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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Dénombrement précis des follicules chez les ovaires de souris adultes

Published: October 16, 2020 doi: 10.3791/61782
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Development and Stem Cells Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University

Summary

Ici, nous décrivons, comparons, et contrastons deux techniques différentes pour le comptage précis de follicule des tissus ovariens fixes de souris.

Abstract

Les mammifères femelles se reproduisant sexuellement naissent avec tout leur approvisionnement en ovocytes tout au long de leur vie. Les ovocytes immatures et tranquilles se trouvent dans les follicules primordiaux, l’unité de stockage de la lignée germinale femelle. Ils ne sont pas renouvelables, donc leur nombre à la naissance et le taux de perte qui en résulte dictent en grande partie la durée de vie fertile des femelles. Une quantification précise du nombre de follicules primordiaux chez les femmes et les animaux est essentielle pour déterminer l’impact des médicaments et des toxiques sur la réserve ovarienne. Elle est également nécessaire pour évaluer la nécessité et le succès des techniques existantes et émergentes de préservation de la fertilité. Actuellement, aucune méthode n’existe pour mesurer avec précision le nombre de follicules primordiaux comprenant la réserve ovarienne chez les femmes. En outre, il n’est souvent pas possible d’obtenir du tissu ovarien de gros animaux ou d’espèces en voie de disparition à des fins expérimentales. Ainsi, les souris sont devenues un modèle essentiel pour de telles études, et la capacité d’évaluer le nombre primordial de follicules dans les ovaires entiers de souris est un outil essentiel. Cependant, les rapports du nombre absolu de follicules dans les ovaires de souris dans la littérature sont très variables, ce qui rend difficile la comparaison et/ou la réplication des données. Cela est dû à un certain nombre de facteurs, y compris la souche, l’âge, les groupes de traitement, ainsi que les différences techniques dans les méthodes de comptage utilisées. Dans cet article, nous fournissons un guide d’instruction étape par étape pour la préparation des sections histologiques et le comptage des follicules primordiaux dans les ovaires de souris en utilisant deux méthodes différentes: [1] stéréologie, qui repose sur la technique de fractionnement / dissecteur optique; et [2] la technique du comptage direct. Certains des principaux avantages et inconvénients de chaque méthode seront mis en évidence afin que la reproductibilité puisse être améliorée sur le terrain et pour permettre aux chercheurs de choisir la méthode la plus appropriée pour leurs études.

Introduction

Les ovocytes immatures et méiotically-arrêtés stockés dans les follicules primordiaux dans l’ovaire sont l’unité de stockage pour la lignée germinale femelle et comprennent la réserve ovarienne à vie d’un individu. Le nombre de follicules primordiaux diminue naturellement avec l’âgede 1, ou bien, peut être prématurément épuisé à la suite d’une exposition à des produits chimiques exogènes, y compris certains produits pharmaceutiques et toxiques environnementaux dans l’air, les aliments et l’eau2. Étant donné que le nombre de follicules primordiaux est fini, la quantité et la qualité des follicules présents dans l’ovaire déterminent en grande partie la fertilité féminine et la santé de la progéniture. Ainsi, la quantification précise du nombre primordial de follicule chez les femmes est essentielle pour évaluer les impacts hors cible des insultes exogènes sur la réserve ovarienne.

Chez les femmes, l’analyse de l’ovaire entier n’est généralement pas possible, ainsi des mesures de substitution non invasives de la réserve ovarienne doivent être utilisées dans un cadre clinique. L’hormone anti-Mϋllerienne (AMH) est le biomarqueur de substitution le plus largement utilisé cliniquement3. Les taux sériques d’AMH sont souvent mesurés chez les femmes d’âge maternel avancé, ou avant et après le traitement du cancer, comme la chimiothérapie. Cependant, l’AMH est produite par la croissance des follicules et non par les follicules primordiaux, et ainsi, les niveaux de sérum n’informent pas sur le nombre absolu de follicules primordiaux.

En l’absence de méthodes pour déterminer avec précision le nombre de follicules primordiaux chez les femmes in situ,le comptage des follicules ovariens chez les petits modèles animaux, tels que les rongeurs, reste un outil de recherche essentiel pour évaluer le degré d’impact des insultes exogènes sur les follicules primordiaux et donc sur la fertilité. Malheureusement, les rapports dans toute la littérature sur les nombres primordiaux de follicules dans les modèles de rongeurs sont très variables4. L’une des principales raisons en est les différences techniques largement rapportées dans la méthode de comptage utilisée. Principalement, il existe deux techniques différentes décrites dans la littérature pour énumérer les follicules primordiaux chez la souris. Ceux-ci incluent la stéréologie, qui utilise la méthode du dissecteur optique du fractionneur, et le nombre direct de follicules.

