Summary
Her beskriver, sammenligner og kontrasterer vi to forskellige teknikker til nøjagtig follikeltælling af fast museovarievæv.
Abstract
Seksuelt reproducerende kvindelige pattedyr er født med hele deres levetid levering af oocytter. Umodne, hvilende oocytter findes i ursækkene, opbevaringsenheden af den kvindelige kim. De er ikke-vedvarende, således deres antal ved fødslen og efterfølgende tab i vid udstrækning dikterer den kvindelige frugtbare levetid. Nøjagtig kvantificering af ursækken hos kvinder og dyr er afgørende for at bestemme virkningen af medicin og toksikanter på æggestokkene reserve. Det er også nødvendigt for at vurdere behovet for og succesen med eksisterende og nye fertilitetsbevarelsesteknikker. I øjeblikket findes der ingen metoder til nøjagtigt at måle antallet af ursække, der omfatter æggestokkene reserve hos kvinder. Desuden er det ofte ikke muligt at få æggestokkene fra store dyr eller truede arter til forsøg. Således er mus blevet en vigtig model for sådanne undersøgelser, og evnen til at evaluere oprindelige follikelnumre i hele muse æggestokke er et kritisk værktøj. Rapporter om absolutte follikelnumre i muse æggestokke i litteraturen er imidlertid meget varierende, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne og /eller replikere data. Dette skyldes en række faktorer, herunder belastning, alder, behandlingsgrupper samt tekniske forskelle i de anvendte optællingsmetoder. I denne artikel giver vi en trinvis instruktionsvejledning til forberedelse af histologiske sektioner og optælling af ursække i muse æggestokke ved hjælp af to forskellige metoder: [1] stereologi, som er afhængig af fraktionerings-/optisk dissektorteknik; og [2] teknikken med direkte optælling. Nogle af de vigtigste fordele og ulemper ved hver metode vil blive fremhævet, således at reproducerbarheden kan forbedres på området, og for at sætte forskerne i stand til at vælge den mest hensigtsmæssige metode til deres studier.
Introduction
De umodne, meiotisk-anholdte oocytter, der opbevares i ursækkene i æggestokkene, er opbevaringsenheden for den kvindelige kim og omfatter en persons levetid æggestokkene reserve. Ursækken falder naturligt med1-årsalderen eller alternativt kan nedbrydes for tidligt efter eksponering for eksogene kemikalier, herunder visse lægemidler og miljøgiftstoffer i luft , fødevarer og vand2. I betragtning af at det oprindelige follikelnummer er begrænset, bestemmer mængden og kvaliteten af follikler, der er til stede i æggestokken, i vid udstrækning kvindelig frugtbarhed og afkoms sundhed. Således er nøjagtig kvantificering af ursækken nummer hos kvinder afgørende for at vurdere off-target virkninger af udefrakommende fornærmelser på æggestokkene reserve.
Hos kvinder, analyse af hele æggestokken er generelt ikke muligt, således ikke-invasive surrogat foranstaltninger af æggestokkene reserve skal anvendes i en klinisk indstilling. Anti-M ællerisk hormon (AMH) er den mest udbredte surrogat biomarkør klinisk3. Serum AMH niveauer er ofte målt hos kvinder i den fremskredne mødrealder, eller før og efter kræftbehandling, såsom kemoterapi. AMH produceres imidlertid af voksende follikler og ikke af ursække, og serumniveauerne informerer derfor ikke om det absolutte ursækkenummer.
Med manglen på metoder til præcist at bestemme ursækken nummer hos kvinder in situ, tælle æggestokkene follikler i små dyremodeller, såsom gnavere, er fortsat et vigtigt forskningsværktøj til at vurdere, i hvilket omfang udefrakommende fornærmelser indvirkning på ursække og dermed frugtbarhed. Desværre er rapporter i hele litteraturen om ursækken i gnavermodeller meget variable4. En væsentlig årsag hertil er de meget omtalte tekniske forskelle i den anvendte optællingsmetode. Overvejende er der to forskellige teknikker beskrevet i litteraturen til opregning af ursække hos mus. Disse omfatter stereologi, som anvender fraktioneret optisk dissektor metode, og direkte follikel tæller.
