Summary
解剖されたインプラントからの細胞の単離とフローサイトメトリーによる特性評価は、インプラントに対する免疫応答のパターンの理解に大きく貢献します。この論文では、解剖したインプラントから細胞を単離し、フローサイトメトリー解析のために染色するための正確な方法について説明します。
Abstract
実験室で培養した組織または医療機器を個人に埋め込むことの成功は、レシピエント宿主の免疫応答の影響を受けます。インプラントを異物と見なすと、敵対的で調節不全の免疫応答はインプラントの拒絶反応につながる可能性がありますが、調節された反応とホメオスタシスの回復はインプラントの受容につながる可能性があります。 in vivo または ex vivo 環境で解剖されたインプラントの微小環境を分析することは、免疫応答のパターンを理解するのに役立ち、最終的には新世代の生体材料の開発に役立ちます。フローサイトメトリーは、細胞表面マーカーに基づいて免疫細胞とそのサブセットを特徴付けるためのよく知られた手法です。このレビューでは、解剖されたインプラント組織から均一な細胞懸濁液を単離するための、手動ダイシング、酵素消化、およびセルストレーナーによるろ過に基づくプロトコルについて説明します。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー染色プロトコルと、フローサイトメトリーによってこれらの単離細胞を特徴付けおよび定量するためのサイトメーターの初期設定の手順について説明しました。
Introduction
医学分野の進歩により、損傷した組織の機能や再成長をサポートするために、埋め込まれた材料が頻繁に使用されるようになりました1,2。これらには、ペースメーカー、再建美容インプラント、骨折固定に使用される整形外科用プレートなどのデバイスが含まれます3,4。しかし、これらのインプラントを製造するために使用される材料とそれらが埋め込まれる場所は、これらのインプラントの成功を決定する上で重要な役割を果たします5,6,7。異物として、これらのインプラントは宿主から免疫応答を引き起こし、拒絶反応または耐性につながる可能性があります8。この要因により、生体材料研究は、移植後に望ましい免疫応答を引き付けることができる材料を生成するように推進されています9,10,11,12。
免疫応答は、損傷した組織または臓器を交換するために実験室で生体材料骨格(足場)の周りに組織または臓器を成長させる再生医療の分野で不可欠な要件です13,14,15,16。再生医療では、細胞、シグナル、足場を使用して欠損または損傷した組織を補うことが目標であり、それぞれが免疫応答によって大きく調節される可能性がある17。さらに、免疫応答の欠如が望まれる場合でも、望まれるのは、調節プロファイルの存在ではなく、免疫活性の欠如であることは非常にまれである18。フローサイトメトリーなどの技術は、インプラントデバイスのコーティングや組織工学のための足場の開発に使用されるさまざまな生体材料に対する免疫応答のパターンを特徴付ける上で重要な役割を果たすことができる19。
この情報は、最終的に、免疫系に十分に耐えられるインプラント用の生体材料の開発や、組織工学において建設的な役割を果たすことができる足場の開発に役立ちます。フローサイトメトリーによる分析用のサンプルを適切に調製することは、蛍光活性化細胞選別による免疫特性評価の不正確な結果を回避するための重要なステップです20,21。したがって、このレビューでは、足場組織からの細胞の単離、細胞懸濁液の染色、およびフローサイトメトリーによる分析に利用できる詳細な方法論を提示します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注: 図1 に、フローサイトメトリープロトコルの概要を示します。
1)試薬調製
- 酵素を希釈し、組織培養用の培地を調製します。
- 5 mLの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を500 mLのRPMI培地に添加し、よく振とうします。さらに使用するまで、培地を4°Cで保管してください。
- 酵素溶液の体積を計算します。
注:酵素溶液の容量は、6ウェルプレートでさいの目に切った組織を消化するために必要な酵素(コラゲナーゼおよびDNase I)を含む培地の容量です。サンプル数によります。- 次の式を使用して、必要な体積を計算します。
(消化するサンプル数) × 5 mL の無血清 RPMI と 10 mM HEPES バッファー
注:例えば、0.1〜0.3gの解剖された脾臓の場合、5 mLの培地を使用して酵素溶液を調製します。この原稿に記載されている酵素消化プロトコルは、主に脳、腎臓、皮膚、肝臓、肺、脾臓、筋肉、および合成材料または細胞外マトリックスタンパク質で作られた皮下インプラントの周りのカプセルを含むマウスから解剖された軟組織(0.1〜1 gの範囲)用です。硬い軟骨組織を消化するには、さまざまな条件と消化酵素の量が必要になる場合がありますが、これは最適化によってのみ確認できます。 - 酵素溶液に必要なコラゲナーゼとDNaseの量を計算します。
