Summary
Hier beschrijven, vergelijken en contrasteren we twee verschillende technieken voor het nauwkeurig tellen van de follikels van vaste eierstokweefsels van muizen.
Abstract
Seksueel voortplantende vrouwelijke zoogdieren worden geboren met hun hele leven voorraad oöcyten. Onrijpe, rustgevende oöcyten worden gevonden in primordiale follikels, de opslageenheid van de vrouwelijke kiembaan. Ze zijn niet-hernieuwbaar, dus hun aantal bij de geboorte en het daaropvolgende verliespercentage dicteert grotendeels de vruchtbare levensduur van de vrouw. Nauwkeurige kwantificering van primordiale follikels bij vrouwen en dieren is essentieel voor het bepalen van de impact van geneesmiddelen en toxische stoffen op het eierstokreservaat. Het is ook noodzakelijk voor het evalueren van de behoefte aan en het succes van bestaande en opkomende vruchtbaarheidsbehoudstechnieken. Momenteel bestaan er geen methoden om het aantal primordiale follikels dat de eierstokreserve bij vrouwen omvat, nauwkeurig te meten. Bovendien is het verkrijgen van eierstokweefsel van grote dieren of bedreigde soorten voor experimenten vaak niet haalbaar. Muizen zijn dus een essentieel model geworden voor dergelijke studies en het vermogen om primordiale follikelnummers in hele eierstokken van muizen te evalueren is een cruciaal hulpmiddel. Rapporten van absolute follikelgetallen in de eierstokken van muizen in de literatuur zijn echter zeer variabel, waardoor het moeilijk is om gegevens te vergelijken en / of te repliceren. Dit is te wijten aan een aantal factoren, waaronder spanning, leeftijd, behandelingsgroepen, evenals technische verschillen in de gebruikte telmethoden. In dit artikel bieden we een stapsgewijze instructiegids voor het voorbereiden van histologische secties en het tellen van primordiale follikels in muiseierstokken met behulp van twee verschillende methoden: [1] stereologie, die afhankelijk is van de fractionator / optische dissectortechniek; en [2] de directe tellingstechniek. Enkele van de belangrijkste voor- en nadelen van elke methode zullen worden benadrukt, zodat de reproduceerbaarheid in het veld kan worden verbeterd en onderzoekers in staat worden gesteld de meest geschikte methode voor hun studies te selecteren.
Introduction
De onrijpe, meiotically-gearresteerde oöcyten die in primordiale follikels in de eierstok worden opgeslagen zijn de opslageenheid voor de vrouwelijke kiembaan en omvatten de het leven eierstokreserve van een individu. Primordiale follikels nemen op natuurlijke wijze af met de leeftijdvan 1jaar, of kunnen als alternatief voortijdig worden uitgeput na blootstelling aan exogene chemicaliën, waaronder sommige geneesmiddelen en milieutoxische stoffen in lucht, voedsel en water2. Aangezien het primordiale follikelgetal eindig is, bepalen de hoeveelheid en kwaliteit van de follikels in de eierstok grotendeels de vrouwelijke vruchtbaarheid en de gezondheid van nakomelingen. Nauwkeurige kwantificering van het primordiale follikelgetal bij vrouwen is dus essentieel voor het evalueren van de off-target effecten van exogene beledigingen op de ovariële reserve.
Bij vrouwen is analyse van de hele eierstok over het algemeen niet mogelijk, dus niet-invasieve surrogaatmetingen van de eierstokreserve moeten in een klinische omgeving worden gebruikt. Anti-Mħllerian hormoon (AMH) is de meest gebruikte surrogaat biomarker klinisch3. Serum AMH-spiegels worden vaak gemeten bij vrouwen van gevorderde leeftijd van de moeder, of voor en na de behandeling van kanker, zoals chemotherapie. AMH wordt echter geproduceerd door groeiende follikels en niet door primordiale follikels, en dus informeren serumspiegels niet over het absolute primordiale follikelgetal.