Stereologi er bredt anerkendt guldstandarden, da den bruger systematisk ensartet stikprøve5, hvilket gør den til den mest nøjagtige metode til kvantificering af ursækken i hele mus eller rotte æggestokke4,6,7. Stereologi er upartisk, da det tegner sig for den tredimensionelle struktur af genstanden for interesse8. Ved hjælp af en optisk dissektor-/fraktioneringsmetode anvendes der tre prøveudtagningsniveauer til at kvantificere ursække ved hjælp af tykke vævssektioner (f.eks. 20 μm) inden for en kendt brøkdel af den samlede museovn. For det første vælges prøvetagningsintervallet (f.eks. hvert3. afsnit) ved en tilfældig start (prøveudtagningsfraktion 1, f1)4. Der udtages derefter en systematisk og ensartet prøve af sektionerne fra dette sted gennem hele æggestokken. Derefter lægges en upartisk tælleramme oven over æggestokkene og flyttes gradvist langs et defineret, randomiseret tællegitter (prøveudtagningsfraktion 2, f2)8. Endelig måles en kendt del af sektionstykkelsen optisk (f.eks. 10 μm), og follikler inden for dette område tælles (prøveudtagningsfraktion 3, f3)4. Det rå follikelnummer multipliceres med det omvendte af disse prøvetagningsfraktioner for at opnå den endelige værdi. Denne metode kræver ekspertuddannelse og udstyr, herunder et mikroskop med en motoriseret fase drevet af stereologisk software. Væv bør bevares i en specialiseret Bouins fikseringsmiddel og indlejres i glycolmethacrylatharpiks for at gøre det muligt at skære tykke vævssektioner ved hjælp af en glycolmethacrylatharpiksmiktome med en glaskniv. Denne metode er designet til at tage højde for vævssvind og deformation, for bedst at bevare den tredimensionale morfologiske struktur af æggestokkene og folliklerne9.
Direkte follikeltælling er den hyppigst anvendte metode til optælling af follikler10. Mere almindelige fikseringsmidler (dvs. formalin) kan anvendes, efterfulgt af paraffinvoksindlejring og udtømmende seriel sektion ved hjælp af en standardmikromi i en tykkelse på mellem 4-6 μm. Follikler tælles systematisk i hele vævsafsnittet med et bestemt interval og multipliceres derefter med det inverse prøveudtagningsinterval for at opnå det samlede follikelestimat. Denne metode er hurtig, nem, kan udføres ved hjælp af arkiveret væv og forberedes ved hjælp af standard histologiske teknikker. Det kræver kun et let mikroskop med standard billedbehandling kapaciteter. Men på trods af disse fordele, direkte follikel tælle mangler nøjagtigheden og strenge tælle parametre stereologi, hvilket gør det mere tilbøjelige til at investigator bias. Derudover kan væv gennemgå krympning og deformation under behandlingen, forstyrre æggestokkens integritet og morfologi og dermed gøre follikelklassificering og kvantificering vanskelig.
Formålet med denne artikel er at beskrive to almindeligt anvendte metoder til kvantitativ vurdering af ursækken i muse æggestokke: stereologi og direkte follikeltælling. Vi vil levere detaljerede protokoller for disse to metoder og fremhæve nogle af deres styrker og svagheder for at øge reproducerbarheden på vores område og give forskere mulighed for at træffe en informeret beslutning om den mest hensigtsmæssige optællingsmetode for deres studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Æggestokke blev indsamlet fra kvindelige C57BL6J mus. Alle dyreforsøg og -forsøg blev udført i overensstemmelse med NHMRC's australske adfærdskodeks for pasning og brug af dyr og godkendt af Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.
BEMÆRK: Et kemoterapimiddel, der har vist sig at nedbryde ursækkepinde, som bestemt ved hjælp af stereologi11 og direkte tællinger12,13 blev anvendt i denne rapport til at sammenligne de to tællemetoder i samme dyr. Hunmus på 8 uger (unge voksne) blev vejet før en enkelt intraperitoneal injektion på 75 mg/kg/kropsvægt af cyklophosphamide eller saltvandskøretøjskontrol (n=5/gruppe). Denne dosis har vist sig at forårsage en omtrentlig 50% udtømning af ursække, men ikke rapporteret at forårsage sygelighed eller dødelighed hos mus14. Æggestokkene blev høstet 48 timer efter behandlingen. En æggestok fra hvert dyr blev fastsat i 10% (v/ v) neutral buffer formalinopløsning i 24 timer, og den anden fastgjort i Bouins opløsning i 24 timer. Vævet blev derefter indlejret i enten glycolmethacrylatharpiks og serielt sektion ved 20 μm eller i paraffin og serielt sektion ved 5 μm. Alle væv var plettet med periodisk syre Schiff og hæmatoxylin.
