Summary
卵巣がん幹細胞(OCSC)は、がんの開始、再発、治療抵抗性、および転移の原因です。OCSC血管ニッチは、OCSCの自己複製を促進し、化学療法抵抗性につながると考えられています。このプロトコルは、in vitroで再現可能なOCSC血管ニッチモデルを確立するための基礎を提供します。
Abstract
癌幹細胞(CSC)は支持ニッチに存在し、隣接する間質細胞、血管、および細胞外マトリックスで構成される微小環境を構成します。CSCが内皮の発生に関与する能力は、腫瘍形成および腫瘍転移のメカニズムの一般的な理解に直接寄与する重要な特性を構成する。この研究の目的は、卵巣癌幹細胞(OCSC)の腫瘍開始能力を調べるための再現性のある方法論を確立することです。ここでは、in vitro共培養モデルNICO-1を用いて、内皮細胞とOCSCsの新生血管形成機構と内皮細胞の形態変化を調べました。このプロトコルにより、OCSCを取り巻く新生血管形成ステップを経時的に視覚化できます。この技術は、腫瘍転移におけるOCSCの血管新生特性に関する洞察を提供することができます。
Introduction
卵巣がんは、世界で8番目に多い女性悪性腫瘍であり、年間約30万人の新規診断と推定18万人の死亡があります1。最初の診断では、卵巣がんはしばしば重篤な症状を呈し、患者の約75%がすでにステージIII〜IVにあります。したがって、5年生存率は<30%であり、死亡率は婦人科がんの中で最も高く2、卵巣がんの治療効率は、減量手術の成功、化学療法に対する抵抗性、初期治療後の再発などの臨床的要因に大きく依存しています。
卵巣がん組織は階層的に組織化されており、すべての腫瘍成分が等しく子孫を生成できるわけではありません。自己複製して不均一な腫瘍細胞集団を産生できる唯一の細胞は、癌幹細胞(CSC)を表すと考えられています3。CSCの自己複製および腫瘍開始は、支持ニッチを維持する目的でそれらの腫瘍微小環境を再構築するための血管新生の促進を伴う。しかし、従来のモデルは、複数回継代後のスフェロイドの破壊により、臨床サンプル由来のCSCの培養の再現性が限られていたため、in vitro分析に利用できませんでした。最近では、患者からCSCを培養する実験方法がいくつかの用途のために開発されている4、5、6、7。特に、無血清培地を用いた超低接着プレートでスフェロイドを形成して増殖するCSCの特性を利用して、培養したCSCは、多系列分化能を有する正常な腫瘍細胞では発現しない幹細胞表面マーカーを発現するように誘導される8,9。
最近のデータでは、腹膜での播種として視覚化された休眠中の卵巣(O)CSCの持続が再発腫瘍としての再生に関連していることが示されています10。したがって、OCSCの分子的および生物学的特徴を理解することで、これらの細胞の効果的な標的化と根絶が可能になり、腫瘍の寛解が期待できます。特に、血管新生におけるCSCの役割の細胞的および分子的機構的特徴に関してはほとんど知られていない11。したがって、本プロトコルでは、患者由来のOCSCをin vitro設定で使用し、臨床現場での転移部位のCSCと内皮細胞の腫瘍微小環境を模倣する可能性のある共培養モデルを使用して内皮細胞の血管新生特性を調査しました。最終的に、新生血管形成は腫瘍の成長と転移をサポートするために必要な重要なプロセスを構成するため、そのメカニズムをよりよく理解することで、転移部位のOCSCに対する新しい標的療法の開発が可能になります。
ここでは、CSCsを取り囲む新生血管形成ステップを経時的に可視化するためのプロトコールを提示する。このプロトコルの利点には、3D共培養システムNICO-1を使用して完全に再現可能な調査を可能にし、それによって内皮細胞の血管新生中のOCSC由来の腫瘍開始能力の患者への影響を観察できることが含まれます。
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Protocol
すべての手順は、人間の福祉のための倫理委員会によって承認されたプロトコルの下で実行されました。すべての患者は、サンプルの研究使用について書面によるインフォームドコンセントを提供し、この研究のための組織の収集と使用は、帝京大学のヒトゲノム遺伝子解析研究倫理委員会によって承認されました。
1.レベル2のバイオセーフティキャビネットでの卵巣がんおよび腹水患者からの卵巣がん幹細胞(OCSC)の分離と培養
- 穿刺によって得られたヒト卵巣癌腹水から癌幹細胞を分離する。十分な数の癌幹細胞を採取するために、患者から少なくとも100〜250mLの腹水を採取します。さらに、フローサイトメトリーにより、がん幹細胞マーカー(EpCAM、カルレチニン、CD133、CD44、CD45、ALDH1、Oct4)および卵巣がんマーカー(pAX-8、WT-1)の発現プロファイルを評価します。
- ヒト卵巣癌腹水を300 x g で遠心分離し、腹水吸引後24時間以内に室温で10分間遠心分離します。
- 上清を除去し、2 mLのOCSC培地と8 mLの30%ヒストデンツ/リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)溶液を加えます。
- OCSC培地の準備:ステムプロhESCサプリメント、L-グルタミンを含むDMEM⁄F-12(グルタマックス培地)、25%BSA、100 μM 2-メルカプトエタノール、8 ng/mL FGF塩基性、10 μMインスリン、および20 μM Y-27632。
