقل أقفاص النحل إلى حاضنة (34 درجة مئوية و 50٪ رطوبة نسبية) ، مع التأكد من اتباع ترتيب التنسيب العشوائي الذي تم إنشاؤه في 6.1.1 لتقليل أي آثار محتملة للمناخ المحلي.
  8. قم بإعداد مساحة عمل لعمل الفيروسات عن طريق تنظيف جميع الأسطح والماصات بماء التبييض والإيثانول ومحلول تعطيل RNase قبل البدء. تأكد من ارتداء قفازات النتريل عند التعامل مع جزيئات الفيروس.
  9. تحضير لقاح الفيروس بالتركيز المطلوب عن طريق إذابة كمية مناسبة من جزيئات الفيروس المركزة (الخطوة 4.17) وخلطها جيدا بمحلول السكروز الكافي (الخطوة 6.1.3) في حاوية معقمة. بالنسبة لأقفاص 35 نحلة ، يتطلب كل منها 600 ميكرولتر من اللقاح. يوصى بالتخفيفات التسلسلية إذا كان تركيز الفيروس المطلوب عند أو أقل من 0.1٪.
    1. على سبيل المثال ، ستتطلب تجربة تشمل 40 قفصا تحتاج جميعها إلى تلقيح فيروس بنسبة 1٪ 24 مل من محلول الفيروس ، والذي يمكن إنشاؤه عن طريق الجمع بين 240 ميكرولتر من جزيئات الفيروس المركزة مع 23.76 مل من محلول السكروز. يوصى بتضمين ما يقرب من 15٪ من الزيادة في الحجم الأولي حيث من المتوقع حدوث بعض الخسائر مع السوائل اللزجة.
  10. ضع صواني التلقيح المحضرة في 6.1.2 مرتبة حسب نوع المعالجة وماصة 600 ميكرولتر من اللقاح المناسب على كل صينية.
    1. أدخل صواني التلقيح بعناية في أقفاصها المقابلة ، مع الحرص على عدم إطلاق أي نحل عن طريق الخطأ. اغتنم هذه الفرصة لمسح النحل واستبدال أي شيء قد يكون مات في عملية النقل.
  11. السماح بالاستهلاك الكامل للتلقيح (حوالي 12-14 ساعة) قبل إزالة أنابيب الطرد المركزي التي تسد فتحة التغذية العلوية مع إدخال أنابيب التغذية المناسبة المعدة في 6.1.4. هذا يساعد على ضمان أن النحل في القفص يشارك اللقاح بالتساوي بين السكان. يتم توفير محلول السكروز بشكل مخصص ويجب إعادة ملء الأنابيب حسب الحاجة طوال فترة التجربة.
  12. سجل معدل الوفيات داخل كل قفص على فترات 12 ساعة لأول 72 ساعة من كل تجربة، وبعد ذلك قم بتحويل التسجيل إلى فترات 24 ساعة. قم بإزالة النحل الميت من الأقفاص لزيادة سهولة العد في المستقبل عن طريق تحريك باب القفص لأعلى بما يكفي لزوج من الملقط للوصول إلى النحل الميت وإخراجه. تأكد من تعقيم الملقط فوق مصباح الكحول بين الأقفاص لمنع التلوث الفيروسي المتبادل.
  13. عينة من النحل لقياسات عيار الفيروسية (5.1-5.2) عن طريق اختيار العينات الحية بشكل عشوائي داخل كل قفص ووضعها في أنابيب أجهزة الطرد المركزي على الجليد الجاف. عادة ما تكون ثلاثة نحل كافية لإنتاج قياسات عيار الفيروسات في أي وقت من الأوقات دون إخلاء القفص من السكان.
  14. استمر في قياسات الوفيات المنتظمة طالما كان ذلك ضروريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إن اتباع البروتوكولات بنجاح (الشكل 1) لحقن العذراء والاستخراج الفيروسي يجب أن ينتج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس. ومع ذلك ، فإن أخذ العينات وحقن الشرانق التي يتم الحصول عليها من مجموعة متنوعة من المستعمرات في نقاط زمنية متعددة يزيد من فرص الحصول على الفيروس المستهدف بتلوث منخفض. إن الديناميكيات التي تتكاثر بها الفيروسات وتتفاعل مع بعضها البعض داخل نحلة العسل ليست مفهومة جيدا. إلى جانب احتمال الإصابة بالعدوى الموجودة مسبقا ، ليس هناك ما يضمن أن الفيروس المحقون (المطلوب) سيصبح هو المهيمن في أي خادرة معينة ، حتى لو تم أخذ عينات من الشرانق من نفس المستعمرة الأصلية. يوضح الشكل 4 النطاق المحتمل للنسب الفيروسية التي يمكن للمرء أن يتوقع رؤيتها بعد الاستخراج. تمثل المستعمرات الأربع المعروضة مجموعة فرعية من جهد أكبر لحصاد الفيروسات حيث تم حقن كل خادرة في البداية بلقاح فيروس الشلل الحاد الإسرائيلي (IAPV) بنسبة 95٪ تقريبا. وعلى الرغم من أن 10 من أصل 16 عينة مستعمرة شاركت في عمليات الاستخراج هذه احتوت على نسبة عالية النقاء من التفاعل والتكامل (> 95 في المائة)، بما في ذلك بعض العينات > 99 في المائة (مثل المستعمرة 1)، فإن العينات الأخرى تختلف في نسبتها من المستعمرة (مثل المستعمرة 2-3)، حتى أن بعضها تهيمن عليه فيروسات أخرى مثل فيروس الجناح المشوه (DWV) (مثل المستعمرة 4).