注:このプロトコルでは、0.25 mg/mL のコラゲナーゼと 0.2 mg/mL の DNase I を使用しました。コラゲナーゼとDNaseに必要な使用濃度は、組織の種類によって異なる可能性があります19。
- 次の式を使用して、必要な体積を計算します。
- 999 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1 μLの生存率色素( 材料表を参照)を加え、溶液をボルテックスして、1:1000の生存率の色素溶液を調製します。さらに使用するまで、溶液を4°Cの暗所で保管してください。
- 100 mLのPBSに1gのウシ血清アルブミン(BSA)を加えて染色バッファーを調製し、BSAが完全に溶解するまで溶液をボルテックスします。さらに使用するまで、溶液を4°Cで保存してください。
2)酵素消化プレートのセットアップ
- 各ウェルに 70 μm のセルストレーナーを備えた 6 ウェルプレートをセットします。ステップ1.1.1で調製した培地3 mLを各ウェルに加え、氷上でインキュベートします。
- 残りの培地(2 mL/ウェル)を37°Cのインキュベーターまたはウォーターバスに保存し、計算された量のコラゲナーゼとDNase Iを懸濁します(ステップ1.2.2)。
3)細胞の単離
- 解剖したインプラント/組織をプレートに入れ、ハサミを使用して細かくさいの目に切ります。あるいは、組織解離装置またはハンドヘルドホモジナイザーを使用した機械的破壊法を利用します。白血球の数が多いため、脾臓を解剖して、各ランで染色コントロールとして利用します。
注:一部の材料はより高いレベルの線維化を誘発するため、このプロトコルは、線維化度の高い材料と線維化の少ない材料の両方に適用できます。ただし、各処理方法は、染色前に消化後の細胞収量と生存率の両方について評価する必要があります。解剖中の末梢血汚染を避けてください。 - コラゲナーゼとDNase I(ステップ1.2.2で計算した容量)を、37°Cに加温した残りのRPMI(2 mL)に加えます。 各ウェルに2 mLの完全酵素溶液を加えます。
- プレートをインキュベートシェーカーに入れ、37°C、100rpmで45分間加熱します。
注意: プレートを積み重ねるときは、適切な熱伝達を妨げる可能性があるため、注意してください。 - その間、1000μLのチップの端から3〜4mmをハサミで切り刻んで、懸濁液分注チップを準備します。インキュベーション後、ウェル内の懸濁液を上下にピペットで移し、みじん切りチップを使用して完全に混合します。セルストレーナーを50 mLのコニカルチューブの上部に置き、消化した溶液をセルストレーナーに通します。
注:70 μmのセルストレーナーは、アルギン酸塩などの移植された生体材料から細胞を分離するのに十分です。より高い純度が必要な場合は、密度勾配分離などのプロセスを使用して、濃縮された白血球集団を取得します。 - ウェルを1x PBS溶液で洗浄し、すすぎ量をストレーナーに移し、続いてチューブ内の容量が50 mLに達するまで1x PBS溶液でストレーナーの洗浄液を追加します。
注:1x PBSは、消化物の粘度の上昇を防ぎ、遠心分離中に細胞をペレット化できるように、室温で使用する必要があります。 - チューブを室温で300× g で5分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを乱さずに血清ピペットを用いて上清を注意深く吸引します。ペレットを1000 μLの1x PBSに再懸濁し、懸濁液を微量遠心チューブに移します。
- 細胞懸濁液10μLとトリパンブルー10μLを混合し、自動セルカウンターで細胞を計数する計数チャンバースライド、または顕微鏡下で従来の方法で計数する血球計算盤に懸濁液をセットします。あるいは、フローサイトメトリー細胞計数ビーズを使用します。
4) フローサイトメトリーのための染色
- 図 2 に、45 サンプル、蛍光マイナス 1(FMO)コントロール、補正コントロール、および完全に染色された脾臓サンプルコントロールを使用した 14 色実験のプレートレイアウトの例を参照してください。細胞の総数を推定した後、各サンプルについて×1〜106細胞、および各補償およびFMOコントロールについて0.5×106細胞の染色に必要な細胞懸濁液の量を計算します。必要な容量の細胞懸濁液を V 底 96 ウェルプレートのウェルに分注し、1x PBS で容量を 100 μL にします。
注:例として、ステップ3.6で得られた1000μLの細胞懸濁液が40×10 6細胞を含む場合、1×10 6細胞の場合、1000/40 × 106 = 25μLの細胞懸濁液が必要になります。 - プレートを300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引した後、細胞をサンプルウェルおよびコンペンセーションコントロールウェルに再懸濁し、100 μLの1:1000の生存率色素溶液で生存率を測定します( 材料表を参照)。
- 他のコンペンセーションウェル、FMO、未染色ウェルの細胞については、100 μLの1x PBSで再懸濁します。
- 細胞を暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
