Summary
نماذج حيوانية مختلفة من الفتق الحجابي الخلقي والانسداد القصبي الجنيني تقدم مزايا وعيوب فيما يتعلق بالقضايا الأخلاقية والتكلفة والصعوبة الجراحية والحجم ومعدلات البقاء على قيد الحياة وتوافر الأدوات الوراثية. يوفر هذا النموذج أداة جديدة لدراسة تأثير كل من انسداد القصبة الهوائية وزيادة الضغط الإنارة على نمو الرئة.
Abstract
الانسداد القصبي الجنيني (TO)، وهو طريقة علاج راسخة، يعزز نمو الرئة الجنينية والبقاء على قيد الحياة في الفتق الحجابي الخلقي الحاد (CDH). بعد TO، الاحتفاظ بالسوائل الظهارية المفرزة يزيد من الضغط الإنعباسي ويحفز نمو الرئة. وقد تم تعريف نماذج حيوانية مختلفة لفهم الفيزيولوجيا المرضية للCDH و TO. ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة مثل صعوبة هذه التقنية، وحجم الحيوان، والتكلفة، وارتفاع معدلات الوفيات، وتوافر الأدوات الوراثية. هنا، يتم وصف نموذج عبر الرحم رواية من مورين الجنين TO. تم تخدير الفئران الحامل، وتعرض الرحم عن طريق استئصال البطن في منتصف الخط. تم ربط القصبة الهوائية للأجنة المختارة بخياطة واحدة عبر الرحم وضعت خلف القصبة الهوائية ، وشريان السباتي واحد ، وعروق وداجي واحد. وأغلق السد وسمح له بالتعافي. تم جمع الأجنة قبل الالتهام مباشرة. كانت نسبة وزن الرئة إلى الجسم في الأجنة إلى الأجنة أعلى من تلك الموجودة في الأجنة المسيطرة. يوفر هذا النموذج للباحثين أداة جديدة لدراسة تأثير كل من TO وزيادة الضغط الإنارة على نمو الرئة.
Introduction
يحدث الفتق الحجابي الخلقي (CDH) في 1:2500 حالة حمل وينتج عنه نقص التنسج الرئوي وارتفاع ضغط الدم الرئوي الوليدي1و2و3و4و5و6. انسداد القصبة الهوائية الجنيني (TO) هو علاج سابق للولادة في مرضى CDH الشديدين الذين يشملون تنظير الجنين في الأسبوع الحملي 26-30 الذي يتم فيه وضع بالون فوق كارينا مباشرة ثم إزالته في الأسبوع الحمليالثاني والثلاثين. هذا مؤقت للحث على نمو الرئة الجنين ويحسن البقاء على قيد الحياة. متلازمة انسداد مجرى الهواء العالي الخلقية هي حالة قاتلة مرتبطة بتضخم الرئة ، والتي ألهمت الجراحين لإجراء انسداد اصطناعي للرغامى لتعزيز الاحتفاظ بالسوائل الظهارية المفرزة. هذا الانسداد زيادة الضغط الإنارة ونمو الرئة المستحث7. ومع ذلك ، ينبغي عكس انسداد لتمكين نضوج الخلايا الظهارية.
وقد وضعت نماذج حيوانية مختلفة من CDH و TO - ovine، أرنب، الجرذ، والفأر - لفهم الفيزيولوجيا المرضية من CDH و TO. ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة مثل صعوبة هذه التقنية، وحجم الحيوان، والتكلفة، وارتفاع معدلات الوفيات، وتوافر الأدوات الوراثية. على الرغم من أن التقنية الجراحية المستخدمة لنموذج ovine تشبه إلى حد كبير تلك المستخدمة في البشر ويمكن عكسها ، فإن العيوب الرئيسية لهذا النموذج هي حساب الحيوان ، وفترة الحمل الطويلة ، والعدد المحدود من العمليات الجراحية الممكنة. نموذج الأرنب لديه فترة حمل أقصر وأقل تكلفة من نموذج الأغنام. ومع ذلك ، فإن نموذج الأرنب لا رجعة فيه8،9. نموذج مورين لديه أقل تكلفة، أكبر عدد من الأجنة لكل حمل، الجينوم الأكثر اتصفا، والأدوات المتاحة على نطاق واسع للتحليلات الخلوية والجزيئية. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي هو عدم إمكانية عكس TO، مما يمنع الفهم الكامل لتأثير TO. هنا ، يتم تقديم طريقة تجمع بين جميع مزايا النماذج المذكورة سابقا وتخلق نموذجا سهلا ، يمكن عكسه ، والحد الأدنى من غزو القوارض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد امتثلت جميع التجارب لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبرات (منشورات المعاهد القومية للصحة رقم 80023، المنقحة لعام 1978). تمت الموافقة على الإجراء مع بروتوكول IACUC #2016-0068 من قبل مؤسسة سينسيناتي لأبحاث الأطفال اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. إعداد
- لتزاوج الفئران البرية المتطابقة مع العمر C57BL/6 ، ضعها في نفس القفص في الساعة 6:00 مساء .m وفصلها في الساعة 9:00 صباحا .m في اليوم التالي.