ويقدم الجدول 1 سياقا إضافيا لمستوى تضخيم الفيروسات الأربعة (BQCV، DWV، IAPV، SBV) المبين في الشكل 4 في شكل قيم دورة عتبة RT-QPCR (CT) (النقطة التي يصل عندها هدف تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى عتبة الكشف) ومجموع مكافئات جينوم الفيروس (ge) لكل 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي. يمكن استخدام قيم Ct كمؤشر للنسبة، ولكن يجب حساب قيم ge باستخدام الطريقة17 القائمة على المنحنى القياسي. لاحظ أن الكمية الفعلية للجسيمات (أي ge) المنتجة تعتمد على عدد الشرانق المعالجة وصرامة الترشيح أثناء عملية الاستخراج.

يجب تخزين مستحضرات جسيمات الفيروس (التلقيح المضخم) عند -80 درجة مئوية ويوصى باقتباسها ، لأنها ستتحلل بشكل كبير إذا تعرضت لدورات تجميد وذوبان متعددة18. بالإضافة إلى ذلك ، يجب دائما إجراء اختبارات الاستجابة للجرعة قبل التجريب ، حيث يمكن أن تؤدي العديد من العوامل الخارجية (علم الوراثة الخلوي ، وصحة النحل ، وما إلى ذلك) إلى استجابة فيروسية متغيرة للغاية. باستخدام البيانات المستمدة من الأقفاص التجريبية (الشكل 3) ، يوضح الشكل 5 هذا التباين من خلال مقارنة منحنيات البقاء على قيد الحياة للجرعة والاستجابة لنحل العسل ، الذي يتغذى على نفس جزيئات IAPV خلال عامين مختلفين. على الرغم من معلمات الاختبار المتطابقة ، بما في ذلك نفس اللقاح الفيروسي وتركيزات الاختبار التي تتراوح من 1٪ إلى 0.01٪ IAPV ، فإن التجارب التي أجريت في عامي 2018 (الشكل 5A) و 2019 (الشكل 5B) أنتجت استجابات مختلفة بشكل ملحوظ للبقاء على قيد الحياة في جميع أنواع العلاج باستثناء العلاج الضابط، الذي لم يتلق أي فيروس في تلقيح السكروز. لاحظ أنه ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن أيضا إجراء حسابات LD50 في هذه المرحلة للحصول على قياسات وفيات أكثر دقة43 ، ولكن هذا عادة ما لا يكون ضروريا لأن التقريب يكفي بشكل عام. في عام 2018 ، أدت جرعة 1٪ إلى بقاء ما يقرب من 50٪ على قيد الحياة في 72 ساعة بعد الإصابة (hpi) ، مما يجعلها التركيز الافتراضي لمعظم تجارب الأقفاص الفيروسية التي أجريت في ذلك العام. ومع ذلك ، حققت هذه الجرعة نفسها وفيات قريبة من إجمالي الوفيات في عام 2019 في نفس النقطة الزمنية ، ونتيجة لذلك ، تلقت معظم تجارب الأقفاص الفيروسية التي أجريت في ذلك العام تطعيما بنسبة 0.01٪ IAPV بدلا من ذلك. وصل هذا التركيز المنخفض بشكل كبير إلى نفس مستويات الوفيات مثل لقاح IAPV بنسبة 1٪ في عام 2018 مع استخدام جزيئات فيروس أقل 100 مرة.