La stéréologie est largement considérée comme l’étalon-or car elle utilise un échantillonnage aléatoire uniforme systématique5,ce qui en fait la méthode la plus précise de quantification du nombre de follicules primordiaux chez les ovaires entiers de souris ou de rats4,6,7. La stéréologie est impartiale, car elle tient compte de la structure tridimensionnelle de l’objet d’intérêt8. À l’aide d’une méthode de dissecteur/fractionneur optique, trois niveaux d’échantillonnage sont appliqués pour quantifier les follicules primordiaux à l’aide de sections tissulaires épaisses (p. ex. 20 μm) dans une fraction connue de l’ovaire total de la souris. Tout d’abord, l’intervalle d’échantillonnage est choisi (par exemple, chaque3ème section) à un départ aléatoire (fraction d’échantillonnage 1, f1)4. Les sections sont ensuite échantillonnées de manière systématique et uniforme à partir de ce point à travers l’ovaire entier. Ensuite, une base de comptage non biaisée se superpose à la section ovarienne et se déplace progressivement le long d’une grille de comptage définie et randomisée (fraction d’échantillonnage 2,f2)8. Enfin, une fraction connue de l’épaisseur de la section est échantillonnée optiquement (par exemple, 10 μm) et les follicules à l’intérieur de cette zone sont comptés (fraction d’échantillonnage 3,f3)4. Le nombre de follicules bruts est multiplié par l’inverse de ces fractions d’échantillonnage pour obtenir la valeur finale. Cette méthode nécessite une formation et un équipement d’experts, y compris un microscope avec un étage motorisé piloté par un logiciel téréologique. Les tissus doivent être conservés dans un fixateur de Bouin spécialisé et incorporés dans de la résine de glycolméthacrylate pour permettre de couper des sections de tissus épaisses à l’aide d’un microtome de résine de glycolméthacrylate avec un couteau en verre. Cette méthode est conçue pour tenir compte du rétrécissement et de la déformation des tissus, afin de préserver au mieux la structure morphologique tridimensionnelle de l’ovaire et des follicules9.

Le comptage direct des follicules est la méthode la plus fréquemment utilisée pour compter les follicules10. Des fixateurs plus courants (c.-à-d. le forcine) peuvent être utilisés, suivis de l’encastrement de cire de paraffine et du sectionnement exhaustif en série à l’aide d’un microtome standard à une épaisseur comprise entre 4 et 6 μm. Les follicules sont systématiquement comptés dans toute la section tissulaire à un intervalle défini, puis multipliés par l’inverse de l’intervalle d’échantillonnage pour obtenir l’estimation du follicule total. Cette méthode est rapide, facile, peut être réalisée à l’aide de tissus archivés et préparée à l’aide de techniques histologiques standard. Il ne nécessite qu’un microscope optique avec des capacités d’imagerie standard. Cependant, en dépit de ces avantages, le comptage direct de follicule manque de la précision et des paramètres stricts de comptage de la stéréologie, ce qui le rend plus enclin au biais d’investigateur. En outre, les tissus peuvent subir un rétrécissement et une déformation pendant le traitement, perturbant l’intégrité et la morphologie de l’ovaire et rendant ainsi la classification et la quantification des follicules difficiles.

Le but de cet article est de décrire deux méthodes couramment utilisées pour évaluer quantitativement le nombre primordial de follicule dans les ovaires de souris : stéréologie et comptage direct de follicule. Nous fournirons des protocoles détaillés pour ces deux méthodes et mettrons en évidence certaines de leurs forces et faiblesses, afin d’améliorer la reproductibilité dans notre domaine et de permettre aux chercheurs de prendre une décision éclairée quant à la méthode de comptage la plus appropriée pour leurs études.

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Protocol

Des ovaires ont été prélevés sur des souris femelles C57BL6J. Toutes les procédures et expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au code de pratique australien NHMRC pour le soin et l’utilisation des animaux et approuvées par le comité d’éthique animale de la plate-forme de recherche sur les animaux Monash.

REMARQUE: Un agent chimiothérapeutique montré pour épuiser les ovocytes primordiaux de follicule, tel que déterminé utilisant la stéréologie11 et les comptes directs12,13 a été employé dans ce rapport pour comparer les deux méthodes de comptage chez le même animal. Des souris femelles, âgées de 8 semaines (jeunes adultes) ont été pesées avant une injection intrapéritonéale simple de 75 mg/kg/poids corporel de cyclophosphamide, ou un contrôle de véhicule salin (n = 5/groupe). Il a été démontré que cette dose provoque un épuisement d’environ 50% des follicules primordiaux, mais n’a pas été signalée comme entraînant une morbidité ou une mortalité chez la souris14. Les ovaires ont été récoltés 48 heures après traitement. Un ovaire de chaque animal a été fixé dans une solution de forcine tamponnée neutre à 10% (v/v) pendant 24 heures, et l’autre fixé dans la solution de Bouin pendant 24 heures. Les tissus ont ensuite été incorporés dans de la résine de glycolméthacrylate et sectionnés en série à 20 μm, ou dans de la paraffine et sectionnés en série à 5 μm. Tous les tissus ont été souillés avec schiff acide périodique et haematoxylin.

