Summary
Isolering af celler fra dissekerede implantater og deres karakterisering ved flowcytometri kan bidrage væsentligt til at forstå mønsteret af immunrespons mod implantater. Dette papir beskriver en præcis metode til isolering af celler fra dissekerede implantater og deres farvning til flowcytometrisk analyse.
Abstract
Succesen med at implantere laboratoriedyrket væv eller medicinsk udstyr hos et individ er underlagt modtagerværtens immunrespons. I betragtning af et implantat som fremmedlegeme kan et fjendtligt og dysreguleret immunrespons resultere i afvisning af implantatet, mens et reguleret respons og genvinding af homeostase kan føre til dets accept. Analyse af mikromiljøerne af implantater dissekeret under in vivo eller ex vivo indstillinger kan hjælpe med at forstå mønsteret af immunrespons, som i sidste ende kan hjælpe med at udvikle nye generationer af biomaterialer. Flowcytometri er en velkendt teknik til karakterisering af immunceller og deres undergrupper baseret på deres celleoverflademarkører. Denne gennemgang beskriver en protokol baseret på manuel terning, enzymatisk fordøjelse og filtrering gennem en cellesi til isolering af ensartede cellesuspensioner fra dissekeret implantatvæv. Yderligere er en flerfarvet flowcytometrifarvningsprotokol blevet forklaret sammen med trin til indledende cytometerindstillinger for at karakterisere og kvantificere disse isolerede celler ved flowcytometri.
Introduction
Fremskridt inden for medicin har ført til hyppig brug af implanterede materialer til støtte for funktionen eller genvæksten af beskadiget væv 1,2. Disse omfatter enheder såsom pacemakere, rekonstruktive kosmetiske implantater og ortopædiske plader, der anvendes til knoglefrakturfiksering 3,4. Imidlertid spiller de materialer, der bruges til at fremstille disse implantater, og de steder, hvor de implanteres, vigtige roller i bestemmelsen af succesen med disse implantater 5,6,7. Som fremmedlegemer kan disse implantater generere et immunrespons fra værten, der enten kan føre til afvisning eller tolerance8. Denne faktor har drevet biomaterialeforskning til at generere materialer, der kan tiltrække det ønskede immunrespons efter implantation 9,10,11,12.
Immunresponset er et væsentligt krav inden for regenerativ medicin, hvor et væv eller et organ dyrkes omkring et biomaterialeskelet (stillads) i et laboratorium til udskiftning af et beskadiget væv eller organ13,14,15,16. I regenerativ medicin er målet at erstatte manglende eller beskadiget væv ved brug af celler, signaler og stilladser, som hver især kan moduleres kraftigt af immunresponser17. Selv når der ønskes manglende immunrespons, er det desuden meget sjældent et fravær af immunaktivitet snarere end tilstedeværelsen af en regulatorisk profil, der ønskes18. Teknikker som flowcytometri kan spille en væsentlig rolle i karakteriseringen af mønsteret af immunrespons på forskellige biomaterialer, der anvendes til belægning af implantatanordninger eller til udvikling af stilladser til vævsteknik19.
Disse oplysninger vil igen i sidste ende hjælpe med at udvikle biomaterialer til implantater, der kan tolereres godt af immunsystemet eller udvikle stilladser, der kan spille en konstruktiv rolle i vævsteknik. Korrekt forberedelse af prøver til analyse ved flowcytometri er et vigtigt skridt for at undgå unøjagtige resultater i immunkarakterisering via fluorescensaktiveret cellesortering20,21. Derfor præsenterer denne gennemgang en detaljeret metode, der kan bruges til isolering af celler fra stilladsvæv, farvning af cellesuspensionen og analyse ved flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Figur 1 giver et overblik over flowcytometriprotokollen.
1) Fremstilling af reagens
- Forbered medier til fortynding af enzymer og til vævskultur.
- Tilsæt 5 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsyre (HEPES) bufferopløsning i 500 ml RPMI-medium og ryst godt. Opbevar substratet ved 4 °C indtil yderligere brug.
- Beregn volumenet af enzymopløsningen.