Met de afwezigheid van methoden om het primordiale follikelgetal bij vrouwen in situnauwkeurig te bepalen, blijft het tellen van ovariële follikels in kleine diermodellen, zoals knaagdieren, een essentieel onderzoeksinstrument om de mate te beoordelen waarmee exogene beledigingen invloed hebben op primordiale follikels en dus vruchtbaarheid. Helaas zijn rapporten in de literatuur van primordiale follikelgetallen in knaagdiermodellen zeer variabel4. Een belangrijke reden hiervoor zijn de wijdverspreide technische verschillen in de toegepaste telmethode. In de literatuur worden twee verschillende technieken beschreven voor het opsommen van primordiale follikels bij muizen. Deze omvatten stereologie, die de fractionator optische dissector methode gebruikt, en directe follikeltellingen.
Stereologie wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard omdat het systematische uniforme willekeurige bemonsteringgebruikt 5, waardoor het de meest nauwkeurige methode is om primordiaal follikelgetal in hele muis te kwantificeren, of ratteneierstokken4,6,7. Stereologie is onbevooroordeeld, omdat het de driedimensionale structuur van het object van belangverklaart 8. Met behulp van een optische dissector/fractionatormethode worden drie bemonsteringsniveaus toegepast om primordiale follikels te kwantificeren met behulp van dikke weefselsecties (bv. 20 μm) binnen een bekende fractie van de totale eierstok van de muis. Ten eerste wordt het bemonsteringsinterval gekozen (bv. elke3e sectie) bij een willekeurige start (bemonsteringsfractie 1, f1)4. Secties worden vervolgens vanaf dit punt op een systematische, uniforme manier door de hele eierstok bemonsterd. Vervolgens wordt een onbevooroordeeld telkader over de eierstoksectie gesupercipeerd en geleidelijk verplaatst langs een gedefinieerd, gerandomiseerd telraster (bemonsteringsfractie 2, f2)8. Ten slotte wordt een bekende fractie van de doorsnededikte optisch bemonsterd (bv. 10 μm) en worden follikels in dit gebied geteld (bemonsteringsfractie 3, f3)4. Het ruwe follikelgetal wordt vermenigvuldigd met de inverse van deze bemonsteringsfracties om de eindwaarde te verkrijgen. Deze methode vereist deskundige training en apparatuur, waaronder een microscoop met een gemotoriseerd podium aangedreven door stereologische software. Weefsels moeten worden bewaard in het fixatieve van een gespecialiseerde Bouin en ingebed in glycolmethacrylaathars om dikke weefselsecties te kunnen snijden met behulp van een microtome van glycolmethacrylaathars met een glazen mes. Deze methode is ontworpen om weefselkrimp en vervorming te verklaren, om de driedimensionale morfologische structuur van de eierstok en follikels het beste te behouden9.
Direct follikeltelling is de meest gebruikte methode voor het tellen van follikels10. Meer voorkomende fixatieven (d.w.z. formaline) kunnen worden gebruikt, gevolgd door inbedding van paraffinewas en uitputtende seriële doorsneden met behulp van een standaardmicrotome met een dikte tussen 4-6 μm. Follikels worden systematisch geteld in de gehele weefselsectie met een bepaald interval en vervolgens vermenigvuldigd met de inverse van het bemonsteringsinterval om de totale follikelraming te verkrijgen. Deze methode is snel, eenvoudig, kan worden uitgevoerd met behulp van gearchiveerde weefsels en worden bereid met behulp van standaard histologische technieken. Het vereist alleen een lichtmicroscoop met standaard beeldvormingsmogelijkheden. Ondanks deze voordelen mist direct follikeltelling echter de nauwkeurigheid en strikte telparameters van stereologie, waardoor het vatbaarder is voor onderzoeksbias. Bovendien kunnen weefsels krimp en vervorming ondergaan tijdens de verwerking, waardoor de integriteit en morfologie van de eierstok worden verstoord en follikelclassificatie en kwantificering moeilijk worden.
Het doel van dit artikel is om twee veelgebruikte methoden te beschrijven om het primordiale follikelgetal in de eierstokken van muizen kwantitatief te beoordelen: stereologie en directe follikeltelling. We zullen gedetailleerde protocollen voor deze twee methoden verstrekken en enkele van hun sterke en zwakke punten benadrukken, om de reproduceerbaarheid in ons vakgebied te verbeteren en onderzoekers in staat te stellen een weloverwogen beslissing te nemen over de meest geschikte telmethode voor hun studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eierstokken werden verzameld van vrouwelijke C57BL6J muizen. Alle dierprocedures en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de NHMRC Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals en goedgekeurd door de Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.