1. Préparation histologique: fixation, traitement, incorporation et sectionnement des ovaires de souris

  1. Disséquer les ovaires de la souris en coupant l’oviducte et toute la graisse environnante, sans endommager ou couper l’ovaire lui-même. Si nécessaire, utilisez un microscope à dissection et une lame fine pour cette étape(Figure 1A).
  2. Fixer les tissus immédiatement en les plaçant dans un petit tube marqué contenant soit le fixateur de Bouin (stéréologie), soit le fixateur de forcén (comptes directs) pendant 24 heures(figure 1B),avant de transférer les tissus dans de l’éthanol à 70 %.
    REMARQUE: La morphologie du follicule est mieux conservée dans le tissu ovarien fixe de Bouin, incorporé dans la résine de glycolméthacrylate (Figure 2).
  3. Traiter des ovaires fixes entiers, puis les incorporer dans la résine glycolméthacrylate pour la stéréologie(fichier supplémentaire 1),ou de la cire de paraffine pour les comptages directs à l’aide d’un protocole histologique standard.
    ATTENTION: La résine est toxique, alors assurez-vous que toutes les étapes de traitement des tissus sont effectuées dans une hotte et que les gants sont portés en tout temps.
  4. Utiliser un microtome spécialisé en méthacrylate de résine(figure 1C)muni d’un couteau en verre(figure 1D)pour couper de façon exhaustive des sections épaisses de résine de glycolméthacrylate (p. ex. 20 μm). Recueillir les sections à intervalles réguliers (par exemple, chaque3ème section) sur des lames de microscope en verre pour la stéréologie.
  5. Utilisez un microtome standard pour couper de fines sections de paraffine (p. ex. 4 à 6 μm). Recueillir des sections de tissu à intervalles réguliers (p. ex., chaque 9e section) sur une lame de microscope en verre pour le compte direct de follicules.
  6. Colorer les lames avec de l’acide périodique Schiff et de l’hématoxyline (Dossier supplémentaire 2).
  7. Lamelle de couverture avec DPX standard pour les sections de paraffine, ou DPX épais pour les sections de résine de glycolméthacrylate (Figure 1E).
    ATTENTION: La résine de glycolméthacrylate DPX est dangereuse, alors effectuez cette étape pour fumer le capot.
    REMARQUE: La résine de glycolméthacrylate DPX est extrêmement visqueuse. La lamelle de couverture en verre doit être collée fermement en la pressant vers le bas avec une spatule pour s’assurer que le DPX est uniformément et finement dispersé, et qu’il n’y a pas de bulles d’air sous la lamelle de couverture(Figure 1F).