- その間に、サンプルとFMOコントロールを染色するための表面抗体カクテル(サンプルあたり50 μLまたはFMO)を調製します。抗体カクテルの一例については、 表1 を参照してください。
- インキュベーション後、1x PBS100 μLを各ウェルに加え、300 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。
- 上清を吸引し、200 μLの染色バッファー(1x PBS + 1% BSA)に再懸濁します。300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、50 μL の 1x PBS でコンペンセーションウェル、FMO、および未染色ウェルに細胞を再懸濁します。50 μLの抗体カクテルをそれぞれのサンプルウェルとFMOウェルに加えます。それぞれの抗体を異なる補正ウェルに添加します。
- プレートを暗所で4°Cで45分間インキュベートします。 インキュベーション後、各ウェルに150μLの染色バッファーを加え、細胞懸濁液を300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、200 μLの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 固定せずにサンプルを分析する場合は、200 μLの染色バッファーに再懸濁し、サイトメーターのセットアップとサンプル分析のセクション6に進みます。細胞を固定する場合は、洗浄後に上清を吸引し、4%パラホルムアルデヒドなどの固定液を100μL添加します。細胞内マーカーを染色する場合は、細胞内染色に関するセクション5に進み、細胞を固定して透過処理します( 材料表参照)。細胞を暗所で4°Cで20分間インキュベートします。
注:固定は一部の蛍光色素の蛍光強度に影響を与える可能性があるため、固定の有無にかかわらず各パネルを評価してください。 - インキュベーション後、1x PBSを100 μL添加し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、1x PBSに再懸濁し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー解析の前に4°Cで保存します。
5)細胞内染色
- 細胞内マーカーの固定および透過処理のステップ 4.11 に引き続き、適切なバッファーを 100 μL 添加します。細胞を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄みを吸引し、ペレットを200μLの固定浸透剤溶液に再懸濁する。細胞を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、適切なバッファーで希釈した細胞内抗体でペレットを再懸濁します。
注:抗体の種類と希釈率は、標的細胞によって異なります。例えば、一般的な細胞内マーカーの1つは、制御性T細胞用のフォークヘッドボックスP3であり、これは希釈倍率1:100で頻繁に使用されます。 - 細胞懸濁液を暗所で4°Cで45分間インキュベートします。 インキュベーション後、150 μLの適切な緩衝液を添加し、懸濁液を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁した後、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞を200 μLの染色バッファーに吸引し、再懸濁してフローサイトメトリー解析を行います。
6) サイトメーターとコンペンセーションのセットアップ
- サンプルを泳動する直前に、細胞ベースの補正ではなくビーズベースの補正を利用する場合は、補正ビーズ( 材料表を参照)を調製します。
- 蛍光色素標識抗体ごとに別々の微量遠心チューブを標識し、1x PBS 100 μLに続いて、抗マウスネガティブコントロール補正ビーズを1滴、ポジティブコントロール補償ビーズを1滴ずつ各チューブに加えます。適切な抗体1 μLを別々のチューブにそれぞれ添加します。ボルテックスし、5分間インキュベートしてから取得します。
注:BUV737などの一部の色素はビーズに結合できないため、細胞ベースのコントロールを使用してください。
- 蛍光色素標識抗体ごとに別々の微量遠心チューブを標識し、1x PBS 100 μLに続いて、抗マウスネガティブコントロール補正ビーズを1滴、ポジティブコントロール補償ビーズを1滴ずつ各チューブに加えます。適切な抗体1 μLを別々のチューブにそれぞれ添加します。ボルテックスし、5分間インキュベートしてから取得します。
- 各実験の前に、トラッキングビーズを使用してサイトメーターのセットアップを実行してフローサイトメーターをキャリブレーションし、各実験のフローサイトメーターの設定を維持します。
- サンプルを分析する前に、未染色のサンプルを実行してフローサイトメーターを調整し、側方散乱(SSC)対前方散乱(FSC)プロットで細胞集団を調整し、細胞集団がプロットの中央に収まり、スケールがずれないようにします。
- 染色したサンプルを短時間分析して、FSCとSSCの電圧を調整し、各チャンネルの対数スケールから外れたイベントがないことを確認します。各補正コントロールで 5,000 イベントを記録し、その後、陽性母集団と陰性母集団のゲートが続きます。補正行列を計算してからサンプルを実行し、対象母集団の少なくとも 1,000 個のイベントを収集します。
注:自動補正は過大または過少の補正になりやすいため、大きなカラーパネルでの補正を確認する必要があります。各パラメータを他のすべてのパラメータに対してグラフ化して、過大または過小補正の兆候を監視し、各単色コントロールを評価する必要があります。カラーの大きい実験の複雑な補正は、フローサイトメトリーの経験が豊富な共同研究者またはコア施設の支援を受けて実施する必要があります。スペクトルサイトメーターなどの新しいタイプのフローサイトメーターは、スペクトルアンミキシングと呼ばれるプロセスを通じて蛍光色素のフルスペクトルを利用するため、標準的な補正のみの場合と比較して、蛍光オーバーラップをより明確に区別することができます22。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
免疫解析用のフローサイトメトリーパネルの開発プロセスでは、多くの場合、既存のデータやその分野の文献との結果との比較に依存しています。フローサイトメトリーで集団がどのように現れるかに関する知識は、データを適切に解釈するために重要です。いずれにせよ、集団や細胞の種類は組織によって異なるように見えるため、ある程度のばらつきが予想されます。明確に定義されたコントロール組織の場合、このような染色の最適化は、十分に研究された細胞型を有する既知の組織に対して評価することができる。 図3 は、コントロールマウス組織に対する14色FACSの結果を示しています。この場合、脾臓は、染色されたすべてのマーカーを識別し、染色が技術的に機能的であることを示すために使用されました。この時点から、未知の条件での試験、蛍光色素の選択に自信を持つこと、さまざまな組織源に対するプロトコルの最適化が容易になりました。 図3 はまた、マウス脾臓から単離された異なる細胞型の集団を示す19。
ここでは、Ly6G+好中球などのいくつかの明らかな集団と、異なる単球クラスでの異なるLy6Cの発現レベルが観察されました。CD11chiMHCII+ 樹状細胞は、マクロファージや好中球や単球などの他の骨髄系細胞を除外するためにCD11bに対してゲーティングすると、容易に明らかになりました。CD206+CD86+樹状細胞のサブセットは、このCD11c+集団に着目することで見出すことができる。CD86およびCD206は、よりM1様(CD86hi)とM2様(CD206hi)の分極状態にあるものとして表現型骨髄系細胞に含まれました。F4/80は、さまざまなマクロファージ集団で一般的に観察できる発現の勾配を示しました。Siglec-Fは、F4/80+とF4/80-の2つの集団に存在し、それぞれマクロファージサブセットと好酸球に対応する可能性が最も高い。これらの細胞タイプの指定は可能ですが、異なるマーカーを発現する細胞は、より二元的な分類とは対照的に、機能的な方法で見るべきであることに注意することが重要です。マクロファージと見なされるものは、インプラントの周りの脾臓と異物嚢で異なる可能性があることを認識することが重要であり、結果の潜在的な誤解を回避します。
図1:フローサイトメトリー染色プロトコルの概要。 調製には、目的組織の解剖とそれに続く、1)手動ダイシング、2)酵素消化、3)細胞のひずみと洗浄、4)蛍光タグ付き抗体による染色、それに続くフローサイトメトリー解析が含まれます。イラストはBiorenderで作成しました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:フローサイトメトリー染色のプレートレイアウトの例。 このレイアウトには、サンプル、蛍光マイナス1(FMO)コントロール、代償コントロール、およびコントロール組織サンプル(脾臓)が含まれます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:対照マウス組織での14色FACS染色の代表的な結果。 マウス脾臓細胞の骨髄細胞表現型と、データ表示用のハンドゲーティングおよび自動t確率的近傍埋め込み(t-SNE)クラスタリングアルゴリズムの例。この図は、Sadtler and Elisseeff19から再現されています。略語:FACS = fluorescence-activated cell sorting;SSC = 側方散乱;CD = 分化のクラスター。PE = フィコエリトリン;CCR = C-Cケモカイン受容体タイプ;MHC = 主要組織適合遺伝子複合体;PerCP = ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 試薬/抗体 | サンプルあたりのμL |
| CD86 BUV395 | 0.25 |
| CD45 BUV737 | 0.5 |