OPMERKING: In dit rapport werd een chemotherapiemiddel gebruikt om primordiale follikeloöcyten uit te putten, zoals bepaald met stereologie11 en directe tellingen12,13. Vrouwelijke, 8 weken oude (jongvolwassen) muizen werden gewogen voorafgaand aan een enkele intraperitoneale injectie van 75 mg/kg/lichaamsgewicht van cyclofosfamide, of controle van het zoutgehalte van het voertuig (n=5/groep). Van deze dosis is aangetoond dat deze ongeveer 50% uitputting van primordiale follikels veroorzaakt, maar er is niet gemeld dat deze morbiditeit of mortaliteit bij muizen veroorzaken14. Eierstokken werden 48 uur na de behandeling geoogst. Eén eierstok van elk dier werd gedurende 24 uur in 10% (v/v) neutrale gebufferde formalineoplossing gefixeerd en de andere gedurende 24 uur in bouins oplossing. Weefsel werd vervolgens ingebed in glycolmethacrylaathars en serieel gesectied op 20 μm, of in paraffine en serieel gesectied bij 5 μm. Alle weefsels waren bevlekt met periodiek zuur Schiff en hematoxyline.
1. Histologische voorbereiding: fixatie, verwerking, inbedding en doorsnijden van de eierstokken van muizen
- Ontleed de eierstokken van de muis door de eileider en al het omringende vet bij te snijden, zonder de eierstok zelf te beschadigen of te snijden. Gebruik indien nodig een ontleedmicroscoop en een fijn mes voor deze stap (figuur 1A).
- Fixeer weefsels onmiddellijk door ze gedurende 24 uur in een klein gelabeld buisje te plaatsen dat bouins fixatief (stereologie) of formalinefixatief (directe tellingen) bevat(figuur 1B),voordat u weefsels in 70% ethanol overbrengt.
OPMERKING: Follikelmorfologie wordt het best bewaard in bouins vaste eierstokweefsel, ingebed in glycolmethacrylaathars (figuur 2). - Verwerk hele vaste eierstokken en integreer vervolgens in glycolmethacrylaathars voor stereologie(Aanvullend dossier 1),of paraffinewas voor directe tellingen met behulp van een standaard histologisch protocol.
LET OP: Hars is giftig, dus zorg ervoor dat alle weefselverwerkingsstappen worden uitgevoerd in een zuurkast en handschoenen te allen tijde worden gedragen. - Gebruik een gespecialiseerde harsmethacrylaatmicrotome (figuur 1C) uitgerust met een glasmes (figuur 1D) om dikke glycolmethacrylaatharssecties (bijv. 20 μm) uitputtend te snijden. Verzamel de secties met een regelmatig interval (bijv. elke3e sectie) op glazen microscoopdia's voor stereologie.
- Gebruik een standaard microtome om dunne paraffinesecties te snijden (bijv. 4-6 μm). Verzamel weefselsecties met een regelmatig interval (bijv. elke9e sectie) op een glazen microscoopschuif voor directe follikelstellingen.
- Bevlek de dia's met periodiek zuur Schiff en hematoxyline (Aanvullend Dossier 2).
- Coverslip met standaard DPX voor paraffinesecties, of dikke DPX voor glycolmethacrylaatharssecties (figuur 1E).
LET OP: Glycolmethacrylaathars DPX is gevaarlijk, dus voer deze stap in de zuurkast uit.
OPMERKING: Glycolmethacrylaathars DPX is extreem stroperig. De glazen afdeklip moet stevig worden vastgekleefd door deze met een spatel naar beneden te drukken om ervoor te zorgen dat de DPX gelijkmatig en dun is verspreid en er geen luchtbellen onder de afdeklip aanwezig zijn (figuur 1F).
2. Stereologische schatting van het primordiale follikelgetal met behulp van de optische fractionator
- Schakel de computer, de multibesturingseenheid, de camera en de lichtbron in de stereologie-opstelling in en stel de microscoopdoelstelling in op een lage vergroting (bijv. 10x).