BEMÆRK: Volumenet af enzymopløsningen er volumenet af mediet indeholdende enzymerne (collagenase og DNase I), der vil være nødvendigt for at fordøje ternet væv i 6-brøndplader; Det afhænger af antallet af prøver.- Brug følgende ligning til at beregne det krævede volumen:
(Antal prøver, der skal fordøjes) × 5 ml serumfrit RPMI med 10 mM HEPES-buffer
BEMÆRK: For eksempel til 0,1 til 0,3 g dissekeret milt skal du bruge 5 ml medium til fremstilling af enzymopløsningen. Den enzymatiske fordøjelsesprotokol beskrevet i dette manuskript er primært til blødt væv (fra 0,1 til 1 g) dissekeret fra mus, som omfatter hjerne, nyre, hud, lever, lunger, milt, muskler samt kapsler omkring subkutane implantater lavet af syntetiske materialer eller ekstracellulære matrixproteiner. Fordøjelse af hårdt bruskvæv kan kræve forskellige betingelser og mængder af fordøjelsesenzymer, som kun kan konstateres ved optimering. - Beregn mængden af kollagenase og DNase, jeg havde brug for til enzymopløsningen.
BEMÆRK: I denne protokol blev 0,25 mg/ml kollagenase og 0,2 mg/ml DNase I anvendt. De arbejdskoncentrationer, der kræves for kollagenase og DNase, kan variere for forskellige typer væv19.
- Brug følgende ligning til at beregne det krævede volumen:
- Der fremstilles en 1:1000 levedygtighedsopløsning ved tilsætning af 1 μL levedygtighedsfarvestof (se materialetabel) til 999 μL fosfatbufret saltvand (PBS) og hvirvelopløsningen. Opløsningen opbevares mørkt ved 4 °C indtil yderligere brug.
- Farvebufferen fremstilles ved tilsætning af 1 g bovin serumalbumin (BSA) til 100 ml PBS, og opløsningen hvirvelstrømmes, indtil BSA er helt opløst. Opløsningen opbevares ved 4 °C indtil yderligere brug.
2) Opsætning af enzymatiske nedbrydningsplader
- Opsæt en 6-brønds plade med 70 μm cellefiltre i hver brønd. Der tilsættes 3 ml af det forberedte substrat fra trin 1.1.1 i hvert hul, og der inkuberes på is.
- De resterende medier (2 ml/hul) opbevares i en inkubator eller et vandbad ved 37 °C til suspension af den beregnede mængde kollagenase og DNase I (trin 1.2.2).
3) Isolering af celler
- Placer de dissekerede implantater / væv i plader, og skær det fint i tern med en saks. Alternativt kan du bruge en mekanisk forstyrrelsesmetode ved hjælp af en vævsdissociator eller håndholdt homogenisator. På grund af det store antal leukocytter skal du dissekere milten for at bruge den som farvningskontrol i hvert løb.
BEMÆRK: Da nogle materialer inducerer højere niveauer af fibrose, gælder denne protokol for både stærkt fibrotiske og minimalt fibrotiske materialer. Hver behandlingsmetode bør dog evalueres for både celleudbytte og levedygtighed efter fordøjelse før farvning. Undgå perifer blodforurening under dissektion. - Der tilsættes kollagenase og DNase I (volumen beregnet i trin 1.2.2) til det resterende RPMI (2 ml), der er opvarmet til 37 °C. Der tilsættes 2 ml af den komplette enzymopløsning til hvert hul.
- Pladerne anbringes i en inkuberet ryster i 45 minutter ved 37 °C og 100 o/min.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du stabler plader, da dette kan hæmme korrekt varmeoverførsel. - I mellemtiden klargøres en suspensionsdispenseringsspids ved at hugge 3-4 mm fra enden af en 1000 μL spids med en saks. Efter inkubation pipetteres suspensionen i brøndene op og ned for at blande den grundigt ved hjælp af den hakkede spids. Placer cellesien på toppen af et 50 ml konisk rør og før den fordøjede opløsning gennem cellesilen.
BEMÆRK: 70 μm cellesien er tilstrækkelig til at adskille celler fra implanteret biomateriale, såsom alginat. Hvis større renhed er påkrævet, skal du bruge processer som densitetsgradientseparation for at opnå en beriget population af leukocytter. - Skyl hullerne med 1x PBS-opløsning, og overfør skyllevolumenet gennem silen, efterfulgt af tilsætning af vasken af sien med 1x PBS-opløsning, indtil volumenet i røret når 50 ml.
BEMÆRK: 1x PBS skal være ved stuetemperatur for at forhindre enhver forøgelse af fordøjets viskositet og for at tillade cellepelletering under centrifugering. - Centrifuger glasset ved 300 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugeringen suges supernatanten forsigtigt med en serologisk pipette uden at forstyrre pelletten. Pellet resuspenderes i 1000 μL 1x PBS, og suspensionen overføres til et mikrocentrifugerør.
- Bland 10 μL af cellesuspensionen med 10 μL trypanblåt, og læg suspensionen på tællekammerglas til tælling af celler ved hjælp af en automatisk celletæller eller på et hæmocytometer for at tælle via den konventionelle metode under et mikroskop. Alternativt kan du bruge flowcytometricelletællingsperler.
4) Farvning til flowcytometri
- Se figur 2 for et eksempel på pladelayout for et 14-farvet eksperiment med 45 prøver, fluorescens minus en (FMO) kontrol, kompensationskontrol og en fuldt farvet miltprøvekontrol. Efter estimering af det samlede antal celler beregnes volumenet af den cellesuspension, der kræves til farvning af 1 × 10 6 celler for hver prøve og 0,5 × 106 celler for hver kompensation og FMO-kontrol. Cellesuspensionens nødvendige volumen hældes i hullerne på en 96-brønds V-bundplade, og der fyldes op til 100 μL med 1x PBS.
BEMÆRK: Som et eksempel, hvis 1000 μL cellesuspension opnået i trin 3.6 indeholder 40 × 10 6 celler, kræves 1000/40 × 106 = 25 μL cellesuspension for 1 × 106 = 25 μL cellesuspension. - Pladen centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C, supernatanten suges op, og cellerne i prøvehullerne og i en kompensationskontrolbrønd opslæmmes derefter igen for at bestemme levedygtigheden med 100 μL af en 1:1000-opløsning af levedygtighedsfarvestoffet (se materialetabel).
- For celler i de andre kompensationsbrønde samt FMO og ubejdsede brønde resuspenderes de med 100 μL 1x PBS.
- Cellerne inkuberes mørkt i 30 minutter ved 4 °C.
- I mellemtiden skal du forberede en overfladeantistofcocktail til farvning af prøven og FMO-kontroller: 50 μL pr. prøve eller FMO. Se tabel 1 for et eksempel på antistofcocktailen.
- Efter inkubation tilsættes 100 μl 1x PBS til hvert hul, centrifugeres ned ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges til syn, og der resuspenderes i 200 μl farvningsbuffer (1x PBS + 1% BSA); centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges op, og cellerne i kompensations-, FMO- og ufarvede huller opsuges igen med 50 μL 1x PBS. Der tilsættes 50 μL af antistofcocktailen til de respektive prøvehuller og FMO-huller. Tilsæt de respektive antistoffer til de forskellige kompensationshuller.
- Pladen inkuberes i 45 minutter i mørke ved 4 °C. Efter inkubation tilsættes 150 μL farvningsbuffer i hvert hul, og cellesuspensionen centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges op, cellerne resuspenderes med 200 μl farvningsbuffer, og cellesuspensionen centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis du analyserer prøver uden fiksering, skal du resuspendere dem i 200 μL farvningsbuffer og fortsætte til afsnit 6 om cytometeropsætning og prøveanalyse. Hvis cellerne fikseres, aspireres supernatanten efter vask, og der tilsættes 100 μL fikseringsmiddel, såsom 4% paraformaldehyd. Hvis farvning for intracellulære markører, fortsæt til afsnit 5 om intracellulær farvning og fastgør og permeabiliser cellerne (se materialetabel). Inkuber cellerne i 20 minutter i mørke ved 4 °C.
BEMÆRK: Da fiksering kan påvirke fluorescensintensiteten af nogle fluoroforer, skal du evaluere hvert panel både med og uden fiksering. - Efter inkubation tilsættes 100 μL 1x PBS efterfulgt af centrifugering ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten suges op, resuspenderes i 1x PBS og centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Cellerne opslæmmes igen i 200 μL farvningsbuffer, og de opbevares ved 4 °C før cytometrisk flowanalyse.
5) Intracellulær farvning
- Fortsæt fra trin 4.11 til fiksering og permeabilisering for intracellulære markører, tilføj 100 μL af den passende buffer. Cellerne centrifugeres ved 350 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten suges op, og pellets opslæmmes igen i 200 μl af opløsningen af fikseringsmidletgennemmeabiliserende middel; Cellerne centrifugeres ved 350 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten suges op, og pellets resuspenderes med intracellulære antistoffer fortyndet i den passende buffer.
BEMÆRK: Antistoftyper og fortyndinger afhænger af målcellerne. For eksempel er en almindelig intracellulær markør gaffelhovedboks P3 til regulatoriske T-celler, som ofte anvendes ved en 1:100 fortynding. - Cellesuspensionen inkuberes mørkt i 45 minutter ved 4 °C. Efter inkubation tilsættes 150 μL af den passende buffer, og suspensionen centrifugeres ved 350 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges op, og cellerne opslæmmes igen i 200 μl farvningsbuffer efterfulgt af centrifugering ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Opsug og genopslæm cellerne i 200 μL farvningsbuffer til flowcytometrisk analyse.
6) Opsætning af cytometer og kompensation
- Umiddelbart før prøverne køres, skal du forberede kompensationsperler (se materialetabel), hvis du bruger perlebaseret kompensation i modsætning til cellebaseret kompensation.
- Mærk separate mikrocentrifugerør for hvert fluorkromkonjugeret antistof, og tilsæt 100 μL 1x PBS efterfulgt af en hel dråbe negative kontrolkompensationsperler mod mus og en dråbe positive kontrolkompensationsperler til hvert rør. Der tilsættes 1 μL af det relevante antistof til hvert separat glas. Vortex og inkuber i 5 minutter før erhvervelse.
BEMÆRK: Da nogle farvestoffer, såsom BUV737, ikke kan bindes til perler, skal du bruge en cellebaseret kontrol.
- Mærk separate mikrocentrifugerør for hvert fluorkromkonjugeret antistof, og tilsæt 100 μL 1x PBS efterfulgt af en hel dråbe negative kontrolkompensationsperler mod mus og en dråbe positive kontrolkompensationsperler til hvert rør. Der tilsættes 1 μL af det relevante antistof til hvert separat glas. Vortex og inkuber i 5 minutter før erhvervelse.
- Kalibrer flowcytometeret før hvert eksperiment ved at køre cytometeropsætningen med sporingsperlerne, og vedligehold flowcytometerindstillingerne for hvert eksperiment.
- Før du analyserer prøven, skal du justere flowcytometeret ved at køre en ufarvet prøve for at justere cellepopulationen på et sidescatter (SSC) versus fremadrettet scatter (FSC) plot, så cellepopulationen falder i midten af plottet og ikke er off-scale.
- Kør den farvede prøve kort for at justere spændingerne for FSC og SSC og for hver kanal for at sikre, at ingen hændelser falder uden for den logaritmiske skala for hver kanal. Registrer 5.000 hændelser for hver kompensationskontrol, efterfulgt af gating af positive og negative populationer. Beregn kompensationsmatrixen, og kør derefter prøverne, og saml mindst 1.000 begivenheder for de relevante populationer.
BEMÆRK: Kompensation på større farvepaneler bør verificeres, da automatisk kompensation kan være tilbøjelig til over- eller underkompensation. Hver parameter skal graferes mod alle andre parametre for at overvåge tegn på over- eller underkompensation, og hver enkeltfarvet kontrol skal evalueres. Kompleks kompensation af større farveeksperimenter bør udføres med hjælp fra en samarbejdspartner eller en kernefacilitet med omfattende flowcytometrierfaring. Nyere typer flowcytometre, såsom spektrale cytometre, udnytter det fulde spektrum af en fluorofor gennem en proces kendt som spektral ublanding, hvilket kan give en renere sondring mellem fluorescerende overlapning sammenlignet med standardkompensation alene22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Processen med udvikling af flowcytometripaneler til immunanalyse er ofte afhængig af sammenligning af resultater med eksisterende data og litteraturen på området. Viden om, hvordan populationer kan præsentere i flowcytometri, er afgørende for korrekt fortolkning af data. Uanset hvad kan populationer og celletyper forekomme forskelligt i forskellige væv, så der kan forventes en vis variation. I forbindelse med veldefinerede kontrolvæv kan en sådan farvningsoptimering evalueres mod kendt væv, der har velundersøgte celletyper. Figur 3 viser resultaterne af en 14-farvet FACS på kontrol musevæv. I dette tilfælde blev milten brugt til at identificere alle markører, der var farvet til, og for at vise, at farvningen var teknisk funktionel. Fra dette tidspunkt blev det lettere at teste under ukendte forhold, være sikker på fluoroforvalget og optimere protokollen til forskellige vævskilder. Figur 3 viser også populationer af forskellige celletyper isoleret fra en murin milt19.
Her kunne flere åbenlyse populationer, såsom Ly6G + neutrofiler, og forskellige ekspressionsniveauer af Ly6C på forskellige monocytklasser observeres. CD11chiMHCII + dendritiske celler var let synlige, når de blev lukket mod CD11b for at udelukke makrofager og andre myeloide afstamningsceller såsom neutrofiler og monocytter. En delmængde af CD206+CD86+ dendritiske celler kunne findes ved at fokusere på denne CD11c+ population. CD86 og CD206 blev inkluderet i fænotype myeloide celler som værende i en mere M1-lignende (CD86hi) versus i en mere M2-lignende (CD206hi) polarisationstilstand. F4/80 viste en gradient af udtryk, der almindeligvis kan observeres i forskellige makrofagpopulationer. Siglec-F var til stede i to populationer, F4/80+ og F4/80-, sandsynligvis svarende til henholdsvis en makrofagundergruppe og eosinofiler. Selvom disse betegnelser for celletyper kan foretages, er det vigtigt at bemærke, at celler, der udtrykker forskellige markører, skal ses på en funktionel måde i modsætning til en mere binær klassificering. Anerkendelse af, at det, der betragtes som en makrofag, kan variere i milten og fremmedlegemekapslen omkring et implantat, er vigtigt og undgår den potentielle fejlfortolkning af resultaterne.
Figur 1: Oversigt over flowcytometrifarvningsprotokol. Forberedelse inkluderer dissektion af det interessante væv efterfulgt af 1) manuel terning, 2) enzymatisk fordøjelse, 3) cellebelastning og vask og 4) farvning med fluorescerende mærkede antistoffer efterfulgt af flowcytometrisk analyse. Illustrationen er lavet med Biorender. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel på et pladelayout til flowcytometrifarvning. Dette layout omfatter prøverne, fluorescens minus en (FMO) kontrol, kompensationskontrol og en kontrolvævsprøve (milt). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater fra 14-farve FACS-farvning på kontrolmusevæv. Myeloid cellefænotypning af murin miltceller med eksempler på hånd-gating og automatiseret t-stokastisk nabo-indlejring (t-SNE) klyngealgoritme til datavisning. Denne figur er gengivet fra Sadtler og Elisseeff19. Forkortelser: FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; SSC = sidespredning; CD = klynge af differentiering; PE = phycoerythrin; CCR = C-C kemokinreceptortype; MHC = større histokompatibilitetskompleks; PerCP = peridinin klorofylproteinkompleks. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens/antistof | μL pr. prøve |
| CD86 BUV395 | 0.25 |
| CD45 BUV737 | 0.5 |
| CD8a BV421 | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| Siglec F BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786 | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | 0.2 |
| CD206 PE | 0.2 |
| CD197 PE/Blændende594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11b AF700 | 0.25 |
| Fc blok | 1 |
| BD Brilliant Plet Buffer Plus | 10 |
| 1x PBS | 35.975 |
| Samlet volumen: | 50 μL |
Tabel 1: Eksempel på overfladeantistofcocktail. Et eksempel antistof cocktail til myeloid fænotypning af musevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne gennemgang beskriver en detaljeret metode til isolering af celler fra biomaterialeimplantater for at opnå en ensartet cellesuspension. Derudover er der tilvejebragt en detaljeret protokol til farvning af cellesuspensionen til flerfarvet flowcytometri sammen med trinene til konfiguration af et flowcytometer for optimale resultater. Celleisoleringsmetoder kan involvere flere trin, ofte ved hjælp af manuel vævsdissektion efterfulgt af enzymatisk fordøjelse med proteolytiske enzymer for at dissociere den ekstracellulære matrix i vævet og forstyrre celle-celle-krydsene for at frigøre individuelle celler fra vævet. Efter fordøjelsen er yderligere behandling, såsom cellebelastning, nødvendig for at fjerne resterende affald og sikre en enkeltcellesuspension. Nogle prøver, der har høje niveauer af snavs eller andre celletyper (såsom tumorer) kan kræve mere grundig oprydning ved brug af densitetsseparationsmedier23. Uden ordentlig prøveoprydning kan data være skæve på grund af affald eller andre cellepopulationer, der skjuler populationerne af interesse. Overskydende affald kan også føre til hel eller delvis tilstopning af cytometerfluidikken.
Mens karakteriseringen af immunceller også kan udføres ved andre metoder, såsom lysmikroskopi, ved at udføre et differentielt celletal på et cellecytospinpræparat, giver flowcytometri en mere nøjagtig karakterisering af cellerne baseret på celleoverflademarkører. Derudover er flowcytometridata mere præcise, da de kan karakterisere og kvantificere millioner af celler i suspension og kan give nøjagtige estimater af forskellige celleundergrupper meget hurtigere end manuel differentialtælling baseret på kun 400 celler24. Resultaterne vist i dette papir er afhængige af et iterativt paneldesign med antistofvalg udført ved brug af flere onlineværktøjer til at sammenligne excitations- og emissionsspektre og teoretisk overlapning afhængigt af cytometerkonfigurationen. Når du designer større farveeksperimenter, er det bedst at starte fra en ren skifer i modsætning til tilføjelsen til et mindre farvepanel for fuldt ud at overveje antigenoverflod, fluoroforlysstyrke og spektral overlapning.
Undersøgelser, der analyserer forskellige undergrupper af specifikke immunceller, kræver tilstrækkeligt antal samlede celler til at udføre flowcytometri, da det at have et mindre antal celler kan udgøre en betydelig udfordring i deres isolering ved cellesortering eller opnåelse af nøjagtige estimater. Denne udfordring kan overvindes ved at bruge magnetiske perler til isolering og berigelse af specifikke immunceller, såsom neutrofiler, i kortere perioder og med begrænset vask25. Isolerede celler fra væv i organer såsom lunger kan indeholde betydelige mængder slim, hvilket kan gøre cellesuspensionen "klæbrig" og resultere i et øget antal dublethændelser under flowcytometri26,27. Tilsætning af chelateringsmidler såsom 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre til farvningsbufferen kan forhindre aggregering af celler i sådanne prøver.
Derudover kan suspension af celler i et øget buffervolumen også begrænse dobbeltdannelse ved at reducere celle-celle-interaktioner. Farvningsprocedurer skal optimeres grundigt for hvert andet væv, farvningsprotokol, flowcytometer og antistofpanel. Nogle fluoroforer kan være mere følsomme over for fikseringsmidler, nogle celletyper er mere følsomme over for forskellige celleisolerings- og behandlingsmetoder, og mange celletyper opfører sig forskelligt i forskellige væv og forskellige steder. Med korrekt forberedelse og flittig analyse kan flowcytometri give en detaljeret cellulær og proteinniveauanalyse for at karakterisere stilladset og biomaterialets immunmikromiljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af NIH's intramurale forskningsprogram, herunder National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Ansvarsfraskrivelse: NIH, dets officerer og medarbejdere anbefaler eller godkender ikke noget firma, produkt eller service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