- ステップ1.1.2で2 mLのOCSC培地を15 mLチューブの細胞溶液に注意深く重ね合わせ、ブレーキをかけずにスイングバケットローターで室温で450 x g で20分間遠心分離します。
- OCSC層(間期に乱されない)をトランスファーピペットで新しい15 mLチューブに慎重に移します。
- 15 mLまでのPBSで充填します。室温で300 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
- 細胞ペレットをOCSC培地に再懸濁し、超低接着培養皿にシードします。培養物は、5%CO2中で37°Cに維持されるべきである。
- 3日ごとに培地を交換してください。培養皿を1分ほど慎重に静置し、上清の一部を捨てて新しい培地を加えます。
- CSCの通過
- OCSCを15 mLチューブに集め、室温で200 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、PBSを充填し、室温で5分間200 x g で遠心分離します。
- 上清を除去し、タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素(AccuMaxなど)からなる細胞剥離溶液1 mLを加え、37°Cで10分間インキュベートします。
- ピペッティングでよく混合し、37°Cで5分間インキュベートします。細胞が単一の懸濁液に入っていることを確認します。
- ピペッティングでよく混合し、PBSで満たし、室温で300 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、その後の超低付着培養皿への播種および5%CO2中で37°Cでの維持のために、細胞ペレットをOCSC培地に再懸濁する。
2. HUEhT-1 内皮細胞培養
- HUEhT-1細胞の継代
- HUEhT-1培養皿から培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄します。
- 1 mLの0.025%トリプシンを加え、室温で3分間インキュベートします。
- 5 mLの内皮細胞増殖培地2を加え、15 mLチューブに細胞を回収し、室温で5分間200 x g で遠心分離します。
- 上清を除去し、細胞ペレットをHUEhT-1培地に再懸濁し、コラーゲンコート培養皿上に細胞を播種し、続いて5%CO2中で37°Cで維持した。
- 3日ごとに培地を交換してください。
3. HUEhT-1細胞を用いたチューブ形成アッセイ用NICO-1共存プレートの作製
- NICO-1を組み立て、細胞外マトリックスベースのヒドロゲル(マトリゲルマトリックス)でコーティングします。
- 製造元の指示に従ってNICO-1の片側を組み立て、氷の上に置いてください。
- NICO-1の表面を300 μLのコールドPBSで覆い、バッファーを除去します。
- 300 μLの冷却した細胞外マトリックスベースのヒドロゲルを加え、37°Cで60分間インキュベートします。
- 平衡化するには、フィルターを100%エタノールに浸し、13 mm ICCPフィルター(0.6 μm)をPBSで1分間洗浄します。
- 本体部品A(右チャンバー)とB(左チャンバー)の両方を含むNICO-1を、Oリングと平衡フィルターとともに組み立てます。
4. HUEhT-1細胞およびCSCのNICO-1システムへの播種
- 細胞単層をトリプシン処理し、2%ウシ胎児血清を含む内皮細胞増殖培地に細胞を再懸濁することにより、HUEhT-1細胞懸濁液を調製します。
- 1.2 mLの細胞懸濁液(1.5 x 105 細胞)を各細胞外マトリックスベースのヒドロゲルコーティングウェルに加えます。
- 5日間培養したOCSC1.5 mLをもう一方のウェルに加えます。
- NICO-1を5%CO2中で37°Cでインキュベートする;チューブ形成は、顕微鏡下で観察することができ、細胞外マトリックスベースのヒドロゲル上のネットワーク形成は、分岐数によって測定される。
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Representative Results
スフェロイドの長期安定培養を行う目的で、手術や穿刺の際に進行卵巣癌患者から得られた腹水を採取した。今回われわれは,CSC1およびCSC2と呼ばれる卵巣CSCの長期スフェロイド培養の症例を提示する.両方の細胞株は、同じ診断および組織学的プロファイルを有する。OCSCを取り巻く内皮細胞の新生血管形成を誘導するために必要な内皮細胞との相互作用の根底にあるOCSCの機構的役割は不明のままです。そこで、転移部位におけるCSC血管ニッチの発生過程を明らかにすることを目指した。内皮細胞(HUEhT-1)とOCSCの相互作用をin vitro共存モデルNICO-1を用いて検討した。 図1 は、CSC1とCSC2によって誘導される管形成活性の比較を示す。形成された血管管の数は、CSC2との共培養において時間とともに劇的に増加した(図2A)。ポジティブコントロールについて、CSC2の共培養なしでVEGF(10 ng / mL)を処理した後のHuEhT-1の血管新生特性を示す 図2B を提示します。現在、その根底にある詳細なメカニズムを明らかにしています。 図 3 NICO-1を用いたOCSCと内皮細胞の共培養モデルの代表的な画像を示す。HUEhT-1細胞をCSC2と20時間共培養し、タイムラプスビデオ画像を撮影した。 図3A は、20時間の共存培養前後のCSC2の表現型を示す。 図3B は、同時に共培養したHUEhT-1細胞を示す。HUEhT-1細胞がCSC2との共培養中に血管管を形成したことは注目に値します (図3C:ビデオクリップ)