- Open de stereologiesoftware.
- Plaats de eerste dia stevig op het microscoopstadium.
- Pas de belichting van het licht aan door Automatisch te controleren onder Belichting in het paneel Camera-instellingen (Aanvullende figuur 1A). U kunt ook de lichtblootstelling handmatig aanpassen.
- Gebruik de joystick om het eerste weefselmonster te lokaliseren en het monster scherp te stellen.
- Pas de witbalans aan door op Meer instellingen te klikken (rechtsonder in het deelvenster Camera-instellingen) en klik vervolgens op Witbalans en klik op Automatisch ( Aanvullendeafbeelding 1B). U kunt ook op de knop Witbalans naast de knop Meer instellingen (of Gebied selecteren in meer instellingen)klikken om de witbalans handmatig in te stellen door een wit gebied in de sectie te selecteren.
- Ga naar het vervolgkeuzemenu Probes en klik op Optische fractionatorworkflow. Klik vervolgens op Nieuw project starten en klik op OK.
- Als een bestaande bemonsteringsconfiguratie is opgeslagen, klikt u onder Bemonsteringsparameters op Ja | ... en selecteer de gewenste bemonsteringsconfiguratie.
- Zo niet, klik dan op Nee en voer handmatig de seriële sectiegegevens in (Aanvullende figuur 1C) en definieer de sondeconfiguratie bij stap 2.13.
- Klik op Volgende, stel de microscoop in op Lage vergroting en kies 10x vergroting in het vervolgkeuzemenu.
- Klik op Volgendeen traceer vervolgens het hele eierstokgedeelte - begin met de linkermuisknop rond de sectie te klikken en klik aan het einde met de rechtermuisknop en kies Contour sluiten.
- Klik op Volgende, stel de microscoop in op Hoge vergroting en kies 100x olievergroting in het vervolgkeuzemenu.
- Plaats een druppel olie op het weefselgedeelte op de dia en verplaats het microscoopdoel naar 100x vergroting.
- Pas de lichtblootstelling aan (zoals in stap 2.4) en klik op Volgende.
- Stel de bemonsteringsparameters in om de testconfiguratie te definiëren. Hier werd het telkader ingesteld op 47,5 μm x 47,5 μm (2.256,25 μm2) en werd de staplengte ingesteld op 100 μm x 100 μm (10.000 μm2) (Aanvullend figuur 2). Zodra de bemonsteringsparameters zijn vastgesteld, slaat u de sjabloon op en opent u deze opnieuw tijdens volgende analysesessies in stap 2.7.
- Klik op StartTelling (Aanvullende figuur 1D). Focus naar de bovenkant van het monster, klik op OK en begin met tellen.
- Gebruik de scherpstelknop om door de bemonsteringsdiepte van 10 μm te gaan en eventuele primordiale follikels te tellen waarvan de oöcytkern in beeld komt. Klik op Volgende om naar het volgende gebied te gaan.
- Classificeer follikels als een primordiaal als de oöcyt is omgeven door plaveiselcellen (afgeplatte) granulosacellen, maar geen cuboïdale granulosacellen (figuur 2A).
OPMERKING: Primordiale follikels onderscheiden zich van intermediaire/overgangsfollikels, die bestaan uit een combinatie van cuboïdale en plaveiselgranulosacellen (figuur 2B) en primaire follikels, die voornamelijk worden omgeven door cuboïdale granulosacellen (figuur 2C). Deze follikelklassen moeten afzonderlijk worden gekwantificeerd. - Tel alleen follikels waarin de oöcytkern zichtbaar is. De oöcytkern moet in het telkader verschijnen of de groene insluitlijnen van het telkader raken (Aanvullende figuur 1E,F).
- Als de oöcytkern buiten het telkader valt (Aanvullende figuur 1G) of de rode uitsluitingslijnen van het telframe raakt, tel deze follikel dan niet.
- Let er bij de beoordeling van primordiale follikeldepletie op een exogene chemische stof (bijv. chemotherapie) op dat alle getelde follikels gezond zijn en dus een normale morfologie hebben (Figuur 2). Tel eventuele abnormale of atretische follikels afzonderlijk. Vaak wordt follikeldood veroorzaakt door beledigingen zoals chemotherapie, en kwantificering van de atretische follikels moet afzonderlijk worden verkregen om onderscheid te maken tussen gezonde en atretische follikels, omdat alleen gezonde follikels de eierstokreserve vormen15.
- Classificeer follikels als een primordiaal als de oöcyt is omgeven door plaveiselcellen (afgeplatte) granulosacellen, maar geen cuboïdale granulosacellen (figuur 2A).
- Zodra het tellen op die sectie is voltooid, voert u een van de volgende handelingen uit:
- Klik op Nieuwe sectie toevoegenen ga vervolgens terug naar stap 2.3 om de volgende sectie in te stellen voor het tellen.
- Klik op Ik ben klaar met tellen om de sessie te beëindigen. Zet het objectief terug op 10x, sluit de stereologiesoftware af en schakel de lichtbron, camera, multi-control unit en computer uit.
- Verkrijg de som ruw follikelgetal (Q) van elke weefselsectie die uit de gehele eierstok is bemonsterd en gebruik vervolgens een spreadsheet, gebruik de onderstaande vergelijking om de uiteindelijke waarde van elk gerepliceerd dier (N) te verkrijgen4.
waar:
N = Totaal geschat aantal follikels in de eierstok.
Q = Ruwe primordiale follikeltelling.
f1 = Bemonsteringsinterval. Elke 3rd sectie werd bemonsterd dus
.
f2 = Relatie tussen het telframe (monstergebied) en de stappenmotor, berekend als
. Aangezien het monsteroppervlak 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) was en het stappengebied 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
f3 = Fractie van de bemonsterde eierstoksectie. Aangezien 10 μm van de 20 μm-sectie werd bemonsterd,
.
Daarom.
OPMERKING: Dit protocol beschrijft hoe deze principes van stereologische analyses kunnen worden toegepast met behulp van een veel geciteerde stereologiesoftware (Table of Materials); er is echter andere stereologische software beschikbaar. De principes die worden toegepast bij stereologische analyses van ovariële follikels zijn hetzelfde, ongeacht de software die wordt gebruikt om de parameters in te stellen. Stereologie is het nauwkeurigst wanneer 100 of meer objecten worden geteld in een volwassen muiseierstok4, omdat dit een foutcoëfficiënt geeft voor de schatting onder 10%16. De hier beschreven bemonsteringsparameters zijn geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat minimaal ongeveer 100 objecten (d.w.z. primordiale, overgangs- en primaire follikels) kunnen worden geteld in controle volwassen wild-type C57BL6J eierstokken. Er kan een proefstudie worden uitgevoerd met inbegrip van een kleine steekproefgrootte om de optimale bemonsteringsparameters vast te stellen, zoals het interval en het aantal te analyseren secties en het aantal optische dissectoren binnen de bemonsterde secties17.
waar:
.
. Aangezien het monsteroppervlak 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) was en het stappengebied 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
.
3. Schatting van primordiaal follikelgetal door directe ovariële follikeltellingen
- Plaats de microscoopschuif stevig onder een standaard lichtmicroscoop en voer directe tellingen uit om een ruw primordiaal follikelnummer te verkrijgen.
- Classificeer follikels als een primordiaal als de oöcyt duidelijk zichtbaar is en is omgeven door plaveiselcellen (afgeplatte) granulosacellen, maar geen cuboïdale granulosacellen (figuur 2D).
OPMERKING: Primordiale follikels onderscheiden zich van intermediaire/overgangsfollikels, die bestaan uit een combinatie van cuboïdale en plaveiselgranulosacellen (figuur 2E) en primaire follikels, die voornamelijk worden omgeven door cuboïdale granulosacellen (figuur 2F). Deze follikelklassen moeten afzonderlijk worden gekwantificeerd. - Zorg ervoor dat alle getelde follikels gezond zijn en dus een normale morfologie hebben (figuur 2). Tel eventuele abnormale of atretische follikels afzonderlijk, omdat alleen gezonde follikels de ovariële reserve vormen.
- Classificeer follikels als een primordiaal als de oöcyt duidelijk zichtbaar is en is omgeven door plaveiselcellen (afgeplatte) granulosacellen, maar geen cuboïdale granulosacellen (figuur 2D).
- U kunt ook meerdere of gestikte krachtige (bijv. 20x) fotomicrografen van de hele eierstokweefselsectie nemen om tellingen uit te voeren door het afbeeldingsbestand(en) te openen. Dit kan handmatig of met behulp van een geautomatiseerde diascanner.
- Verkrijg het som ruwe follikelgetal (Q) van elke weefselsectie die met het vooraf bepaalde interval uit de hele eierstok is bemonsterd. Vermenigvuldig dit getal met de inverse van de bemonsteringsfractie om de eindwaarde voor elk gerepliceerd dier (N) te verkrijgen met behulp van de onderstaande vergelijking.
waar:
N = Totaal geschat aantal follikels in de eierstok.
Q = Aantal ruwe follikels (van elk afzonderlijk type, afzonderlijk berekend).
f1 = Bemonsteringsinterval. Elke9 e sectie werd zo bemonsterd
.
Daarom.
waar:
.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er werd een goed gekarakteriseerd model van follikeldepletie gebruikt, waarbij jonge volwassen vrouwelijke muizen een enkele dosis cyclofosfamide chemotherapie of zoutoplossing (n=5/groep) kregen toegediend en beide eierstokken na 48 uur van elk dier werden geoogst. Eén eierstok per dier werd bereid zoals beschreven in stap 1 voor elk van de twee methoden: stereologie of directe tellingen. De linker- en rechter eierstok van elk dier werd willekeurig toegewezen aan elke groep. Deze gegevens tonen aan dat bij gebruik van stereologie een significante uitputting van de primordiale follikels van de muis kan worden gedetecteerd na chemotherapiebehandeling (387 ± 11 follikels), versus controle (1043 ± 149; p=0,0024) (Figuur 3). Daarentegen werd bij gebruik van de contralaterale eierstokken van dezelfde dieren bij directe follikels geen significante vermindering van de eierstokreserve na chemotherapie (490 ± 40) waargevonden in vergelijking met de controle (752 ± 139; p=0,1063) (figuur 3). Het is duidelijk dat het primordiale follikelgetal bij jongvolwassen wilde dieren variabel is, omdat de verdeling van de met zoutoplossing behandelde dieren breder is in vergelijking met de cyclofosfamidegroepen, zelfs wanneer tellingen werden uitgevoerd met behulp van stereologie (figuur 3).
Figuur 1: Histologische voorbereiding van Bouins vaste, glycolmethacrylaathars-ingebedde eierstokken voor stereologische analyse. A) Een volwassen muis eierstok (cirkel, pijl) werd nauw bijgesneden van al het vet en de eileider van de muis eierstok met behulp van een veerblad. B) Contralaterale muiseierstokken (cirkel, pijl) van dezelfde vrouwelijke volwassene werden ontleed, bijgesneden en vervolgens bevestigd in Bouins fixatief (links) voor stereologie, of formaline voor directe tellingen (rechts). C) Een gespecialiseerde harsmethacrylaatmicrotome D) uitgerust met een glasmes (pijl) werd gebruikt om glycolmethacrylaatharsblokken uitputtend in secties van 20 μm te snijden, verzameld op glazen microscoopglaasjes. E) Periodieke zure Schiff-gebrandschilderde eierstokweefselsecties op glazen microscoopglaasjes (pijlen) werden ondergedompeld in vers histoleen (groene container) in een zuurkap, waarna een glazen afdeklip bovenop druppels GMA DPX werd toegevoegd. Een spatel werd gebruikt om overtollige DPX en luchtbellen te verwijderen. Dia's werden 's nachts aan de lucht gedroogd in de zuurkast. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Primordiale follikelclassificatie. Representatieve afbeeldingen van primordiale, overgangs- en primaire follikels in glycolmethacrylaathars-embedded (A-C) en paraffine-embedded (D-F) ovariële secties. A: Primordiale follikel omgeven door plaveiselgranulosacellen (pijl). Bar = 10 μm. B: Overgangsfollikel omgeven door zowel plaveiselcellen (pijl) als cuboïdale granulosacellen ( pijlpunt). Bar = 10 μm. C: Primaire follikel omgeven door cuboïdale (pijlpunt) granulosacellen. Bar = 25 μm. D: Primordiale follikel omgeven door plaveiselgranulosacellen (pijl). Bar = 10 