2. Estimation histologique du nombre de follicules primordiaux à l’aide du fractionneur optique

  1. Allumez l’ordinateur, l’unité de contrôle multiple, la caméra et la source lumineuse dans la configuration stéréology et réglez l’objectif du microscope sur un faible grossissement (par exemple, 10x).
  2. Ouvrez le logiciel de stéréologie.
  3. Placez la première lame solidement sur l’étage du microscope.
  4. Réglez l’exposition à la lumière en cochant Automatique sous Exposition dans le panneau Paramètres de la caméra (Figure 1A supplémentaire). Vous pouvez également ajuster manuellement l’exposition à la lumière.
  5. Utilisez le joystick pour localiser le premier échantillon de tissu et mettre l’échantillon au point.
  6. Réglez la balance des blancs, soit en cliquant sur Plus de paramètres (situé en bas à droite du panneau Paramètres de la caméra), puis cliquez sur Balance des blancs et cliquez sur Automatique (Figure supplémentaire 1B). Vous pouvez également cliquer sur le bouton Balance des blancs adjacent au bouton Plus de paramètres (ou Sélectionner une zone dans Plus de paramètres), pour définir la balance des blancs manuellement en sélectionnant une zone blanche sur la section.
  7. Accédez au menu déroulant Sondes et cliquez sur Flux de travail du fractionneur optique. Cliquez ensuite sur Démarrer un nouveau projet, puis sur OK.
    1. Si une configuration d’échantillonnage existante a été enregistrée, sous Paramètres d’échantillonnage, cliquez sur Oui | Il y a un. et sélectionnez la configuration d’échantillonnage souhaitée.
    2. Sinon, cliquez sur Non et entrez manuellement les informations de section série(figure supplémentaire 1C)et définissez la configuration de la sonde à l’étape 2.13.
  8. Cliquez sur Suivant, réglez le microscope sur Faible grossissement et choisissez Grossissement 10x dans le menu déroulant.
  9. Cliquez sur Suivant, puis tracez toute la section ovarienne - commencez par cliquer à gauche autour de la section et à la fin, faites un clic droit et choisissez Fermer le contour.
  10. Cliquez sur Suivant, réglez le microscope sur Grossissement élevé et choisissez Grossissement d’huile 100x dans le menu déroulant.
  11. Placez une goutte d’huile sur la section tissulaire de la lame et déplacez l’objectif du microscope à un grossissement de 100x.
  12. Ajustez l’exposition à la lumière (comme à l’étape 2.4) et cliquez sur Suivant.
  13. Configurez les paramètres d’échantillonnage pour définir la configuration de la sonde. Ici, la trame de comptage a été réglée à 47,5 μm x 47,5 μm (2 256,25 μm2)et la longueur du pas a été définie sur 100 μm x 100 μm (10 000 μm2)(Figure supplémentaire 2). Une fois les paramètres d’échantillonnage établis, enregistrez le modèle et ouvrez-le à nouveau au cours des séances d’analyse suivantes à l’étape 2.7.
  14. Cliquez sur Démarrer le comptage (Figure supplémentaire 1D). Concentrez-vous sur le haut de l’exemple, cliquez sur OK et commencez à compter.
  15. Utilisez le bouton de mise au point pour parcourir la profondeur d’échantillonnage de 10 μm et comptez tous les follicules primordiaux dont le noyau ovocytaire se met au point. Cliquez sur Suivant pour passer à la zone suivante.
    1. Classer les follicules comme primordiaux si l’ovocyte est entouré de cellules de granulosa malpighiennes (aplaies), mais pas de cellules de granulosa cubiques (Figure 2A).
      REMARQUE : Les follicules primordiaux sont distincts des follicules intermédiaires/transitoires, qui comprennent une combinaison de cellules de granulosa cuboïde et malpighiennes(figure 2B)et de follicules primaires, qui sont entourés principalement de cellules de granulosa cubique(figure 2C). Ces classes de follicules doivent être quantifiées séparément.
    2. Ne comptez que les follicules dans lesquels le noyau de l’ovocyte est visible. Le noyau de l’ovocyte doit apparaître dans le cadre de comptage ou toucher les lignes d’inclusion vertes du cadre de comptage(figure supplémentaire 1E,F).
    3. Si le noyau ovocytaire tombe en dehors du cadre de comptage(figure supplémentaire 1G)ou touche les lignes d’exclusion rouges du cadre de comptage, ne comptez pas ce follicule.
    4. Lors de l’évaluation de l’épuisement primordial des follicules en réponse à un produit chimique exogène (p. ex. chimiothérapie), s’assurer que tous les follicules comptés sont sains et ont donc une morphologie normale (Figure 2). Comptez séparément tous les follicules anormaux ou atrétiques. Souvent, la mort des follicules est induite par des insultes telles que la chimiothérapie, et la quantification des follicules atrétiques doit être obtenue séparément afin de distinguer les follicules sains des follicules atrétiques, car seuls les follicules sains constituent la réserve ovarienne15.
  16. Une fois le comptage terminé sur cette section, effectuez l’une des opérations suivantes :
    1. Cliquez sur Ajouter une nouvelle section, puis revenez à l’étape 2.3 pour configurer la section suivante pour le comptage.
    2. Cliquez sur J’ai terminé le comptage pour terminer la session. Retournez l’objectif à 10x, quittez le logiciel de stéréologie et éteignez la source de lumière, la caméra, l’unité de contrôle multiple et l’ordinateur.
  17. Obtenir la somme du nombre de follicules bruts (Q) de chaque section tissulaire prélevée sur l’ovaire entier, puis à l’aide d’une feuille de calcul, utiliser l’équation ci-dessous pour obtenir la valeur finale de chaque animal répliqué (N)4.
    Equation 1où:
    N = Nombre total estimé de follicules dans l’ovaire.
    Q = Nombre de follicules primordiaux bruts.
    f1 = Intervalle d’échantillonnage. Chaque3ème section a été échantillonnée ainsi Equation 2 .
    f2 = Relation entre la base de sondage (zone d’échantillonnage) et le stepper, calculée comme Equation 3 suit : . Étant donné que la zone d’échantillonnage était de 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) et que la zone pas à pas était de 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), Equation 4 .
    f3 = Fraction de la section ovarienne échantillonnée. Étant donné que 10 μm de la section de 20 μm ont été échantillonnés, Equation 5 .
    Par conséquent, Equation 6 .
    REMARQUE: Ce protocole décrit comment appliquer ces principes d’analyses thétéologiques à l’aide d’un logiciel de stéréologie largement cité(Table des matériaux); cependant, d’autres logiciels téréologiques sont disponibles. Les principes appliqués lors des analyses thétérologiques des follicules ovariens sont les mêmes, quel que soit le logiciel utilisé pour configurer les paramètres. La stéréologie est plus précise lorsque 100 objets ou plus sont comptés dans un ovaire de souris adulte4, car cela donne un coefficient d’erreur pour l’estimation inférieure à 10%16. Les paramètres d’échantillonnage décrits ici ont été optimisés pour s’assurer qu’au moins 100 objets (c.-à-d. follicules primordiaux, transitoires et primaires) peuvent être comptés dans les ovaires C57BL6J adultes témoins de type sauvage. Une étude pilote peut être menée comprenant une petite taille d’échantillon pour établir les paramètres d’échantillonnage optimaux, tels que l’intervalle et le nombre de sections à analyser et le nombre de dissecteurs optiques dans les sectionséchantillonnées 17.