تم إنتاج هذه البيانات باستخدام مقايسات حيوية باستخدام أقفاص مماثلة لتلك الموضحة في الشكل 3. تسمح فتحات التغذية في الجزء العلوي والجانبي بسهولة التحكم في النظام الغذائي ويجعل باب القفص المنزلق من السهل إضافة أو إزالة الأشياء من بيئة القفص ، مثل صواني التلقيح أو النحل الميت. ومع ذلك ، فإن بروتوكول الفحص الفيروسي المعمم لا يقتصر على هذه الأنواع من الأقفاص ولا خيارات النظام الغذائي ويجب تعديله ليناسب الاحتياجات التجريبية.

Figure 1
الشكل 1: صور تمثيلية لمراحل مختلفة خلال بروتوكول الإزالة الذاتية لليرقات. (أ) مثال على كتلة اليرقات التي كانت متوقعة بعد فترة الإزالة الذاتية بين عشية وضحاها (1.6). (ب) تتباعد اليرقات عن بعضها البعض على صواني حقن / نمو منفصلة (1.6.3) (C ، D) شرانق بيضاء العين جاهزة للحقن الفيروسي (1.9). البقع البنية هي فراس اليرقات المجففة ، والتي لا تحتاج إلى إزالتها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مثال على جهاز الحاقن الذي تم إنشاؤه عن طريق الجمع بين إبرة تحت الجلد وطرف موزع متعدد. تم ربط الإبرة والطرف باستخدام مادة لاصقة سائلة لتوصيل حقن سائل 1 ميكرولتر باستمرار عند توصيلها بجهاز سحب متكرر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على القفص المستخدم في الفحص الحيوي للفيروس. تم توفير محلول السكروز وحبوب اللقاح على الرغم من ثقوب التغذية خلال فترة التجربة. يمكن توصيل لقاح الفيروس بسهولة باستخدام صينية يتم إدخالها عبر الجزء السفلي من القفص. لاحظ أنه يمكن تعديل نوع القفص ومحتوى وحدة التغذية حسب الضرورة لتناسب المعلمات التجريبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: متوسط إجمالي أحمال الفيروس ونسبه عبر المستحضرات الفيروسية من أربع مستعمرات عينة. تم قياس أحمال الفيروسات بواسطة RT-qPCR كفيروس خلية الملكة السوداء (BQCV) + فيروس الجناح المشوه (DWV) + فيروس الشلل الحاد الإسرائيلي (IAPV) + معادلات جينوم فيروس sacbrood (SBV) (ge) في 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي. تألفت كل مستعمرة عينة من أكثر من 150 شرنقة متجانسة تم حقنها في الأصل باستخدام IAPV وتمثل النطاق النموذجي لنسب الفيروسات الناتجة عن بروتوكول حقن فيروس العذراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: منحنيات البقاء على قيد الحياة استجابة الجرعة لأقفاص الفحص الحيوي لنحل العسل. تم تطعيم الأقفاص من كل من 2018 (A) و 2019 (B) ب IAPV وتم تغذية محلول السكروز بنسبة 30٪ ad libitum طوال مدة التجربة. تمثل العلاجات تركيزات لقاح IAPV مع 10-2 إلى 10-4 تشير إلى 1٪ إلى 0.1٪ من مستحضرات جسيمات IAPV مختلطة في محلول السكروز 30٪ ؛ السيطرة على تلقيح السكروز لا تحتوي على فيروس. n = إجمالي 56 قفصا في عام 2018 ؛ n = إجمالي 77 قفصا في عام 2019. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: متوسط قيم دورة العتبة (Ct) ومعادلات الجينوم لكل 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي من مخاليط الفيروسات في أربعة مستحضرات فيروسية من أربع مستعمرات عينة. تتكون كل مستعمرة عينة من أكثر من 150 شرنقة متجانسة تم إنشاؤها من بروتوكول حقن فيروس العذراء. تم الكشف عن الفيروسات بواسطة RT-qPCR باستخدام مواد تمهيدية محددة لكل فيروس. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد أوجزنا هنا طرقا تفصل كل خطوة من خطوات تضخيم الفيروس وعملية تحضير مخزون التلقيح ، بما في ذلك جمع اليرقات وانتشار الفيروس واستخراجه وتركيزه ، بالإضافة إلى العلاج الفيروسي في شكل تجارب تغذية الأقفاص. وتسمح هذه الطرق بإنتاج جزيئات فيروسية شبه نقية (الشكل 4)، يمكن قياس فعاليتها كميا باستمرار عن طريق اختبار الوفيات الناجمة عن الاستجابة للجرعات بحثا عن الفيروسات القاتلة للبالغين (الشكل 5). بعد تأكيد القدرة المعدية و / أو علم الأمراض ، يمكن بعد ذلك استخدام الجسيمات المتولدة في المقايسات الحيوية لتوضيح التفاعلات بين نحل العسل وفيروسات نحل العسل.