- لتحديد اليوم الجنيني 0 (E0)، انظر إلى المكونات المهبلية، التي تحتوي على منطقة خارجية متجانسة متصلة بجدار المهبل ومنطقة داخلية ليفية وتشمل بعض الحيوانات المنوية التي تشكل كتلا متشابكة مختلطة مع ألياف المواد المكونات.
- سجل وزن الفئران في وقت التزاوج.
- إعادة وزن الفئران على E10 لضمان الحمل المستمر.
- إجراء الجراحة على E16.5 (المرحلة القناة المبكرة).
- تعقيم الأدوات التي سيتم استخدامها أثناء الجراحة: مقص، حامل إبرة، ملقط، المشابك، والسكاكين الجراحية ومقابض.
- قبل تسخين منصة الجراحة إلى 24 درجة مئوية وإعداد المالحة الدافئة (24 درجة مئوية) قبل الجراحة.
- خلق بيئة دافئة للتعافي، وترك الطعام الرطب داخل القفص للتغذية المبكرة.
- البقاء مع الحيوانات التي تعمل حتى يتمكنوا من إطعام أنفسهم.
- الحفاظ على الفئران التي تعمل وحدها في أقفاص الفردية بعد الجراحة.
2. التخدير
- تطبيق تحت الجلد 0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين إلى السدود الحوامل 1 ساعة قبل الإجراء.
- استخدام استنشاق 5 مل / ساعة من ايزوفلوران للتحريض و 2 مل / ساعة بشكل مستمر خلال عملية التخدير.
- مراقبة تحركات ذقن الفئران الحامل.
3. استئصال البطن
- تنظيف سطح البطن مع الكحول واليود بوفيدوني. الحفاظ على الظروف العقيمة طوال العملية.
- إجراء شق عمودي لاستئصال البطن من السدود الحوامل. قطع جميع الطبقات بشكل منفصل.
- تحديد قرون الرحم على كل جانب.
- تحديد الأجنة المرشحة للجراحة.
ملاحظة: لا تعمل على الأجنة الأقرب إلى المهبل. - تعمل على جنينين في كل قرن الرحم إذا كان هناك عدد زوجي من الأجنة على كل جانب (4 معظم الوقت)، وعلى 1 الجنين في كل قرن الرحم إذا كان هناك عدد فردي من الرحم (3 معظم الوقت).
4. انسداد القصبة الهوائية
- استخدام نظارات التكبير 2.5x للتصور.
- وضع القرن الرحم بطريقة عرضية.
- تأخذ الجراء، التي تواجه صعودا، بين إصبعين باستخدام عيون الجراء والذيل كدليل لوضع الجنين.
- تطبيق ضغط لطيف على رأس الجرو للسماح تمديد الرأس، وبالتالي، تصور الرقبة.
- استخدام خياطة البولي بروبلين 6.0 مع إبرة atraumatic لأداء TO (الشكل 1). إبقاء المشيمة على الجانب وبعيدا عن نقاط الدخول والخروج من الإبرة.
- أدخل الإبرة بشكل عرضي عبر جانب الرحم بعيدا عن المشيمة عبر الجزءالأمامي من الرقبة.
- تحريك الإبرة بلطف حتى خط الوسط من الرقبة وتوجيهها إلى الجزء الأمامي، ثم الخروج من الرقبة بين القصبة الهوائية ومقابل غمد السباتي والرحم.
- عقدة خياطة، مع الحرص على الحفاظ على سلامة الأغشية وجدار الرحم، والحفاظ على الحبل السري آمنة أثناء عقدة.
الشكل 1: انسداد القصبة الهوائية. (أ) خياطة عبر الرحم تمر عبر الرقبة. (ب)التمثيل التخطيطي للهياكل بعد خياطة يمر عبر وقبل عقدة. المختصرات: C = الشريان السباتي. J = الوريد الوداجي; T = القصبة الهوائية; E = المريء; V = فقرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. إغلاق جدار البطن
- استبدل قرن الرحم في البطن.
- حقن 2 مل من المالحة المعقمة الدافئة في تجويف الصفاق قبل الإغلاق.