3. Estimation du nombre de follicules primordiaux par le nombre direct de follicules ovariens

  1. Placez la lame du microscope solidement sous un microscope optique standard et effectuez des comptages directs pour obtenir le nombre de follicules primordiaux bruts.
    1. Classer les follicules comme primordiaux si l’ovocyte est clairement visible et est entouré de cellules de granulosa malpighiennes (aplaies), mais pas de cellules de granulosa cubiques (Figure 2D).
      REMARQUE : Les follicules primordiaux sont distincts des follicules intermédiaires/transitoires, qui comprennent une combinaison de cellules de granulosa cubiques et malpighiennes(figure 2E)et de follicules primaires, qui sont entourés principalement de cellules de granulosa cubique(figure 2F). Ces classes de follicules doivent être quantifiées séparément.
    2. Assurez-vous que tous les follicules comptés sont sains et ont donc une morphologie normale (Figure 2). Comptez séparément tous les follicules anormaux ou atrétiques, car seuls les follicules sains constituent la réserve ovarienne.
  2. Vous pouvez également prendre plusieurs photomicrographes de haute puissance (p. ex., 20x) ou cousus de toute la section du tissu ovarien pour effectuer des comptages en ouvrant le ou les fichiers image. Cela peut être fait manuellement ou à l’aide d’un scanner de diapositives automatisé.
  3. Obtenir la somme du nombre brut de follicules (Q) de chaque section tissulaire prélevée sur l’ovaire entier à l’intervalle prédéterminé. Multipliez ce nombre par l’inverse de la fraction d’échantillonnage pour obtenir la valeur finale pour chaque animal répliqué (N), à l’aide de l’équation ci-dessous.
    Equation 7où:
    N = Nombre total estimé de follicules dans l’ovaire.
    Q = Nombre de follicules bruts (de chaque type individuel, calculé séparément).
    f1 = Intervalle d’échantillonnage. Chaque 9e section a été échantillonnée Equation 8 ainsi.
    Par conséquent, Equation 9 .

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Representative Results

Un modèle bien caractérisé d’épuisement des follicules a été utilisé, dans lequel de jeunes souris femelles adultes ont reçu une dose unique de chimiothérapie au cyclophosphamide, ou un contrôle de véhicule salin (n = 5/groupe) et les deux ovaires ont été récoltés de chaque animal après 48 heures. Un ovaire par animal a été préparé comme décrit à l’étape 1 pour chacune des deux méthodes : stéréologie ou comptage direct. L’ovaire gauche et droit de chaque animal a été assigné au hasard à chaque groupe. Ces données montrent que lors de l’utilisation de la stéréologie, un épuisement significatif des follicules primordiaux de souris peut être détecté après un traitement de chimiothérapie (387 follicules ± 11), par rapport au contrôle (1043 ± 149; p = 0,0024) (Figure 3). En revanche, en utilisant les ovaires controllatéraux des mêmes animaux, le nombre direct de follicules n’a pas permis de détecter une réduction significative de la réserve ovarienne après la chimiothérapie (490 ± 40), par rapport au témoin (752 ± 139; p = 0,1063) (Figure 3). Il convient de noter qu’il est clair que le nombre primordial de follicules chez les jeunes animaux de type sauvage adultes est variable, car la distribution des animaux traités par solution saline est plus large que celle des groupes cyclophosphamide, même lorsque les comptages ont été effectués à l’aide de la stéréologie (Figure 3).