واحدة من الفوائد الأكثر تميزا للبروتوكولات الموصوفة هي أن كل منها يتم تحجيمه بسهولة إلى حجم كبير ، سواء كان ذلك عن طريق حصاد الشرانق أو الجسيمات المنتجة أو إجراء الفحوصات الحيوية. باستخدام طرق استئصال العذراء33 ، يمكن للمرء أن يتوقع إزالة ~ 100 شرنقة في الساعة ، على الرغم من أن هذا الرقم سوف يتوسع بكفاءة. ومع ذلك ، فإن طريقة الإزالة الذاتية لليرقات ، التي تم الإبلاغ عنها هنا ، في حين تتطلب إجراءات تخطيط وجدولة مختلفة ، يمكن أن تولد بسهولة 10-20 ضعف هذا العدد من النحل الذي تمت إزالته بين عشية وضحاها بينما تنطوي على جهد يدوي قليل نسبيا وضغط ميكانيكي أقل على النحل.

القيد الرئيسي لهذه الطريقة هو أنه لا توجد طريقة لضمان أن اليرقات التي تمت إزالتها ذاتيا لم تكن موبوءة سابقا بالفاروا. يمكن أن يقلل العلاج المنتظم للعث ومراقبة خلايا النحل المصدر من هذا الخطر ، ولكن بعض اليرقات لا تزال تعاني من مستوى معين من تطفل الفاروا. ومع ذلك ، فإن إزالة الشرانق يدويا بشكل فردي ، تسمح للمستخدم بمراقبة ما إذا كانت هناك أي عث موجودة في خلية خادرة معينة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن عملية الإزالة الذاتية تعتمد على سلوك البحث عن الطعام لليرقات ، يجب إزالة الإطارات التي تحتوي على هذه اليرقات قبل التغذية النهائية التي تحدث عادة. فقط بسبب هذا النقص في التزويد من قبل العمال ، تزحف اليرقات من خلاياها. لذلك ، فإن الشرانق المشتقة من هذه الطريقة تعاني من نافذة قصيرة جدا من الإجهاد الغذائي مقارنة باليرقات التي تطورت بالكامل داخل مستعمرة ويمكن أن تبدو أصغر قليلا. هذا ملحوظ بشكل خاص في أصغر اليرقات في المجموعة الموجودة على الإطار. نظرا لأن الملكة قد وضعت البيض على نافذة 24 ساعة ، فإن هذه اليرقات تفتقد إلى وقت تغذية أكبر نسبيا. عادة ما تكون هذه ملحوظة بوضوح أثناء الجرو لحجمها الصغير جدا مقارنة بتلك التي تتم إزالتها عن طريق الاستئصال اليدوي. ومع ذلك ، فإن حجم اليرقات الناتجة عن الإزالة الذاتية أكثر من يعوض عن تضاؤل كتلتها الحيوية الفردية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تسبب طريقة الاستئصال اليدوي أيضا ضغطا ميكانيكيا كبيرا على الشرانق أثناء سحبها من خلاياها. إذا كان سيتم استخدام أي من الطريقتين كجزء من تجربة ، وليس فقط لإنتاج جزيئات الفيروس ، فيجب توخي الحذر لضمان الضوابط المناسبة.