- وضع خياطة البوليجلاتين قيد التشغيل 5/0 لإغلاق جدار البطن، وإغلاق الجلد مع خياطة الحرير غير الجارية.
- تطبيق 0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين intraperitoneally لمسكنات، والسماح لانتعاش السد في حاضنة دافئة.
6. الحصاد
- تطبيق التخدير على السد الحوامل، وحصاد جميع الأجنة في E18.5 عن طريق القسم القيصري.
- تحقق من صلاحية الأجنة من خلال مشاهدة تحركات الأجنة.
- استخدام ما لا يقل عن تقنيتين مختلفتين للقتل الرحيم: الاختناق ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم.
- إزالة الجثث وفقا لتنظيم المختبر البيطري.
- وزن جميع الأجنة.
- إجراء شق عمودي على الصدر لاستئصال الصدر لإزالة الرئتين.
- تشريح الرئتين من الأجنة، ووزنها لحساب إجمالي نسبة الوزن الرئة إلى الجسم (LBWR = (وزن الرئة اليسرى + وزن الرئة الأيمن)/وزن الجسم x100).
7. الأنسجة
- المفاجئة تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل، والقطع الأمثل مركب درجة الحرارة، والجليد الجاف.
- قطع العينات في أقسام 10 ميكرومتر باستخدام cryostat، وجبل لهم على الشرائح المغلفة بولي ليسين.
- خبز الشرائح في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ووصمة عار الشرائح المخبوزة مع hematoxylin وeosin قبل تركيبها للحصول على صورة في التكبير 10-20x باستخدام المجهر واسعة النطاق.
8. معالجة الأنسجة لتحليل البروتين والحمض النووي
- المفاجئة تجميد الرئتين الجنين تشريح، وتجانس لهم في 300 ميكرولتر من العازلة المقايسة المناعية الإشعاعية. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 18000 × غرام.
- استخراج وقياس البروتين والحمض النووي والجيش الملكي النيبالي10،12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فحصت هذه الدراسة 37 جنينا: 20 (54.1٪) كما TO مقابل 17 (45.9٪) كسيطرة. وبما أنه لا يمكن انسداد القصبة الهوائية في 4 أجنة في مجموعة TO ، فقد تم استبعادها من الدراسة. لم يكن هناك فرق كبير في معدل الوفيات في كلتا المجموعتين: 4 أجنة (25٪) في مجموعة TO و 2 الأجنة (12٪) في مجموعة التحكم (p=0.334، نسبة الاحتمالات (OR) 2.5، فاصل الثقة 95٪ (CI) 0.39-16.05). كان متوسط وزن الجسم ووزن الرئة ونسبة وزن الرئة إلى الجسم (LBWR) أعلى في مجموعة TO منه في مجموعة التحكم(الجدول 1). كان هناك فرق كبير في LBWR (p = 0.006) بين TO ومجموعات التحكم.
تم تحديد الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين لتحديد سبب الفرق في LBWR(الشكل 2). وكانت كميات الحمض النووي الرئة ونسبة الحمض النووي / البروتين أعلى في مجموعة TO، لوحظ أي فرق في الحمض النووي الريبي الرئة، وكميات البروتين كانت أقل في مجموعة TO مما كانت عليه في مجموعة التحكم، كما لوحظ سابقا في نموذج الأرنب TO الذي لوحظ تضخم الظهارية12. كما أظهرت أقطار الشعب الهوائية في مجموعة TO زيادة.
وأظهرت التحليلات النسيجية للرئتين E18.5 المرحلة المتأخرة القناة / المبكرة من تطور الرئة مع تطوير المجال الجوي والتداخل السميك بين الأسطح الظهارية في عينات التحكم في حين أن الرئتين في مجموعة TO قد توسعت المجال الجوي المركزي والقاصي مع أعداد أعلى ذاتيا من النوى(الشكل 2). هذه الزيادة الخلوية تتفق مع الزيادة الملحوظة في كمية الحمض النووي للرئة.