図1:OCSCの血管ニッチモデル。 OCSCが内皮細胞の管形成(血管新生)を誘導する機構的役割は不明である。内皮細胞(HUEhT-1)とOCSCの相互作用をin vitro共培養モードNICO-1を用いて検討した。このシステムの右側のコンパートメントは、細胞培地とともにOCSCを保持するインサートで構成されています。左側のコンパートメントは、内皮細胞とHUVECを含むウェルと、右側のウェルと同じ培地で構成されています。
図2:OCSCによって誘発される新生血管形成活動の比較。 時間の経過とともに、形成された血管管の数は、CSC2との共培養で劇的に増加しました。
図3:NICO-1を用いたCSC2との共培養によるHUEhT-1細胞の血管形成。 HUEhT-1細胞はCSC2との共培養中に血管管を形成した。
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Discussion
提示されたプロトコルは、インビトロ設定でOCSCの腫瘍微小環境を模倣する方法を説明しています。本方法の主要構成要素は、間接的なTranswell共培養システムであるNICO-1システムを用いて得られた再現性の高い共存モデルを構成する。現在利用可能な共培養モデルの多くは、共培養細胞集団に対する細胞間直接接触の影響を調べています12、13、14、15、16、17、18。共培養の効果を調べるために使用できる最も単純なモデルは、2つの細胞型の直接混合によって再現することができ、ヘテロタイプおよびホモタイプの相互作用の程度は、各細胞タイプの播種密度および亜集団の相対播種比を変更することによって調べることができる19。しかし、顕微鏡検査によって独立して共存培養の観察された効果に対するOCSCの相対的な寄与を直接決定することは、各細胞が正確に見えないため困難です。したがって、これらの研究は、しばしば条件付き培地実験と並行して伴う。例えば、分離された共存システムは、腫瘍微小環境に対するパラクリンシグナル伝達の効果が注目される研究に利用することができる19。比較すると、本方法では、天然の腫瘍微小環境の構造を模倣した細胞間接触とパラクリンシグナル伝達の影響を同時に評価できるモデルについて説明します。
血管新生は卵巣癌の特徴として機能し、癌細胞、内皮細胞、および周囲の腫瘍微小環境間の相互作用を含むその進行に重要な役割を果たします20。ベバシズマブは、進行卵巣癌の併用化学療法での使用が広く受け入れられている重要な分子標的薬です21。具体的には、ベバシズマブは血管内皮増殖因子(VEGF)に対するモノクローナル抗体を構成する。VEGFは、新生血管形成を促進し、血管透過性を高めることにより、腹膜癌の発症、および進行卵巣癌または腹膜癌における悪性腹水の形成に寄与します22。したがって、VEGF阻害は、転移部位における腹水産生および大量の腫瘍増殖を阻害することが示されている。したがって、腫瘍微小環境レベルでVEGF刺激血管内皮細胞を効果的に標的とするさらなる調査が必要です。しかし、これらの研究にマウスモデルなどの前臨床モデルを効果的に活用することは難しい場合があります。例えば、ヒトVEGFに対するベバシズマブの親和性は高いのに対し、マウスタンパク質の親和性は低いことが報告されている23。これは、マウスモデルを使用して確認された腫瘍微小環境における腫瘍微小環境における新生血管形成に対する抗VEGFメカニズムをさらに調査するために設計された実験内でのベバシズマブの適用に関して制限を強制する。したがって、in vivo腫瘍微小環境の構成要素を再現するには、適切に制御されたアーキテクチャを備えた適切なモデルが必要です。そのような場合、私たちのin vitro共培養モデルシステムは、患者由来のOCSCおよび内皮細胞の培養中の細胞挙動のライブ追跡を可能にし、共培養に応答してこれらの個々の細胞亜集団の研究を可能にすることに注意してください。
OCSCの役割とその血管ニッチをよりよく理解することは、OCSCの治療戦略を開発するための新しい洞察を提供する可能性があります。代表的な実験で示されているように、このモデルの強みは、臨床現場と部分的に一致しているように見える研究プラットフォームを提供し、より的を絞った効果的な新薬の開発とテストを可能にすることです。より多数の患者由来のOCSCを含む結果の直接的な臨床的複製を伴うさらなる研究が必要である。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、文部科学省科学研究費補助金C(K.N.への課題番号19K09834)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
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