بغض النظر عن طريقة الاستخراج ، يمكن لبروتوكول انتشار الفيروس توليد كميات كبيرة من جزيئات الفيروس باستخدام الشرانق ، مما يقلل من التباين الناجم عن طرق تلقيح الفيروسات الأخرى الممارسة حاليا 35،36،37 عند اختبار الاستجابة الفيروسية لنحل العسل. من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول تم تحسينه واختباره باستخدام فيروسات غير مغلفة بترتيب Picornavirales (على سبيل المثال ، فيروس الشلل الحاد الإسرائيلي ، فيروس الجناح المشوه). يجب اتباع استراتيجيات مختلفة لعزل الجسيمات الفيروسية عند العمل مع الفيروسات المغلفة44. وكتقدير تقريبي تقريبي، تم توليد كل عينة من العينات ال 16 المشاركة في جهود حصاد الفيروس (والتي شملت المستعمرات الأربع في الشكل 4) من 200-300 شرانق وأنتجت ما بين 2-2.5 مل من مستحضرات جسيمات الفيروس المركزة. وبافتراض تركيز تطعيم الفيروس بنسبة 0.1٪ وقفص قياسي مكون من 35 نحلا، فإن كل من مستحضرات الفيروس ال 16 ستوفر جزيئات كافية ل 3,300-4,200 قفص. هذا الفائض من المواد المعدية يقلل من القيود التجريبية ويتيح إجراء فحوصات حيوية عالية الإنتاجية. من المهم ملاحظة أنه على الرغم من أن تركيز جسيمات الفيروس يمكن أن يظل قابلا للحياة لعدة أشهر أو سنوات عند تخزينه عند -80 درجة مئوية ، إلا أنه يمكن أن ينخفض ببطء في العدوى ، حتى لو تعرض لعدد قليل من دورات التجميد والذوبان. لذلك ، يوصى بتخزين مخزون المستحضر الفيروسي في أليكوتات صغيرة ، يمكن بعد ذلك استخدام العديد منها لتحديد عيارات الفيروسات والتحقق من جرعة العلاج في وقت التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التباين بين السنوات المبين في الشكل 5 يزيد من تعزيز الحاجة إلى إجراء اختبارات دورية للاستجابة للجرعات، مما يقلل إلى أدنى حد من فرص حدوث خسارة غير متوقعة في صلاحية الفيروس.