1. Histologiske præparater: fiksering, forarbejdning, indlejring og sektionsopdeling af æggestokke med mus
- Dissekere muse æggestokke ved at trimme ovidukten og alt omgivende fedt uden at beskadige eller skære æggestokken selv. Brug om nødvendigt et dissekerende mikroskop og et fint blad til dette trin (Figur 1A).
- Ret straks væv ved at placere det i et lille mærket rør, der indeholder enten Bouins fikseringsmiddel (stereologi) eller formalinfikseringsmiddel (direkte optællinger) i 24 timer (figur 1B), før væv overføres til 70% ethanol.
BEMÆRK: Follikelmorfologi bevares bedst i Bouins faste æggestokkene væv, indlejret i glycolmethacrylat harpiks(Figur 2). - Alle faste æggestokke behandles og indlejres derefter i glycolmethacrylatharpiks til stereologi (Supplerende fil 1) eller paraffinvoks til direkte optællinger ved hjælp af en standard histologisk protokol.
ADVARSEL: Harpiks er giftig, så sørg for, at alle vævsbehandlingstrin udføres i en røghætte, og at handskerne altid bæres. - Brug en specialiseret harpiks methacrylatmikrtom (figur 1C) udstyret med en glaskniv (figur 1D) til udtømmende at skære tykke glycolmethacrylatharpikssektioner (f.eks. 20 μm). Opsamle sektionerne med jævne mellemrum (f.eks. hver3. sektion) på glasmikroskopdias til stereologi.
- Brug en standardmikromi til at skære tynde paraffinsektioner (f.eks. 4-6 μm). Opsamle væv sektioner med jævne mellemrum (f.eks hver9 th sektion) på et glas mikroskop dias for direkte follikel tæller.
- Pletter lysbillederne med periodisk syre Schiff og haematoxylin (Supplerende fil 2).
- Coverslip med standard DPX for paraffinsektioner eller tyk DPX for glycolmethacrylatharpikssektioner(figur 1E).
ADVARSEL: Glycolmethacrylat harpiks DPX er farligt, så udfør dette trin i at ryge hætte.
BEMÆRK: Glycolmethacrylat harpiks DPX er ekstremt tyktflydende. Glasovertræksdåsen skal klæbes fast ved at trykke den ned med en spatel for at sikre, at DPX er jævnt og tyndt spredt, og der er ingen luftbobler til stede under dækslet (Figur 1F).
2. Stereologisk vurdering af ursækken ved hjælp af den optiske fraktionering
- Tænd computeren, multikontrolenheden, kameraet og lyskilden i stereologiopsætningen, og sæt mikroskopmålet til en lav forstørrelse (f.eks. 10x).
- Åbn stereologisoftwaren.
- Sæt det første dias sikkert på mikroskopet scenen.
- Juster lyseksponeringen ved at kontrollere Automatisk under eksponering i panelet Kameraindstillinger (Supplerende figur 1A). Alternativt kan du justere lyseksponeringen manuelt.
- Brug joysticket til at finde den første vævsprøve og bringe prøven i fokus.
- Juster hvidbalancen, enten ved at klikke på Flere indstillinger (placeret nederst til højre i panelet Kameraindstillinger), og klik derefter på Hvidbalance, og klik på Automatisk ( Supplerendefigur 1B). Du kan også klikke på knappen Hvidbalance ved siden af knappen Flere indstillinger (eller Vælg område under Flere indstillinger) for at angive hvidbalancen manuelt ved at markere et hvidt område i sektionen.
- Gå til rullemenuen Sonder , og klik på Optisk brøkproces. Klik derefter på Start nyt projekt, og klik på OK.
- Hvis der er gemt en eksisterende stikprøvekonfiguration, skal du klikke på Ja under Samplingparametre | ... og vælg den ønskede stikprøvekonfiguration.
- Hvis ikke, skal du klikke på Nej og manuelt angive oplysningerne i den serielle sektion (Supplerende figur 1C) og definere sondekonfigurationen i trin 2.13.
- Klik på Næste, indstil mikroskopet til Lav forstørrelse, og vælg 10x forstørrelse i rullemenuen.
- Klik på Næste, og spor derefter rundt om hele æggestokkene sektion - start med venstre klikke rundt om afsnittet og i slutningen, skal du højreklikke og vælge Luk Contour.
- Klik på Næste, indstil mikroskopet til Høj forstørrelse, og vælg 100x Olieforstørrelse i rullemenuen.
- Placer en dråbe olie på vævssektionen på rutsjebanen, og flyt mikroskopmålet til 100x forstørrelse.
- Juster lyseksponeringen (som i trin 2.4), og klik på Næste.
- Konfigurer samplingparametrene for at definere sondekonfigurationen. Her blev tællerammen sat til 47,5 μm x 47,5 μm (2.256,25 μm2), og trinlængden blev indstillet til 100 μm x 100 μm (10.000 μm2) (Supplerende figur 2). Når prøvetagningsparametrene er fastlagt, skal du gemme skabelonen og genåbne under efterfølgende analysesessioner i trin 2.7.
- Klik på Start optælling ( Supplerendefigur 1D). Fokuser øverst i eksemplet, klik på OK, og begynd at tælle.
- Brug fokusknappen til at bevæge dig gennem prøvetagningsdybden på 10 μm og tælle eventuelle ursække, hvis oocytkerne kommer i fokus. Klik på Næste for at flytte til det næste område.
- Klassificere follikler som en urtale, hvis oocyten er omgivet af squamous (fladtrykte) granulosaceller, men ingen cuboide granulosaceller (Figur 2A).
BEMÆRK: Ursækkene adskiller sig fra mellemliggende/midlertidige follikler, som omfatter en kombination af cuboide og squamous granulosaceller (Figur 2B) og primære follikler, som overvejende er omgivet af cuboide granulosaceller (Figur 2C). Disse follikelklasser bør kvantificeres særskilt. - Tæl kun follikler, hvor oocytkernen er synlig. Oocytkernen skal være inden for tællerammen eller berøre tællerammens grønne medtagelseslinjer(Supplerende figur 1E,F).
- Hvis oocytkernen falder uden for tællerammen (Supplerende figur 1G) eller berører tællerammens røde udelukkelseslinjer, skal du ikke tælle denne follikel.
- Ved vurdering af udtømning af ursækken som reaktion på et eksogent kemikalie (f.eks. kemoterapi) skal man sikre, at alle optalte follikler er sunde og dermed har normal morfologi (figur 2). Tæl unormale eller atretiske follikler separat. Ofte fremkaldes follikeldød af fornærmelser som kemoterapi, og kvantificering af atretiske follikler bør opnås separat for at skelne mellem sunde og atretiske follikler, da kun sunde follikler omfatter æggestokkene15.
- Klassificere follikler som en urtale, hvis oocyten er omgivet af squamous (fladtrykte) granulosaceller, men ingen cuboide granulosaceller (Figur 2A).
- Når optællingen er fuldført på dette afsnit, skal du gøre et af følgende:
- Klik på Tilføj ny sektion, og vend derefter tilbage til trin 2.3 for at konfigurere det næste afsnit til optælling.
- Klik på Jeg er færdig med at tælle for at afslutte sessionen. Returner målet til 10x, afslut stereologisoftwaren, og sluk for lyskilden, kameraet, multikontrolenheden og computeren.
- Få summen rå follikel nummer (Q) fra hver væv sektion udtaget fra hele æggestokken, derefter ved hjælp af et regneark, skal du bruge ligningen nedenfor for at opnå den endelige værdi fra hver replikere dyr (N)4.
hvor:
N = Samlet anslået antal follikler i æggestokken.
Q = Rå ursækken.
f1 = Prøvetagningsinterval. Hver 3rd sektion blev samplet således
.
f2 = Forholdet mellem tællerammen (eksempelområdet) og stepperen, beregnet som
. Da prøveområdet var 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm), og stepperarealet var 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
f3 = Fraktion af æggestokkene afsnit udtaget. Da der blev udtaget prøver af 10 μm af afsnittet 20 μm,
.
Derfor
, .
BEMÆRK: Denne protokol beskriver, hvordan disse principper for stereologiske analyser anvendes ved hjælp af en meget citeret stereologisoftware (Tabel over materialer); Der findes dog anden stereologisk software. De principper, der anvendes under stereologiske analyser af æggestokkene follikler er de samme, uanset den software, der anvendes til at oprette parametre. Stereologi er mest nøjagtig, når 100 eller flere objekter tælles i en voksen mus æggestok4, da dette giver en fejlkoefficient for estimatet under 10%16. De her skitserede prøvetagningsparametre er blevet optimeret for at sikre, at mindst ca. 100 objekter (dvs. ur-, overgangs- og primærsække) kan tælles i kontrol af voksne vilde C57BL6J-æggestokke. Der kan gennemføres en pilotundersøgelse, herunder en lille stikprøvestørrelse, med henblik på at fastlægge de optimale prøvetagningsparametre, såsom intervallet og antallet af sektioner, der skal analyseres, og antallet af optiske dissektorer i de prøvedelens afsnit17.
hvor:
.
. Da prøveområdet var 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm), og stepperarealet var 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
.
, .3. Skøn over ursækken nummer ved direkte æggestokkene follikel tæller
- Placer mikroskopet glide sikkert under en standard lys mikroskop og udføre direkte tæller for at opnå rå ursækken nummer.
- Klassificere follikler som en urenal, hvis oocyten er tydeligt synlig og er omgivet af squamous (fladtrykte) granulosaceller, men ingen kuboide granulosaceller (Figur 2D).
BEMÆRK: Ursækkene adskiller sig fra mellemliggende/midlertidige follikler, som omfatter en kombination af cuboide og squamous granulosaceller (Figur 2E) og primære follikler, som overvejende er omgivet af cuboide granulosaceller (Figur 2F). Disse follikelklasser bør kvantificeres særskilt. - Sørg for, at alle tællede follikler er sunde og dermed har normal morfologi (figur 2). Tæl eventuelle unormale eller atretiske follikler separat, da kun sunde follikler omfatter æggestokkene reserve.
- Klassificere follikler som en urenal, hvis oocyten er tydeligt synlig og er omgivet af squamous (fladtrykte) granulosaceller, men ingen kuboide granulosaceller (Figur 2D).
- Alternativt kan du tage flere eller syede højeffekt (f.eks. 20x) fotomikrografer af hele æggestokkene for at udføre optællinger ved at åbne billedfilen eller billedfilerne. Dette kan gøres manuelt eller ved hjælp af en automatiseret slidescanner.
- Summen af rå follikelnummer (Q) fra hvert vævsafsnit, der er udtaget prøver af, fra hele æggestokken i det forudbestemte interval. Multiplicer dette tal med det modsatte af prøvetagningsfraktionen for at opnå den endelige værdi for hvert replikatdyr (N) ved hjælp af ligningen nedenfor.
hvor:
N = Samlet anslået antal follikler i æggestokken.
Q = Rå follikeltal (for hver enkelt type, beregnet separat).
f1 = Prøvetagningsinterval. Hver9. sektion blev således udtaget
prøver.
Derfor
, .
hvor:
prøver.
, .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der blev anvendt en velkarakterisk follikeludtømningsmodel, hvor unge voksne hunmus fik en enkelt dosis cyclophosphamide kemoterapi eller saltvandskontrol (n=5/gruppe), og begge æggestokke blev høstet fra hvert dyr efter 48 timer. En æggestok pr. dyr blev fremstillet som beskrevet i trin 1 for hver af de to metoder: stereologi eller direkte optællinger. Den venstre og højre æggestok fra hvert dyr blev tilfældigt tildelt hver gruppe. Disse data viser, at der ved brug af stereologi kan påvises en betydelig udtømning af ursække efter kemoterapibehandling (387 ± 11 follikler) versus kontrol (1043 ± 149; p=0,0024) (figur 3). I modsætning hertil kunne antallet af direkte follikelbehandlinger ved hjælp af de kontralaterale æggestokke fra de samme dyr ikke påvise en betydelig reduktion af æggestokkene efter kemoterapi (490 ± 40), sammenlignet med kontrol (752 ± 139; p=0,1063) (figur 3). Det skal bemærkes, at det er klart, at det oprindelige follikeltal hos unge voksne vilde dyr er variabelt, da fordelingen af saltvandsbehandlede dyr er bredere sammenlignet med cyclophosphamide-grupperne, selv når der blev foretaget optællinger ved hjælp af stereologi (Figur 3).
Figur 1: Histologisk forberedelse af Bouins faste, glycolmethacrylatharpiksindrettede æggestokke til stereoologisk analyse. A)En voksen mus æggestok (cirkel, pil) blev tæt trimmet af alt fedt og ovidukten fra musen æggestok ved hjælp af en fjer klinge. B)Kontralaterale muse æggestokke (cirkel, pil) fra den samme kvindelige voksne blev dissekeret, trimmet, derefter enten fast i Bouin's fikseringsmiddel (venstre) for stereologi, eller formalin for direkte tæller (højre). C) En specialiseret harpiks methacrylat mikrotomi D) udstyret med en glaskniv (pil) blev brugt til udtømmende at skære glycolmethacrylatharpiksblokke i 20 μm sektioner, indsamlet på glasmikroskop dias. E)Periodisk syre Schiff-farvede æggestokkene væv sektioner på glas mikroskop dias (pile) blev dyppet i frisk histolen (grøn beholder) i en røg hætte, så et glas coverlip blev tilføjet på toppen af dråber af GMA DPX. En spatel blev brugt til at fjerne overskydende DPX og luftbobler. Rutsjebaner blev lufttørret i røghætten natten over. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oprindelig follikelklassifikation. Repræsentative billeder af ur-, overgangs- og primærsækkene i glycolmethacrylatharpiks-indlejret (A-C) og paraffin-indlejrede (D-F) æggestokkene sektioner. A: Ursækken omgivet af squamous granulosa celler (pil). Bar = 10 μm. B: Overgangssækken omgivet af både squamous (pil) og kuboide (pilespids) granulosa celler. Bar = 10 μm. C: Primær follikel omgivet af kuboide (pilespids) granulosaceller. Bar = 25 μm. D: Ursækken omgivet af squamous granulosa celler (pil). Bar = 10 μm. E: Overgangssækken omgivet af både squamous (pil) og cuboidal (pilespids) granulosa celler. Bar = 10 μm. F: Primær follikel omgivet af kuboide (pilespids) granulosaceller. Bar = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af den optiske fraktioneringsenhed og direkte optællingsmetoder til vurdering af ursække. En veletableret model for udtømning af follikel blev anvendt som model, hvor 8 uger gamle kvindelige C57BL6J-mus blev behandlet intraperitoneally med saltvand eller en 75 mg/kg/kropsvægtdosis af kemoterapeutisk, cyclophosphamide (n=6/group). Dette gjorde det muligt at sammenligne de to follikeltællingsmetoder for at opdage ændringer i æggestokkene. I samme kohorte af dyr, samlede follikel skøn undladt at opdage betydelig follikel udtømning, i modsætning til stereologi, som opdagede en større og betydelig udtømning af æggestokkene reserve. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Styrker | svagheder | |
| Stereologi | Mest nøjagtige måde at estimere follikler på | Tidskrævende og dyrt |
| Bruger flere prøvetagningsparametre, hvilket gør det statistisk robust | Kræver ekspertudstyr og -software | |
| Meget følsomme, kan opdage mindre ændringer i ursækken numre | Prøverne skal fremstilles ved hjælp af specifikke, specialiserede histologiske teknikker | |
| Follikelstrukturen bevares bedre under vævsbehandling | ||
| Ensartede regler, der kan anvendes af forskellige efterforskere, hvilket reducerer bias | ||
| DIREKTE OPTÆLLINGER | Tid og omkostningseffektiv | Mindre præcis og følsom end stereologi |
| Kræver standardlaboratorieudstyr, f.eks. | Der anvendes kun én prøvetagningsparameter, hvilket gør den mindre effektiv til at detektere små ændringer i follikelnumrene | |
| Opbevaring af æggestokkene sektioner, der kan bruges til immunohistokemiske eller andre analyser | Væv er mere modtageligt for ændringer i volumen og follikelstruktur under behandlingen | |
| Ingen ensartet sæt regler, der kan anvendes, og dermed mere tilbøjelige til bias fra investigator |
Tabel 1: Sammenligning af styrker og svagheder ved follikeltællingsmetoder: stereologi vs. direkte optællinger.
Supplerende figur 1: Skærmbilleder af softwareprotokollen til stereologi. a)Juster eksponeringen ved at markere Automatisk (rød boks) under Eksponering i panelet Kameraindstillinger (hvid boks). B) Indstil hvidbalancen ved først at klikke på ikonet Flere indstillinger under Andet i panelet Kameraindstillinger. Vælg derefter Hvidbalance, og klik på Automatisk (rød boks). C) Hvis der ikke er angivet en eksisterende stikprøvekonfiguration, skal du klikke på Nej (rød boks) og angive oplysningerne om den serielle sektion (grøn boks). D) Klik på Start optælling (hvid pil) for at begynde at tælle. E)Hvis kernen i en ursække er synlig inden for tællerammen, tælles denne follikel (hvid prikket cirkel). F)Hvis kernen i en ursækken rører de grønne inklusionslinjer i tællerammen, tælles denne follikel også (hvid prikket cirkel). G) Hvis kernen i en ursække ikke er synlig inden for tællerammen eller berører tællerammens røde udelukkelseslinjer, tælles denne follikel ikke (hvid prikket cirkel). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Opsætning af stikprøveparametrene. Følg sekventielle trin i panelet til venstre for at definere probekonfigurationen. A)Mål monteret tykkelse. Sørg for, at 'Refokuser til toppen af sektionen på hvert gittersted' ikke er markeret (rød boks). Sæt kryds i 'Angiv den gennemsnitlige monterede tykkelse manuelt' (grøn boks). Angiv den gennemsnitlige monterede tykkelse som 20,00 μm (blå boks). B) Definer optællingsrammestørrelsen. Under Optællingsrammevisning skal du markere 'Tving optællingsrammedisplayet til at være firkantet' og 'Centrer på live-billede' (rød boks). Under Optælling af rammestørrelse skal du indtaste 47,5 μm for X og Y (grøn boks). C) Definer SRS-gitterlayout. Angiv gitterstørrelsen manuelt som 110 for X og Y (rød boks). D) Definer dissektorindstillinger. For topbeskytterzonehøjde skal du indtaste 1,00 μm (rød boks). For optisk dissektorhøjde skal du indtaste 10 μm (grøn boks). Vælg 'Manuel fokus' (blå boks) under Fokusmetode. E)Gem prøvetagningsparametre. Hvis du vil gemme disse indstillinger, skal du skrive et navn og en kommentar og derefter klikke på 'Gem dine aktuelle indstillinger' (hvid pil). F) Sørg for, at indstillingerne stemmer overens med de viste indstillinger under Indstillinger for aktuel samplingparametre. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende sagsakter 1. Klik her for at hente denne fil.
Supplerende sagsakter 2. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel indeholder en trinvis protokol for guldstandardteknikken til optælling af museprimordiale follikler, stereologi og den mere almindeligt anvendte metode til direkte follikeltælling. Kemoterapibehandling blev brugt til at sammenligne og kontrastere resultaterne fra disse to forskellige metoder inden for venstre og højre æggestok fra samme dyr. Begge metoder afslørede høj variation mellem dyr i ursækken. En betydelig udtømning af æggestokkene reserve blev registreret ved hjælp af stereologi, men direkte optælling undladt at opdage en betydelig reduktion i ursækken nummer efter kemoterapi administration versus kontrol.
Især er det klart, at selv i en indavlet stamme af mus, såsom C57BL6J, er æggestokkene reserve i unge voksne vilde type (kontrol) kvinder bredt fordelt, som det er tilfældet hos mennesker. Faktorer , der påvirker dette og bidrager til oprettelsen af æggestokkene reserve fortsat er under efterforskning18. Høj variation blandt undersøgelser af mus æggestokkene funktion udgør en lang række udfordringer for området at sammenligne, eller kopiere data og at fremme klinisk oversættelse af nye behandlingsforanstaltninger for at beskytte oocyt nummer og kvalitet4. Denne variation skyldes sandsynligvis en række faktorer, herunder ikke blot de anvendte optællingsmetoder, men også yderligere faktorer såsom forskelle mellem dyrestamme og alder; behandlingsregimer, såsom dosis og timing. Disse faktorer skal alle tages i betragtning, når man sammenligner data fra forskellige undersøgelser. Uanset hvad fremhæver den follikeludtømningsmodel, der anvendes i denne undersøgelse, generelt den nøjagtige og følsomme karakter af stereologiprotokollen, samtidig med at den viser, at den bredt rapporterede metode til direkte optællinger ikke er i stand til at opdage en kendt signifikant grundlæggende follikeludtømning.
Der er styrker og begrænsninger ved hver optællingsmetode, der er beskrevet i denne artikel (tabel 1). Stereologi betragtes som guldstandardmetoden på grund af dens nøjagtighed, når den bruges til at bestemme cellenummer i en række forskellige organer5. Ulemper ved denne teknik omfatter imidlertid den tid og de omkostninger, der er involveret, samt kravet om specialiseret udstyr og ekspertise. Tilsammen har dette begrænset den udbredte anvendelse af denne procedure til at indhente de mest følsomme data.
I modsætning hertil er den direkte tæller metode hurtig, let, kan gøres ved hjælp af arkiverede væv, og udarbejdes ved hjælp af standard histologiske teknikker. Det kræver kun et let mikroskop med standard billedbehandling kapaciteter. Det tager dog ikke højde for volumenændringer forårsaget af histologisk behandling, hvilket kan forstyrre æggestokkens tredimensionelle struktur. Derfor er follikelmorfologi ikke altid tilstrækkeligt bevaret, hvilket gør identifikation og optælling nøjagtighed udfordrende, især for uerfarne efterforskere. Mens formalin var fikseringsmiddel, der anvendes til direkte tæller i denne undersøgelse, Bouin's-faste væv kan indlejres i paraffin, og dette kan give bedre morfologi og hjælpe forskere til lettere at identificere ursække. Inden for litteraturen varierer prøvetagningsfraktionerne for metoden med direkte optællinger meget, lige fra hver3. I betragtning af at paraffin voks sektioner er så tynde, tælle hver 9th sektion hjælper med at forhindre oversampling og unødvendig optælling.
Yderligere metoder, der ikke er skitseret i denne vejledning, men som almindeligvis rapporteres i litteraturen, tæller kun i et centralt afsnit fra hele æggestokken og betragter dette som repræsentativt for hele æggestokken eller follikeltætheden. Denne første metode er meget problematisk, da ursække ikke er jævnt fordelt i æggestokken og kan findes i klynger. Det betyder, at en enkelt eller endda nogle få afsnit af æggestokken ikke er repræsentative for hele organet, hvilket gør systematisk prøveudtagning til en væsentlig komponent for enhver optællingsmetode. Follikeltæthed indebærer optælling follikler i en æggestokke vævsprøve, derefter udtrykke tæller per område af væv. I betragtning af begrænsningerne ved at opnå primært humant væv, follikeltæthed bruges ofte som en surrogat foranstaltning for absolut follikel nummer i human æggestokken, selv om rapporter hos mus er også almindelige. Denne kvantificeringsmetode tager imidlertid ikke højde for den ujævne fordeling af follikler i hele æggestokkene eller udsving i æggestokkenes volumen, som forekommer rutinemæssigt i hele æggestokkene endokrine (luteal) cyklus. Dette er vigtigt, fordi et nøjagtigt mål for massefylde blandt prøverne er afhængig af bevaret vævsområde. Desuden prøver denne metode ofte kun en lille biopsi eller brøkdel af æggestokken, når man analyserer humane væv, og er derfor ikke repræsentativ for hele æggestokken. Follikeltæthed mangler nøjagtigheden opnåelig med stereologi. Selv ved hjælp af samme hele æggestok svarede sammenlignende målinger af follikelkvantificering efter stereoologisk analyse med follikeltæthed ikke i muse æggestokke20.
Selvom det er det mest anvendte eksperimentelle dyr, er musen kun en modelart. Det er muligt at opnå æggestokke fra større arter, herunder husdyr eller ikke-menneskelige primater, således at follikeltællinger fra hele æggestokkene kan opnås ved hjælp af en modificeret stereologisk protokol21,22. Endelig, mens evnen til at analysere follikeltal i hele menneskelige æggestokke faktisk er meget vanskelig, kan det ikke desto mindre gøres, når prøver er tilgængelige, ved hjælp af en modificeret stereologisk protokol23,24,25.
Fremtidige retninger på området kan omfatte udvidelse og anvendelse af nye teknikker. For eksempel er en ny metode til automatiseret detektion og optælling for ursækkepinde blevet beskrevet26. Denne metode bruger convolutional neurale netværk drevet af mærkede datasæt og en glidende vinduesalgoritme til at vælge testdata. Denne algoritme blev dog kun testet over to æggestokke, og der er stadig meget, der skal bestemmes. Alternativt har de seneste fremskridt inden for optisk væv clearing og lys ark mikroskopi tilladt omfattende analyse af intakt væv og nogle undersøgelser har undersøgt dette for follikel opregning i musen æggestokken27,28.
Afslutningsvis, mens direkte follikeltælling er en nem, hurtig og omkostningseffektiv metode til opregning af ursække i æggestokken, kan denne teknik mangle følsomhed, nøjagtighed og være tilbøjelig til at undersøge bias. Derfor er stereologi på trods af sine ulemper stadig den bedste tilgængelige teknik til nøjagtigt og reproducerbart at definere oprindelige follikelnumre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev muliggjort gennem victorianske statslige regering operationelle infrastrukturstøtte og australske regering NHMRC IRIISS og støttet af midler fra National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) og australske Research Council (KJH #FT190100265). Forfatterne vil gerne anerkende den tekniske støtte fra Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform og Monash Micro Imaging facilitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