الشكل 2: ملامح المجموعات. (أ) تطبيع نسبة وزن الرئة إلى الجنين،(ب)الحمض النووي الرئة إلى نسبة البروتين،(C)محتوى الحمض النووي الرئة تطبيع لوزن الرئة،(D)محتوى الحمض النووي الريبي الرئة تطبيع لوزن الرئة، و (ه) محتوى بروتين الرئة تطبيع لوزن الرئة. (F) صور الهيماتوكسيلين واليوزين التمثيلية ل C57BL/6 E18.5 الرئتين دون (شريط مقياس = 50 ميكرومتر) و (G) مع انسداد القصبة الهوائية عبر الرحم الجنيني تظهر تضخم في إجراء المسالك الهوائية وزيادة حجم المجال الجوي البعيدة؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم إجراء مقارنة بين التحكم (n =9) والانسداد القصبي (TO) (n=6) باستخدام اختبار Tللطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجدول 1: النتائج المورفومترية للمجموعات | |||
| ل | تحكم | ف | |
| وزن الجنين (ملغ) | 1100.52 ± 229.38 | 1087.15 ± 172.32 | 0.896 |
| وزن الرئة (ملغ) | 28.41 ± 5.87 | 23.38 ± 3.09 | 0.043 |
| LBWR | 0.0259 ± 0.0021 | 0.0217 ± 0.0028 | 0.006* |
| القيم المعبر عنها على أنها وسيلة ± الانحرافات المعيارية. الاختصارات: LBWR = نسبة وزن الرئة إلى جسم الجنين؛ TO = انسداد القصبة الهوائية. | |||
| *95٪ فاصل الثقة 0.0222-0.0249. المجموعات التي تمت مقارنتها باختبار T للطالب. | |||
الجدول 1: النتائج المورفومترية للمجموعات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه الطريقة إجراء جراحيا للانسداد القصبي الجنيني في الفئران وتأثيره على نمو الرئة. هناك بعض الخطوات الهامة في البروتوكول التي يجب أن يتم تنفيذها بعناية من أجل TO ناجحة. دفء المنصة التي تجري عليها الجراحة والمحلول الملحي الذي يتم إدخاله إلى تجويف الصفاق أمر بالغ الأهمية لتطور الحمل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تطبيق ضغط طفيف على رأس الجراء لضمان تعرض الرقبة.
خياطة البولي بروبلين 6.0 هي الغرزة الوحيدة التي يمكن استخدامها لهذه التقنية. الإبر من الغرز أكبر من 6.0 هي أكثر سمكا وتدمير الهياكل حول القصبة الهوائية في الرقبة، مما أدى إلى فقدان الجنين. الإبر من الغرز أرق قصيرة جدا ولا يمكن أن تمر من خلال عنق الجرو E16.5 (مرحلة القناة في وقت مبكر). وعلاوة على ذلك، إبرة القطع غير مناسبة لأنها قد تدمر الهياكل المجاورة.
هذا النموذج لديه بعض القيود. أولا، هناك فرق في ارتباط مراحل نمو الرئة وفترة الحمل بين الفئران والبشر. ثانيا، من الصعب تطوير CDH في الفئران، وأخيرا، من الصعب إجراء الدراسات الديناميكية الدموية في نماذج الماوس. ومع ذلك، أدى منحنى التعلم القصير في هذه الدراسة إلى انخفاض كبير في معدل وفيات الجنين. وكما ذكر سابقا، فإن تكلفة الحيوانات وصيانتها، وعدد الأجنة لكل حمل، وطول فترة الحمل، والتوافر المحدود للأدوات الوراثية هي العوامل الرئيسية المقيدة في نماذج الأرانب والأغنام.
الميزة الأولى لهذا النموذج الماوس هو أنه يلغي الحاجة إلى استئصال الرحم ل TO ولديه القدرة على عكس في الرحم11, الذي يمثل انخفاض معدلات الوفيات لوحظ في هذه الدراسة. ثانيا، إن تخفيض تكلفة الحيوانات وصيانتها وقصر فترة الحمل يسهلان إجراء مجموعة أكبر من التجارب. ثالثا، يتم منع الأسباب غير التقنية للمضاعفات، مثل انخفاض حرارة الجسم والتخدير، من خلال قصر مدة الجراحة. وأخيرا، فإن مجموعة واسعة من الأدوات الوراثية المتاحة في الفئران يؤدي إلى مزيد من الدراسات لفهم الفيزيولوجيا المرضية للCDH. إزالة خياطة عبر الرحم مع الولادة الحية للجنين في نماذج نيتروفين خروج المغلوب من CDH ستكون التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
لم يتلق هذا البحث أي منحة محددة من وكالات التمويل في القطاعات العامة أو التجارية أو غير الربحية. قدم جميع المؤلفين مساهمات كبيرة في تصميم وصياغة الدراسة، والحصول على البيانات وتحليلها وتفسيرها، وصياغة المادة، وتنقيحها للمحتوى الفكري الهام والموافقة النهائية على النسخة التي سيتم تقديمها. يشكر المؤلفون كان سابونكوغلو على جهوده الرقيقة لإنتاج العمل الفني للتقنية الجراحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