كما أن الفحوصات الحيوية للأقفاص نفسها لها قيود ، أو على الأقل المحاذير اللازمة لأخذها في الاعتبار ، وأولها الطبيعة الاصطناعية لبيئة المقايسة الحيوية للقفص (الشكل 3). يسمح تجميع النحل في حاويات بإجراء اختبارات فيروسية تتجاوز المستوى الفردي ؛ يصبح القفص الوحدة التجريبية بدلا من النحلة نفسها. على الرغم من أن هذا يشبه إلى حد كبير مستعمرة فعلية من نحلة واحدة يتم علاجها بمعزل عن بعضها البعض ، إلا أنها لا تزال بعيدة عن بيئة خلية واقعية. بعد إزالتها من البيئة الاجتماعية ، بما في ذلك فيرومونات الملكة والحضنة ، والنحل من مختلف الأعمار ، وغيرها من الإشارات ، قد لا تستجيب هذه النحل كما قد تستجيب مستعمرة كاملة الحجم. هذه هي في المقام الأول اعتبارات للتجارب واسعة النطاق باستخدام نظام القفص ، ومع ذلك. وينبغي في المقام الأول التعامل مع النتائج التي تم جمعها من المقايسات الحيوية الفيروسية في الأقفاص على أنها إنشاء معلومات أساسية يمكن استخدامها لإبلاغ قرارات اختبار الفيروسات في المستقبل التي يتم قياسها إلى إعداد أكثر واقعية ميدانيا حسب رغبة المستخدم.

توفر الطرق الموضحة هنا عملية موحدة للإنتاج الضخم لجزيئات الفيروس لاستخدامها في الفحوصات الفيروسية لنحل العسل. وقد تم بالفعل تنفيذ مثل هذه الاختبارات لدراسة الجوانب المختلفة للتفاعلات بين نحل العسل وفيروسات ، بما في ذلك العدوى متعددة الفيروسات وكيف تؤثر جودة النظام الغذائي والمكملات الغذائية على البقاء على قيد الحياة في مواجهة العدوى الفيروسية11،18،45،46. وقد تم توسيع نطاقها لاستخدامها في تجارب العدوى على مستوى المستعمرة11,47 ولدراسة آثار العدوى على السلوك 47 والتعبير الجيني48. بشكل عام ، توفر هذه الطرق خط أساس في الأدوات التي يمكن استخدامها لإنتاج وتقييم لقاح فيروس نحل العسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتورة جوليا فاين على أفكارها ومناقشتها أثناء عملية إنشاء البروتوكول ، وكذلك الدكتورة كاسوندرا فيرنييه على تعليقاتها المفيدة طوال التحرير. ساهمت هذه المواد في مشاريع دعمتها جزئيا مؤسسة أبحاث الأغذية والزراعة ، بموجب 549025 معرف المنحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol SigmaAldrich C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL Eppendorf 30089405 Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes Fisher Scientific 06-666 Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane MilliporeSigma MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS) SigmaAldrich P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG) SigmaAldrich 1546605
Refrigerated benchtop centrifuge Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette Eppendorf 4982000322 Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away ThermoFisher 7000TS1
RNAse-free water SigmaAldrich W4502
Sucrose
TES SigmaAldrich T1375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
  2. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957 (2015).
  3. Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261 (2014).
  4. Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242 (2017).
  5. Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
  6. Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  7. Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160 (2010).
  8. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  9. Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
  10. Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
  11. Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803 (2019).
  12. Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077 (2019).
  13. Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide - interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566 (2020).
  14. Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998 (2014).
  15. Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221 (2019).
  16. Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
  17. Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656 (2011).
  18. Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265 (2016).
  19. Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
  20. Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
  21. Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401 (2019).
  22. Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
  23. Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639 (2016).
  24. Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
  25. Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502 (2019).
  26. Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
  27. Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274 (2019).
  28. Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742 (2020).
  29. Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
  30. Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831 (2013).
  31. Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
  32. Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429 (2013).
  33. De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
  34. Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445 (2019).
  35. Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357 (2010).
  36. Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499 (2017).
  37. Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
  38. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  39. Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
  40. Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
  41. Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
  42. Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
  43. Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. Bioassays with arthropods. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  44. Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
  45. Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , Master's thesis (2020).
  46. Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O'Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
  47. Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
  48. Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412 (2019).

Tags

علم الأحياء ، العدد 162 ، نحل العسل ، Apis mellifera ، فيروس النحل ، العدوى الفموية ، الفحص الحيوي للقفص ، استخراج الجسيمات الفيروسية
تحضير اللقاح المخصب بالفيروسات للعدوى الفموية لنحل العسل (<em>Apis mellifera</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J.,… More

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J., Dolezal, A. G. Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (162), e61725, doi:10.3791/61725 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter