Summary
Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.
Abstract
Der Erfolg der Implantation von im Labor gezüchtetem Gewebe oder eines medizinischen Geräts in eine Person hängt von der Immunantwort des Empfängerwirts ab. Betrachtet man ein Implantat als Fremdkörper, kann eine feindliche und dysregulierte Immunantwort zur Abstoßung des Implantats führen, während eine regulierte Reaktion und Wiedererlangung der Homöostase zu seiner Akzeptanz führen kann. Die Analyse der Mikroumgebungen von Implantaten, die unter In-vivo- oder Ex-vivo-Bedingungen präpariert werden, kann dazu beitragen, das Muster der Immunantwort zu verstehen, was letztendlich zur Entwicklung neuer Generationen von Biomaterialien beitragen kann. Die Durchflusszytometrie ist eine bekannte Technik zur Charakterisierung von Immunzellen und ihren Untergruppen anhand ihrer Zelloberflächenmarker. Diese Übersichtsarbeit beschreibt ein Protokoll, das auf manuellem Würfeln, enzymatischem Aufschluss und Filtration durch ein Zellsieb zur Isolierung einheitlicher Zellsuspensionen aus präpariertem Implantatgewebe basiert. Des Weiteren wurde ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Färbeprotokoll erläutert, zusammen mit Schritten für anfängliche Zytometereinstellungen, um diese isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie zu charakterisieren und zu quantifizieren.
Introduction
Fortschritte auf dem Gebiet der Medizin haben dazu geführt, dass häufig implantierte Materialien zur Unterstützung der Funktion oder des Nachwachsens von geschädigtem Gewebe verwendet werden 1,2. Dazu gehören Geräte wie Herzschrittmacher, rekonstruktive kosmetische Implantate und orthopädische Platten, die zur Fixierung von Knochenbrüchen verwendet werden 3,4. Die Materialien, die zur Herstellung dieser Implantate verwendet werden, und die Stellen, an denen sie implantiert werden, spielen jedoch eine wichtige Rolle für den Erfolg dieser Implantate 5,6,7. Als Fremdkörper können diese Implantate eine Immunantwort des Wirts hervorrufen, die entweder zu einer Abstoßung oder zu einer Toleranz führen kann8. Dieser Faktor hat die Biomaterialforschung vorangetrieben, um Materialien zu entwickeln, die nach der Implantation die gewünschte Immunantwort hervorrufenkönnen 9,10,11,12.
Die Immunantwort ist eine wesentliche Voraussetzung im Bereich der regenerativen Medizin, bei der ein Gewebe oder ein Organ in einem Labor um ein Biomaterialskelett (Gerüst) herum gezüchtet wird, um ein beschädigtes Gewebe oder Organ zu ersetzen13,14,15,16. In der regenerativen Medizin besteht das Ziel darin, fehlendes oder beschädigtes Gewebe durch den Einsatz von Zellen, Signalen und Gerüsten zu ersetzen, von denen jedes durch Immunantworten stark moduliert werden kann17. Selbst wenn eine fehlende Immunantwort erwünscht ist, ist es sehr selten eine Abwesenheit von Immunaktivität und nicht das Vorhandensein eines regulatorischen Profils, das erwünscht ist18. Techniken wie die Durchflusszytometrie können eine wichtige Rolle bei der Charakterisierung des Musters der Immunantwort auf verschiedene Biomaterialien spielen, die für die Beschichtung von Implantaten oder für die Entwicklung von Gerüsten für das Tissue Engineering verwendet werden19.
Diese Informationen wiederum werden letztendlich dazu beitragen, Biomaterialien für Implantate zu entwickeln, die vom Immunsystem gut vertragen werden können, oder Gerüste zu entwickeln, die eine konstruktive Rolle beim Tissue Engineering spielen können. Die richtige Vorbereitung der Proben für die Analyse mittels Durchflusszytometrie ist ein wichtiger Schritt, um ungenaue Ergebnisse bei der Immuncharakterisierung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu vermeiden20,21. Daher wird in dieser Übersichtsarbeit eine detaillierte Methodik vorgestellt, die für die Isolierung von Zellen aus Gerüstgewebe, die Färbung der Zellsuspension und die Analyse mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.
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Protocol
HINWEIS: Abbildung 1 gibt einen Überblick über das Durchflusszytometrieprotokoll.
1) Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie Medien für die Verdünnung von Enzymen und für die Gewebekultur vor.
- 5 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-Pufferlösung in 500 ml RPMI-Medium geben und gut schütteln. Lagern Sie das Medium bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
- Berechnen Sie das Volumen der Enzymlösung.
ANMERKUNG: Das Volumen der Enzymlösung ist das Volumen des Mediums, das die Enzyme (Kollagenase und DNase I) enthält, die benötigt werden, um gewürfeltes Gewebe in 6-Well-Platten zu verdauen; Das hängt von der Anzahl der Proben ab.- Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das erforderliche Volumen zu berechnen:
(Anzahl der zu verdauenden Proben) × 5 ml serumfreies RPMI mit 10 mM HEPES-Puffer
HINWEIS: Verwenden Sie beispielsweise für 0,1 bis 0,3 g präparierte Milz 5 ml Medium, um die Enzymlösung herzustellen. Das in diesem Manuskript beschriebene enzymatische Verdauungsprotokoll ist in erster Linie für Weichgewebe (im Bereich von 0,1 bis 1 g) von Mäusen bestimmt, die das Gehirn, die Niere, die Haut, die Leber, die Lunge, die Milz, die Muskeln sowie Kapseln um subkutane Implantate aus synthetischen Materialien oder extrazellulären Matrixproteinen umfassen. Die Verdauung von hartem Knorpelgewebe kann unterschiedliche Bedingungen und Volumina von Verdauungsenzymen erfordern, die nur durch Optimierung festgestellt werden können. - Berechnen Sie die Menge an Kollagenase und DNase, die ich für die Enzymlösung benötigte.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 0,25 mg/ml Kollagenase und 0,2 mg/ml DNase I verwendet. Die für Kollagenase und DNase erforderlichen Arbeitskonzentrationen können für verschiedene Gewebetypen variieren19.
- Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das erforderliche Volumen zu berechnen:
- Bereiten Sie eine Viabilitätsfarbstofflösung im Verhältnis 1:1000 vor, indem Sie 1 μl des Viabilitätsfarbstoffs (siehe Materialtabelle) zu 999 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) geben und die Lösung vortexen. Lagern Sie die Lösung bis zur weiteren Verwendung im Dunkeln bei 4 °C.
- Bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 100 ml PBS geben und die Lösung aufwirbeln, bis BSA vollständig aufgelöst ist. Lagern Sie die Lösung bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
2) Aufstellen von enzymatischen Aufschlussplatten
- Richten Sie eine 6-Well-Platte mit 70-μm-Zellfiltern in jeder Vertiefung ein. In jede Vertiefung werden 3 ml des vorbereiteten Mediums aus Schritt 1.1.1 gegeben und auf Eis inkubiert.
- Das verbleibende Medium (2 ml/Well) wird in einem Inkubator oder Wasserbad bei 37 °C gelagert, um die berechnete Menge an Kollagenase und DNase I zu suspendieren (Schritt 1.2.2).
3) Isolierung von Zellen
- Legen Sie die präparierten Implantate/Gewebe in Platten und würfeln Sie sie mit einer Schere fein. Alternativ können Sie auch eine mechanische Aufschlussmethode mit einem Gewebedissoziator oder einem tragbaren Homogenisator anwenden. Aufgrund der hohen Anzahl von Leukozyten sollte die Milz präpariert werden, um sie bei jedem Durchlauf als Färbekontrolle zu verwenden.
HINWEIS: Da einige Materialien ein höheres Maß an Fibrose induzieren, ist dieses Protokoll sowohl für hochfibrotische als auch für minimal fibrotische Materialien anwendbar. Jede Verarbeitungsmethode sollte jedoch vor der Färbung sowohl auf die Zellausbeute als auch auf die Lebensfähigkeit nach dem Verdau geprüft werden. Vermeiden Sie eine Kontamination des peripheren Blutes während der Dissektion. - Kollagenase und DNase I (Volumen berechnet in Schritt 1.2.2) werden zu dem verbleibenden RPMI (2 ml) gegeben, das auf 37 °C erwärmt wurde. Geben Sie 2 ml der vollständigen Enzymlösung in jede Vertiefung.
- Die Platten für 45 min bei 37 °C und 100 U/min in einen inkubierten Shaker legen.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Stapeln von Platten, da dies die ordnungsgemäße Wärmeübertragung behindern kann. - Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Suspensionsdosierspitze vor, indem Sie mit einer Schere 3-4 mm vom Ende einer 1000-μl-Spitze abschneiden. Nach der Inkubation pipettieren Sie die Suspension in den Vertiefungen auf und ab, um sie mit der gehackten Spitze gründlich zu mischen. Stellen Sie das Zellsieb auf ein konisches 50-ml-Röhrchen und lassen Sie die aufgeschlossene Lösung durch das Zellsieb laufen.
HINWEIS: Das 70-μm-Zellsieb reicht aus, um Zellen von implantiertem Biomaterial, wie z. B. Alginat, zu trennen. Wenn eine höhere Reinheit erforderlich ist, verwenden Sie Verfahren wie die Dichtegradiententrennung, um eine angereicherte Population von Leukozyten zu erhalten. - Spülen Sie die Vertiefungen mit 1x PBS-Lösung und übertragen Sie das Spülvolumen durch das Sieb, gefolgt von der Zugabe der Waschmittel des Siebs mit 1x PBS-Lösung, bis das Volumen im Röhrchen 50 ml erreicht.
HINWEIS: Das 1x PBS muss Raumtemperatur haben, um eine Erhöhung der Viskosität des Aufschlusses zu verhindern und die Zellpelletierung während der Zentrifugation zu ermöglichen. - Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig mit einer serologischen Pipette abgesaugt, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 1000 μl 1x PBS und überführen Sie die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
- Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau und laden Sie die Suspension auf Objektträger der Zählkammer, um Zellen mit einem automatischen Zellzähler zu zählen, oder auf ein Hämozytometer, um sie mit der herkömmlichen Methode unter einem Mikroskop zu zählen. Alternativ können Sie Durchflusszytometrie-Zellzählkügelchen verwenden.
4) Färbung für die Durchflusszytometrie
- Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für ein Plattenlayout für ein 14-Farben-Experiment mit 45 Proben, Fluoreszenz-min-eins (FMO)-Kontrollen, Kompensationskontrollen und einer vollständig gefärbten Milzprobenkontrolle. Nach der Schätzung der Gesamtzahl der Zellen ist das Volumen der Zellsuspension zu berechnen, das für die Färbung von 1 ×10 6 Zellen für jede Probe und 0,5 × 106 Zellen für jede Kompensations- und FMO-Kontrolle erforderlich ist. Geben Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit V-Boden und füllen Sie das Volumen mit 1x PBS auf 100 μl auf.
ANMERKUNG: Wenn beispielsweise 1000 μl Zellsuspension, die in Schritt 3.6 erhalten werden, 40 × 10 6 Zellen enthalten, dann sind für 1 × 106 Zellen 1000/40 × 106 = 25 μl Zellsuspension erforderlich. - Die Platte wird bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und dann die Zellen in den Probenvertiefungen und in einer Kompensationskontrollvertiefung resuspendiert, um die Viabilität mit 100 μl einer 1:1000-Lösung des Viabilitätsfarbstoffs zu bestimmen (siehe Materialtabelle).
- Resuspendieren Sie Zellen in den anderen Kompensationsvertiefungen sowie FMO- und ungefärbten Vertiefungen mit 100 μl 1x PBS.
- Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln für 30 min bei 4 °C.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen Oberflächen-Antikörper-Cocktail für die Färbung der Probe und der FMO-Kontrollen vor: 50 μl pro Probe oder FMO. In Tabelle 1 finden Sie ein Beispiel für den Antikörper-Cocktail.
- Nach der Inkubation 100 μl 1x PBS in jede Vertiefung geben, bei 300 × g 5 min bei 4 °C herunterschleudern.
- Den Überstand absaugen und in 200 μl Färbepuffer (1x PBS + 1% BSA) resuspendieren; bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in den Kompensations-, FMO- und ungefärbten Vertiefungen mit 50 μl 1x PBS. Geben Sie 50 μl des Antikörpercocktails in die jeweiligen Probenvertiefungen und FMO-Vertiefungen. Geben Sie die jeweiligen Antikörper in die verschiedenen Kompensationsvertiefungen.
- Die Platte 45 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren. Nach der Inkubation werden 150 μl Färbepuffer in jede Vertiefung gegeben und die Zellsuspension bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Der Überstand wird abgesaugt, die Zellen mit 200 μl Färbepuffer resuspendiert und die Zellsuspension bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Wenn Sie Proben ohne Fixierung analysieren, resuspendieren Sie sie in 200 μl Färbepuffer und fahren Sie mit Abschnitt 6 über die Einrichtung des Zytometers und die Probenanalyse fort. Wenn Sie die Zellen fixieren, saugen Sie den Überstand nach dem Waschen an und fügen Sie 100 μl eines Fixiermittels, z. B. 4 % Paraformaldehyd, hinzu. Wenn Sie intrazelluläre Marker färben, fahren Sie mit Abschnitt 5 über intrazelluläre Färbung fort und fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen (siehe Materialtabelle). Die Zellen werden 20 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C inkubiert.
HINWEIS: Da die Fixierung die Fluoreszenzintensität einiger Fluorophore beeinflussen kann, sollten Sie jedes Panel sowohl mit als auch ohne Fixierung bewerten. - Nach der Inkubation werden 100 μl 1x PBS zugegeben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 °C. Den Überstand absaugen, in 1x PBS resuspendieren und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Färbepuffer und lagern Sie sie bei 4 °C vor der durchflusszytometrischen Analyse.
5) Intrazelluläre Färbung
- Fahren Sie mit Schritt 4.11 zur Fixierung und Permeabilisierung für intrazelluläre Marker fort und fügen Sie 100 μl des entsprechenden Puffers hinzu. Die Zellen werden bei 350 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Pellets werden in 200 μl der Fixiermittelpermeabilisierungsmittellösung resuspendiert. Die Zellen werden bei 350 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Pellets mit intrazellulären Antikörpern, die im entsprechenden Puffer verdünnt sind.
HINWEIS: Antikörpertypen und Verdünnungen hängen von den Zielzellen ab. Ein gängiger intrazellulärer Marker ist beispielsweise die Gabelkopfbox P3 für regulatorische T-Zellen, die häufig in einer Verdünnung von 1:100 verwendet wird. - Die Zellsuspension wird im Dunkeln für 45 min bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation werden 150 μl des entsprechenden Puffers zugegeben und die Suspension bei 350 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen werden in 200 μl Färbepuffer resuspendiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Die Zellen werden in 200 μl Färbepuff für die durchflusszytometrische Analyse abgesaugt und resuspendiert.
6) Zytometer und Kompensationsaufbau
- Unmittelbar vor dem Ausführen der Proben sind die Kompensationsperlen vorzubereiten (siehe Materialtabelle), wenn die perlenbasierte Kompensation im Gegensatz zur zellbasierten Kompensation verwendet wird.
- Beschriften Sie separate Mikrozentrifugenröhrchen für jeden fluorochrom-konjugierten Antikörper und geben Sie 100 μl 1x PBS, gefolgt von einem vollen Tropfen Anti-Maus-Negativkontroll-Kompensationsperlen und einem Tropfen Positivkontroll-Kompensationskügelchen in jedes Röhrchen. Geben Sie 1 μl des entsprechenden Antikörpers in jedes einzelne Röhrchen. Vortex und 5 Minuten vor der Akquisition inkubieren.
HINWEIS: Da einige Farbstoffe, wie z. B. BUV737, nicht an Kügelchen gebunden werden können, verwenden Sie eine zellbasierte Kontrolle.
- Beschriften Sie separate Mikrozentrifugenröhrchen für jeden fluorochrom-konjugierten Antikörper und geben Sie 100 μl 1x PBS, gefolgt von einem vollen Tropfen Anti-Maus-Negativkontroll-Kompensationsperlen und einem Tropfen Positivkontroll-Kompensationskügelchen in jedes Röhrchen. Geben Sie 1 μl des entsprechenden Antikörpers in jedes einzelne Röhrchen. Vortex und 5 Minuten vor der Akquisition inkubieren.
- Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer vor jedem Experiment, indem Sie den Zytometeraufbau mit den Tracking-Perlen ausführen, und behalten Sie die Durchflusszytometereinstellungen für jedes Experiment bei.
- Bevor Sie die Probe analysieren, stellen Sie das Durchflusszytometer ein, indem Sie eine ungefärbte Probe ausführen, um die Zellpopulation in einem Diagramm der Seitenstreuung (SSC) im Vergleich zur Vorwärtsstreuung (FSC) so anzupassen, dass die Zellpopulation in die Mitte des Diagramms fällt und nicht außerhalb der Skala liegt.
- Lassen Sie die gefärbte Probe kurz laufen, um die Spannungen für FSC und SSC anzupassen und für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass keine Ereignisse außerhalb der logarithmischen Skala jedes Kanals liegen. Erfassen Sie 5.000 Ereignisse für jede Kompensationskontrolle, gefolgt von einem Gating positiver und negativer Populationen. Berechnen Sie die Kompensationsmatrix, und führen Sie dann die Stichproben aus, wobei mindestens 1.000 Ereignisse für die interessierenden Grundgesamtheiten erfasst werden.
HINWEIS: Die Kompensation bei Panels mit größeren Farben sollte überprüft werden, da die automatische Kompensation zu Über- oder Unterkompensation führen kann. Jeder Parameter sollte mit jedem anderen Parameter verglichen werden, um Anzeichen einer Über- oder Unterkompensation zu überwachen, und jedes einfarbige Steuerelement sollte ausgewertet werden. Die komplexe Kompensation von Experimenten mit größeren Farben sollte mit Hilfe eines Mitarbeiters oder einer Core Facility mit umfassender Erfahrung in der Durchflusszytometrie durchgeführt werden. Neuere Arten von Durchflusszytometern, wie z. B. Spektralzytometer, nutzen das gesamte Spektrum eines Fluorophors durch einen Prozess, der als spektrale Entmischung bekannt ist, was zu einer saubereren Unterscheidung der Fluoreszenzüberlappung im Vergleich zur Standardkompensation allein führen kann22.
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Representative Results
Der Prozess der Entwicklung von Durchflusszytometrie-Panels für die Immunanalyse beruht häufig auf dem Vergleich der Ergebnisse mit vorhandenen Daten und der Literatur auf diesem Gebiet. Das Wissen darüber, wie sich Populationen in der Durchflusszytometrie präsentieren können, ist entscheidend für die richtige Interpretation von Daten. Unabhängig davon können Populationen und Zelltypen in verschiedenen Geweben unterschiedlich aussehen, so dass eine gewisse Variabilität zu erwarten ist. Im Zusammenhang mit gut definierten Kontrollgeweben kann eine solche Färbeoptimierung gegen bekanntes Gewebe mit gut erforschten Zelltypen evaluiert werden. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse eines 14-Farben-FACS an Kontroll-Mausgewebe. In diesem Fall wurde die Milz verwendet, um alle Marker zu identifizieren, auf die gefärbt wurde, und um zu zeigen, dass die Färbung technisch funktionsfähig war. Von diesem Zeitpunkt an wurde es einfacher, unter unbekannten Bedingungen zu testen, sich auf die Fluorophorauswahl zu verlassen und das Protokoll für verschiedene Gewebequellen zu optimieren. Abbildung 3 zeigt auch Populationen verschiedener Zelltypen, die aus einer murinen Milz isoliert wurden19.
Hier konnten mehrere offensichtliche Populationen, wie z.B. Ly6G+ Neutrophile, und unterschiedliche Expressionsniveaus von Ly6C auf verschiedenen Monozytenklassen beobachtet werden. CD11chiMHCII+ dendritische Zellen waren leicht erkennbar, wenn sie gegen CD11b gerichtet wurden, um Makrophagen und andere myeloische Zellen wie Neutrophile und Monozyten auszuschließen. Eine Untergruppe von CD206+CD86+ dendritischen Zellen konnte gefunden werden, indem man sich auf diese CD11c+ Population konzentrierte. CD86 und CD206 wurden in den Phänotyp myeloischer Zellen eingeschlossen, da sie sich in einem eher M1-ähnlichen (CD86hi) Polarisationszustand im Vergleich zu einem eher M2-ähnlichen (CD206hi) Polarisationszustand befanden. F4/80 zeigte einen Expressionsgradienten, der häufig in verschiedenen Makrophagenpopulationen beobachtet werden kann. Siglec-F war in zwei Populationen, F4/80+ und F4/80-, vorhanden, was höchstwahrscheinlich einer Makrophagen-Untergruppe bzw. Eosinophilen entspricht. Obwohl diese Bezeichnungen von Zelltypen vorgenommen werden können, ist es wichtig zu beachten, dass Zellen, die unterschiedliche Marker exprimieren, auf funktionelle Weise und nicht auf eine eher binäre Klassifizierung betrachtet werden sollten. Die Erkenntnis, dass das, was als Makrophage gilt, sich in der Milz und der Fremdkörperkapsel um ein Implantat unterscheiden kann, ist wichtig und vermeidet die mögliche Fehlinterpretation von Ergebnissen.
Abbildung 1: Überblick über das Färbeprotokoll der Durchflusszytometrie. Die Vorbereitung umfasst die Sektion des interessierenden Gewebes, gefolgt von 1) manuellem Würfeln, 2) enzymatischer Verdauung, 3) Abseihen und Waschen der Zellen und 4) Färbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse. Die Illustration wurde mit Biorender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiel für ein Plattenlayout für die Durchflusszytometrie-Färbung. Dieses Layout umfasst die Proben, Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO), Kompensationskontrollen und eine Kontrollgewebeprobe (Milz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der 14-Farben-FACS-Färbung an Kontrollmausgewebe. Myeloische Zellphänotypisierung von murinen Milzzellen mit Beispielen für Hand-Gating und automatisierten t-stochastic neighbor-embedding (t-SNE) Clustering-Algorithmus für die Datenanzeige. Diese Figur wurde von Sadtler und Elisseeff19 reproduziert. Abkürzungen: FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; SSC = seitliche Streuung; CD = Cluster der Differenzierung; PE = Phycoerythrin; CCR = C-C-Chemokinrezeptor-Typ; MHC = Haupthistokompatibilitätskomplex; PerCP = Peridinin-Chlorophyll-Protein-Komplex. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz/Antikörper | μl pro Probe |
| CD86 BUV395-KARTON | 0.25 |
| CD45 BUV737-KARTON | 0.5 |
| CD8a BV421-KARTON | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| Siglec F BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786-KARTON | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | 0.2 |
| CD206 PE | 0.2 |
| CD197 PE/Dazzle594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11b AF700 | 0.25 |
| Fc-Block | 1 |
| BD Brilliant Fleckenpuffer Plus | 10 |
| 1x PBS | 35.975 |
| Gesamtvolumen: | 50 μl |
Tabelle 1: Beispiel für einen Oberflächen-Antikörper-Cocktail. Ein Beispiel für einen Antikörper-Cocktail zur myeloischen Phänotypisierung von Mausgewebe.
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Discussion
Diese Übersichtsarbeit beschreibt eine detaillierte Methodik zur Isolierung von Zellen aus Biomaterialimplantaten, um eine einheitliche Zellsuspension zu erhalten. Darüber hinaus wurde ein detailliertes Protokoll für die Färbung der Zellsuspension für die Mehrfarben-Durchflusszytometrie sowie die Schritte zur Konfiguration eines Durchflusszytometers für optimale Ergebnisse bereitgestellt. Zellisolierungsmethoden können mehrere Schritte umfassen, wobei häufig eine manuelle Gewebedissektion gefolgt von einem enzymatischen Verdau mit proteolytischen Enzymen verwendet wird, um die extrazelluläre Matrix im Gewebe zu dissoziieren und die Zell-Zell-Verbindungen zu unterbrechen, um einzelne Zellen aus dem Gewebe zu befreien. Nach der Verdauung ist eine weitere Verarbeitung, wie z. B. das Abseihen der Zellen, erforderlich, um verbleibende Ablagerungen zu entfernen und eine einzellige Suspension zu gewährleisten. Einige Proben, die einen hohen Gehalt an Ablagerungen oder anderen Zelltypen (z. B. Tumore) aufweisen, erfordern möglicherweise eine gründlichere Reinigung durch die Verwendung von Dichtetrennmedien23. Ohne eine ordnungsgemäße Probenbereinigung können die Daten aufgrund von Ablagerungen oder anderen Zellpopulationen, die die interessierenden Populationen verdecken, verzerrt sein. Überschüssige Ablagerungen können auch zu einer vollständigen oder teilweisen Verstopfung der Zytometerfluidik führen.
Während die Charakterisierung von Immunzellen auch mit anderen Methoden, wie z. B. der Lichtmikroskopie, durchgeführt werden kann, indem eine differentielle Zellzählung an einem Zellzytospinpräparat durchgeführt wird, bietet die Durchflusszytometrie eine genauere Charakterisierung der Zellen auf der Grundlage von Zelloberflächenmarkern. Darüber hinaus sind Durchflusszytometriedaten präziser, da sie Millionen von Zellen in Suspension charakterisieren und quantifizieren können und viel schneller genaue Schätzungen verschiedener Zelluntergruppen liefern können als die manuelle Differenzzählung auf der Grundlage von nur 400 Zellen24. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse beruhen auf einem iterativen Paneldesign mit Antikörperauswahl, die durch die Verwendung mehrerer Online-Tools zum Vergleich der Anregungs- und Emissionsspektren und der theoretischen Überlappung in Abhängigkeit von der Zytometerkonfiguration erfolgt. Bei der Planung größerer Farbexperimente ist es am besten, bei Null anzufangen, anstatt ein kleineres Farbfeld hinzuzufügen, um die Antigenhäufigkeit, die Fluorophorhelligkeit und die spektrale Überlappung vollständig zu berücksichtigen.
Studien, die unterschiedliche Untergruppen spezifischer Immunzellen analysieren, erfordern eine ausreichende Anzahl von Gesamtzellen, um eine Durchflusszytometrie durchzuführen, da eine geringere Anzahl von Zellen eine erhebliche Herausforderung bei ihrer Isolierung durch Zellsortierung oder genaue Schätzungen darstellen kann. Diese Herausforderung kann überwunden werden, indem magnetische Kügelchen zur Isolierung und Anreicherung spezifischer Immunzellen, wie z. B. Neutrophile, in kürzeren Zeiträumen und mit begrenztem Waschen verwendetwerden 25. Isolierte Zellen aus Geweben von Organen wie der Lunge können erhebliche Mengen an Schleim enthalten, was die Zellsuspension "klebrig" machen und zu einer erhöhten Anzahl von Dublettenereignissen während der Durchflusszytometrie führen kann26,27. Die Zugabe von Chelatbildnern wie 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure zum Färbepuffer kann die Aggregation von Zellen in solchen Proben verhindern.
Darüber hinaus kann das Suspendieren von Zellen in einem größeren Puffervolumen auch die Dublettenbildung einschränken, indem die Zell-Zell-Interaktionen reduziert werden. Die Färbeverfahren sollten für jedes Gewebe, Färbeprotokoll, Durchflusszytometer und Antikörperpanel gründlich optimiert werden. Einige Fluorophore können empfindlicher auf Fixiermittel reagieren, einige Zelltypen reagieren empfindlicher auf unterschiedliche Zellisolierungs- und Verarbeitungsmethoden, und viele Zelltypen verhalten sich in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Stellen unterschiedlich. Bei richtiger Vorbereitung und sorgfältiger Analyse kann die Durchflusszytometrie eine detaillierte Analyse auf Zell- und Proteinebene liefern, um das Gerüst und die Immunmikroumgebung des Biomaterials zu charakterisieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde teilweise durch das Intramurale Forschungsprogramm der NIH unterstützt, einschließlich des National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Haftungsausschluss: Die NIH, ihre leitenden Angestellten und Mitarbeiter empfehlen oder befürworten keine Unternehmen, Produkte oder Dienstleistungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