Figure 1
Ill. 1 : Préparation histologique d’ovaires de Bouin fixés en résine de glycolméthacrylate pour analyse histologique. A)Un ovaire de souris adulte (cercle, flèche) a été étroitement coupé de toute la graisse et de l’oviducte de l’ovaire de la souris à l’aide d’une lame de plume. B)Les ovaires de souris contralatéraux (cercle, flèche) de la même femelle adulte ont été disséqués, coupés, puis fixés dans le fixateur de Bouin (à gauche) pour la stéréologie, ou le forcénine pour les comptes directs (à droite). C)Un microtome spécialisé en méthacrylate de résine D)muni d’un couteau en verre (flèche) a été utilisé pour couper de manière exhaustive des blocs de résine de glycolméthacrylate en sections de 20 μm, collectées sur des lames de microscope en verre. E) Des sections périodiques de tissu ovarien teintées d’acide schiff sur des lames de microscope en verre (flèches) ont été trempées dans du histolene frais (récipient vert) dans une hotte, puis une lame de couverture en verre a été ajoutée au-dessus des gouttes de GMA DPX. Une spatule a été utilisée pour éliminer l’excès de DPX et les bulles d’air. Les lames ont été séchées à l’air dans la hotte pendant la nuit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Classification des follicules primordiaux. Images représentatives de follicules primordiaux, transitoires et primaires dans des sections ovariennes résine-incorporées de glycolméthacrylate (A-C) et paraffine-incorporées (D-F). R : Follicule primordial entouré de cellules de granulosa malpighiennes (flèche). Bar = 10 μm. B : Follicule transitoire entouré de cellules de granulosa malpighiennes (flèche) et cubiques (pointe de flèche). Bar = 10 μm. C : Follicule primaire entouré de cellules de granulosa cubiques (pointes de flèche). Bar = 25 μm. D : Follicule primordial entouré de cellules de granulosa malpighiennes (flèche). Bar = 10 μm. E: Follicule transitoire entouré de cellules de granulosa malpighiennes (flèche) et cubiques (pointe de flèche). Bar = 10 μm. F: Follicule primaire entouré de cellules de granulosa cubiques (point de flèche). Bar = 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison du fractionnement optique et des méthodes de comptage direct pour évaluer les follicules primordiaux de souris. Un modèle bien établi d’épuisement de follicule a été employé comme modèle, dans lequel des souris femelles de 8 semaines C57BL6J ont été traitées intrapéritonéalement avec salin, ou une dose de 75 mg/kg/poids corporel du cyclophosphamide chimiothérapeutique (n=6/group). Cela a permis de comparer les deux méthodes de comptage des follicules pour détecter les changements à la réserve ovarienne. Dans la même cohorte d’animaux, les estimations totales de follicule n’ont pas détecté l’épuisement significatif de follicule, contrairement à la stéréologie qui a détecté un épuisement plus grand et significatif de la réserve ovarienne. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Forces Faiblesses
STÉRÉOLOGIE Moyen le plus précis d’estimer les follicules Long et coûteux
Utilise plusieurs paramètres d’échantillonnage, ce qui le rend statistiquement robuste Nécessite un équipement et des logiciels experts
Très sensible, peut détecter de plus petits changements dans le nombre de follicules primordiaux Les échantillons doivent être préparés à l’aide de techniques histologiques spécifiques et spécialisées.
La structure du follicule est mieux préservée pendant le traitement des tissus
Des règles uniformes qui peuvent être appliquées par différents chercheurs, réduisant ainsi les biais
COMPTAGES DIRECTS Temps et rentabilité Moins précis et sensible que la stéréologie
Nécessite un équipement de laboratoire standard, p. ex. un microscope optique Un seul paramètre d’échantillonnage a été utilisé, ce qui le rend moins efficace pour détecter de petits changements dans le nombre de follicules
Rétention de sections ovariennes pouvant être utilisées pour des analyses immunohistochimiques ou autres Les tissus sont plus sensibles aux changements de volume et de structure des follicules pendant le traitement
Pas d’ensemble uniforme de règles qui peuvent être appliquées, donc plus sujettes à la partialité de l’enquêteur

Tableau 1 : Comparaison des forces et des faiblesses des méthodes de comptage des follicules : stéréologie vs comptages directs.

Figure supplémentaire 1 : Captures d’écran du protocole logiciel de stéréologie. A)Ajustez l’exposition en cochant Automatique (case rouge) sous Exposition dans le panneau Paramètres de l’appareil photo (zone blanche). B) Définissez la balance des blancs en cliquant d’abord sur l’icône Plus de paramètres sous Autre dans le panneau Paramètres de l’appareil photo. Ensuite, sélectionnez Balance des blancs et cliquez sur Automatique (zone rouge). C) Si une configuration d’échantillonnage existante n’a pas été définie, cliquez sur Non (zone rouge) et entrez les informations de section série (zone verte). D) Pour commencer le comptage, cliquez sur Démarrer le comptage (flèche blanche). E) Si le noyau d’un follicule primordial est visible dans le cadre de comptage, ce follicule est compté (cercle pointillé blanc). F) Si le noyau d’un follicule primordial touche les lignes d’inclusion vertes du cadre de comptage, ce follicule est également compté (cercle pointillé blanc). G) Si le noyau d’un follicule primordial n’est pas visible dans le cadre de comptage ou touche les lignes d’exclusion rouges du cadre de comptage, ce follicule n’est pas compté (cercle pointillé blanc). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 2 : Configuration des paramètres d’échantillonnage. Suivez les étapes séquentielles dans le panneau de gauche pour définir la configuration de la sonde. A)Mesurer l’épaisseur montée. Assurez-vous que « Recentrer en haut de la section à chaque site de grille » est décoché (boîte rouge). Cochez la case « Entrer manuellement l’épaisseur montée moyenne » (case verte). Entrez l’épaisseur moyenne montée comme étant de 20,00 μm (boîte bleue). B) Définissez la taille de trame de comptage. Sous Affichage de l’image de comptage, cochez « Forcer l’affichage de l’image de comptage à être carré » et « Centrer sur l’image en direct » (boîte rouge). Sous Counting Frame Size (Taille de trame de comptage), entrez 47,5 μm pour X et Y (zone verte). C) Définir la disposition de la grille SRS. Entrez manuellement la taille de la grille comme 110 pour X et Y (zone rouge). D) Définir les options de dissecteur. Pour la hauteur de la zone de garde supérieure, entrez 1,00 μm (zone rouge). Pour la hauteur du dissecteur optique, entrez 10 μm (zone verte). Sous Méthode de mise au point, sélectionnez « Focus manuel » (boîte bleue). E)Enregistrer les paramètres d’échantillonnage. Pour enregistrer ces paramètres, entrez un nom et un commentaire, puis cliquez sur « Enregistrer vos paramètres actuels » (flèche blanche). F) Sous Paramètres des paramètres d’échantillonnage actuels, assurez-vous que vos paramètres correspondent à ceux affichés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Dossier supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cet article fournit un protocole étape par étape pour la technique de référence pour énumérer les follicules primordiaux de souris, la stéréologie, et la méthode plus généralement employée de compter direct de follicule. Le traitement de chimiothérapie a été employé pour comparer et contraster les résultats obtenus à partir de ces deux méthodes différentes dans l’ovaire gauche et droit du même animal. Les deux méthodes ont indiqué la variabilité inter-animale élevée dans les nombres primordiaux de follicule. Un épuisement significatif de la réserve ovarienne a été enregistré utilisant la stereology, mais le comptage direct n’a pas détecté une réduction significative de nombre primordial de follicule après administration de chimiothérapie contre la commande.

Notamment, il est clair que même chez une souche consanguine de souris, comme C57BL6J, la réserve ovarienne chez les jeunes femelles adultes de type sauvage (témoin) est largement répartie, comme c’est le cas chez les humains. Les facteurs qui influent sur cette situation et contribuent à l’établissement de la réserve ovarienne restent à l’étude18. La grande variabilité entre les études sur la fonction ovarienne de la souris pose de nombreux défis au domaine pour comparer ou reproduire les données et faire progresser l’application clinique de nouveaux traitements afin de protéger le nombre et la qualité des ovocytes4. Cette variabilité est probablement attribuable à un certain nombre de facteurs, y compris non seulement les méthodes de comptage employées, mais aussi d’autres facteurs tels que les différences entre la souche animale et l’âge; ainsi que des schémas thérapeutiques, tels que la dose et le moment. Ces facteurs doivent tous être pris en compte lors de la comparaison des données de différentes études. Indépendamment, le modèle d’épuisement de follicule employé dans cette étude accentue globalement la nature précise et sensible du protocole de stéréologie, tout en démontrant également que la méthode largement rapportée de comptes directs ne peut pas détecter un épuisement primordial connu de follicule.

Il y a des forces et des limites de chaque méthode de comptage détaillée dans cet article (Tableau 1). La stéréologie est considérée comme la méthode de référence en raison de sa précision lorsqu’elle est utilisée pour déterminer le nombre de cellules dans une variété d’organes différents5. Cependant, les inconvénients de cette technique comprennent le temps et le coût impliqués, ainsi que le besoin d’équipement et d’expertise spécialisés. Ensemble, cela a limité l’utilisation à grande échelle de cette procédure pour obtenir les données les plus sensibles.

En revanche, la méthode des comptages directs est rapide, facile, peut être effectuée à l’aide de tissus archivés et préparée à l’aide de techniques histologiques standard. Il ne nécessite qu’un microscope optique avec des capacités d’imagerie standard. Cependant, il ne tient pas compte des changements de volume induits par le traitement histologique, qui peut perturber la structure tridimensionnelle de l’ovaire. Par conséquent, la morphologie de follicule n’est pas toujours en juste proportion préservée, rendant l’identification et la précision de comptage difficiles, particulièrement pour des investigateurs inexpérimentés. Alors que le forrin était le fixateur utilisé pour les comptages directs dans cette étude, les tissus fixes de Bouin peuvent être incorporés dans la paraffine, ce qui peut fournir une meilleure morphologie et aider les chercheurs à identifier plus facilement les follicules primordiaux. En outre, dans la littérature, les fractions d’échantillonnage pour la méthode des dénombrements directs varient considérablement, allant de tous les 3rd à chaque 10e 5 μm de paraffine section19, ce qui peut contribuer à de grandes divergences dans le nombre de follicules entre les études. Étant donné que les sections de cire de paraffine sont si minces, compter chaque 9e section aide à éviter le suréchantillonnage et le comptage inutile.