| CD8aのBV421 | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| シグレックF BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786型 | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11cパーCP/サイ5.5 | 0.2 |
| CD206 PEの | 0.2 |
| CD197 PE/Dazzle594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7型 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11bのAF700 | 0.25 |
| FCブロック | 1 |
| BDブリリアントステインバッファープラス | 10 |
| PBSの1倍 | 35.975 |
| 総量: | 50 μL |
表1:表面抗体カクテルの例。マウス組織の骨髄性表現型検査のための抗体カクテルの例。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このレビューでは、生体材料インプラントから細胞を単離し、均一な細胞懸濁液を得るための詳細な方法論について述べる。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー用の細胞懸濁液を染色するための詳細なプロトコルと、最適な結果を得るためにフローサイトメーターを構成するための手順が提供されています。細胞単離法には複数のステップがあり、多くの場合、手動の組織解剖とそれに続くタンパク質分解酵素による酵素消化を利用して、組織内の細胞外マトリックスを解離し、細胞間接合部を破壊して個々の細胞を組織から遊離させます。消化後、残った破片を除去し、単一細胞懸濁液を確保するために、細胞の濾しなどのさらなる処理が必要です。高レベルの破片または他の細胞型(腫瘍など)を有するいくつかの試料は、密度分離媒体23の使用を通じて、より徹底的なクリーンアップを必要とする場合がある。適切なサンプルクリーンアップを行わないと、破片や他の細胞集団が目的の集団を覆い隠すため、データが歪む可能性があります。また、過剰な破片は、サイトメーター流路系の全体的または部分的な目詰まりにつながる可能性があります。
免疫細胞の特性評価は、細胞サイトスピン調製物で細胞数の差異を行うことにより、光学顕微鏡などの他の方法でも実行できますが、フローサイトメトリーは、細胞表面マーカーに基づいて細胞のより正確な特性評価を提供します。さらに、フローサイトメトリーデータは、懸濁液中の数百万の細胞を特徴付けて定量することができ、わずか400個の細胞に基づく手動の差分計数よりもはるかに速く、異なる細胞サブセットの正確な推定値を提供できるため、より正確です24。この論文で示した結果は、サイトメーターの構成に応じて、励起スペクトルと発光スペクトル、および理論的な重複を比較するために、複数のオンラインツールを利用して抗体を選択する反復パネル設計に依存しています。大きなカラー実験をデザインする場合は、抗原の存在量、蛍光色素の輝度、スペクトルの重なりを十分に考慮するために、小さなカラーパネルを追加するのではなく、まっさらな状態から始めるのが最善です。
特定の免疫細胞の異なるサブセットを解析する研究では、細胞数が少ないと、細胞の選別や正確な推定値の取得による単離に大きな課題が生じる可能性があるため、フローサイトメトリーを実行するのに十分な数の細胞全体が必要です。この課題は、好中球などの特定の免疫細胞を短期間、限られた洗浄で単離し、濃縮するために磁気ビーズを使用することで克服できます25。肺などの臓器の組織から分離された細胞には、大量の粘液が含まれている可能性があり、細胞懸濁液が「粘着性」になり、フローサイトメトリー中のダブレットイベントの数が増加する可能性があります26,27。2 mMエチレンジアミン四酢酸などのキレート剤を染色バッファーに添加すると、そのようなサンプル中の細胞の凝集を防ぐことができます。
さらに、増加したバッファー液に細胞を懸濁させることで、細胞間相互作用を減少させることで、ダブレットの作製を制限することもできます。染色手順は、異なる組織、染色プロトコル、フローサイトメーター、および抗体パネルごとに徹底的に最適化する必要があります。蛍光色素の中には、固定剤に対してより敏感なものもあれば、細胞の単離やプロセシング方法に敏感なものもあり、多くの細胞タイプでは組織や部位によって挙動が異なります。フローサイトメトリーは、適切な前処理と入念な分析を行うことで、足場や生体材料の免疫微小環境を特徴付けるための詳細な細胞レベルおよびタンパク質レベルの分析を行うことができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究の一部は、国立医用画像・生物工学研究所を含むNIHの学内研究プログラムによって支援されました。 免責事項:NIH、その役員、および従業員は、いかなる会社、製品、またはサービスも推奨または推奨しません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