Les méthodes additionnelles non décrites dans ce guide, mais généralement rapportées dans la littérature, comptent dans seulement une section centrale de l’ovaire entier et considèrent ceci pour être représentatif de l’ovaire entier, ou densité de follicule. Cette première méthode est très problématique, car les follicules primordiaux ne sont pas répartis uniformément dans l’ovaire et peuvent être trouvés en grappes. Cela signifie qu’une seule, voire quelques sections de l’ovaire ne sont pas représentatives de l’organe entier, ce qui fait de l’échantillonnage systématique un composant essentiel de toute méthode de comptage. La densité des follicules consiste à compter les follicules dans un échantillon de tissu ovarien, puis à exprimer les nombres par zone de tissu. Compte tenu des limites de l’obtention de tissu humain primaire, la densité de follicules est souvent utilisée comme mesure de substitution pour le nombre absolu de follicules dans l’ovaire humain, bien que les rapports chez la souris soient également courants. Cependant, cette méthode de quantification ne tient pas compte de la distribution inégale des follicules dans tout l’ovaire, ni des fluctuations du volume ovarien, qui se produisent systématiquement tout au long du cycle endocrinien ovarien (lutéal). Ceci est important parce qu’une mesure précise de la densité parmi les échantillons repose sur la surface tissulaire conservée. De plus, cette méthode n’échantillonne souvent qu’une petite biopsie ou fraction de l’ovaire lors de l’analyse des tissus humains, n’est donc pas représentative de l’ovaire entier. La densité des follicules n’a pas la précision réalisable avec la stéréologie. Même en utilisant le même ovaire entier, les mesures comparatives de quantification des follicules à la suite d’une analyse histologique, avec la densité des follicules, ne correspondaient pas dans les ovaires de souris20.

Bien qu’il s’agit de l’animal expérimental le plus couramment utilisé, la souris n’est qu’une espèce modèle. L’obtention d’ovaires à partir d’espèces plus grandes, y compris des animaux domestiques ou des primates non humains, est possible, ainsi le nombre de follicules à partir de spécimens ovariens entiers peut être accompli en utilisant un protocole téréologique modifié21,22. Enfin, si la capacité d’analyser le nombre de follicules dans des ovaires humains entiers est effectivement très difficile, elle peut néanmoins se faire lorsque des échantillons sont disponibles, en utilisant un protocole téréologique modifié23,24,25.

Les orientations futures sur le terrain pourraient inclure l’expansion et l’adoption de nouvelles techniques. Par exemple, une nouvelle méthodologie de détection et de comptage automatisés pour les ovocytes primordiaux de follicules a été décrite26. Cette méthode utilise des réseaux neuronaux convolutionnels pilotés par des jeux de données étiquetés et un algorithme de fenêtre glissante pour sélectionner les données de test. Cependant, cet algorithme n’a été testé que sur deux ovaires et l’absorption généralisée reste à déterminer. Alternativement, les progrès récents dans la clairance des tissus optiques et la microscopie à feuille de lumière ont permis une analyse complète des tissus intacts et certaines études ont étudié cela pour le dénombrement des follicules dans l’ovaire de souris27,28.

En conclusion, tandis que le comptage direct de follicule est une méthode facile, rapide et rentable pour énumérer les follicules primordiaux dans l’ovaire, cette technique peut manquer de sensibilité, d’exactitude et être encline au biais d’investigateur. Par conséquent, malgré ses inconvénients, la stéréologie reste la meilleure technique disponible pour définir avec précision et reproductibilité les nombres de follicules primordiaux.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été rendu possible grâce au soutien de l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de l’État de Victoria et au gouvernement australien NHMRC IRIISS et soutenu par le financement du National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) et de l’Australian Research Council (KJH #FT190100265). Les auteurs tiennent à souligner le soutien technique de la plateforme de recherche sur les animaux Monash, de la plateforme d’histologie Monash et de l’installation de micro-imagerie Monash.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Butanol (HPLC) Fisher Chemical #A383-1
Acid alcohol Amber Scientific #ACDL
Bouin’s fixative Sigma-Aldrich #HT10132 Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide Sigma-Aldrich #C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) Sigma-Aldrich #06522
Ethanol Amber Scientific #ETH Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle Designs for Vision #FEA-745-SR Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative Australian Biostain #ANBFC
Glass coverslip Thermo Scientific #MENCS22501GP 22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome Leica Microsystems #RM2165
Glycolmethacrylate DPX *made in house *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene Trajan #11031
Mayer’s haematoxylin Amber Scientific #MH
Olympus BX50 microscope Olympus #BX50 Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F Olympus #IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source Olympus #TH4-200
Paraffin wax Sigma-Aldrich #03987
Periodic acid Trajan #PERI1% Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060 MicroTec #4060R/F Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent Trajan #SCHF
Scott's tap water Amber Scientific #SCOT Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System MBF Bioscience Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides Thermo Scientific #MENSF41296SP 1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system Emgrid Australia #64709003 500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow Emgrid Australia #64708805 100 g/80 mL

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References

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Biologie du développement Numéro 164 Ovaire ovocytes fertilité follicule primordial stéréologie estimations de follicules comptes directs
Dénombrement précis des follicules chez les ovaires de souris adultes
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Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries. J. Vis. Exp. (164), e61782, doi:10.3791/61782 (2020).

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