μm. E: Overgangsfollikel omgeven door zowel plaveiselcellen (pijl) als cuboïdale granulosacellen (pijlpunt). Bar = 10 μm. F: Primaire follikel omgeven door cuboïdale (pijlpunt) granulosacellen. Bar = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van de optische fractionator en directe telmethoden om de primordiale follikels van de muis te evalueren. Een bekend model van follikeldepletie werd gebruikt als model, waarbij 8 weken oude vrouwelijke C57BL6J muizen intraperitoneaal werden behandeld met zoutoplossing, of een dosis van 75 mg/kg/lichaamsgewicht van de chemotherapeutische, cyclofosfamide (n=6/groep). Dit maakte het mogelijk om de twee follikeltellingsmethoden te vergelijken om veranderingen in de ovariële reserve te detecteren. In hetzelfde cohort van dieren slaagden de totale follikelschattingen er niet in om significante follikeldepletie te detecteren, in tegenstelling tot stereologie die een grotere en significante uitputting van het ovariële reservaat detecteerde. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| sterktes | Zwakke punten | |
| STEREOLOGIE | Meest nauwkeurige manier om follikels te schatten | Tijdrovend en kostbaar |
| Maakt gebruik van verschillende bemonsteringsparameters, waardoor het statistisch robuust is | Vereist deskundige apparatuur en software | |
| Zeer gevoelig, kan kleinere veranderingen in primordiale follikelgetallen detecteren | Monsters moeten worden bereid met behulp van specifieke, gespecialiseerde histologische technieken | |
| Follikelstructuur wordt beter bewaard tijdens weefselverwerking | ||
| Uniforme regels die door verschillende onderzoekers kunnen worden toegepast, waardoor bias wordt verminderd | ||
| DIRECTE TELLINGEN | Tijd- en kosteneffectief | Minder nauwkeurig en gevoelig dan stereologie |
| Vereist standaard laboratoriumapparatuur, bijv. lichtmicroscoop | Slechts één bemonsteringsparameter gebruikt, waardoor deze minder effectief is in het detecteren van kleine veranderingen in follikelgetallen | |
| Retentie van eierstoksecties die kunnen worden gebruikt voor immunohistochemische of andere analyses | Weefsel is gevoeliger voor veranderingen in volume en follikelstructuur tijdens de verwerking | |
| Geen uniforme set regels die kunnen worden toegepast, dus gevoeliger voor bias van de onderzoeker |
Tabel 1: Vergelijking van de sterke en zwakke punten van follikeltellingsmethoden: stereologie versus directe tellingen.
Aanvullende figuur 1: Screenshots van het stereologie software protocol. A) Pas de belichting aan door Automatisch (rood vakje) aan te vinken onder Belichting in het paneel Camera-instellingen (wit vak). B) Stel de witbalans in door eerst op het pictogram Meer instellingen te klikken onder Overige in het deelvenster Camera-instellingen. Selecteer vervolgens Witbalans en klik op Automatisch (rood vak). C) Als er geen bestaande bemonsteringsconfiguratie is ingesteld, klikt u op Nee (rood vak) en voert u de seriële sectiegegevens (groen vak) in. D) Klik op Tellen (witte pijl) om te beginnen met tellen. E) Als de kern van een primordiale follikel zichtbaar is binnen het telkader, wordt deze follikel geteld (witte stippelcirkel). F) Als de kern van een primordiale follikel de groene inclusielijnen van het telframe raakt, wordt deze follikel ook geteld (witte stippelcirkel). G) Als de kern van een primordiale follikel niet zichtbaar is in het telkader of de rode uitsluitingslijnen van het telkader raakt, wordt deze follikel niet geteld (witte stippelcirkel). Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Instellen van de bemonsteringsparameters. Volg de opeenvolgende stappen in het linkerpaneel om de probeconfiguratie te definiëren. A) Meet de gemonteerde dikte. Zorg ervoor dat 'Herfocus naar de bovenkant van de sectie op elke rasterlocatie' is uitgeschakeld (rood vak). Vink 'Voer handmatig de gemiddelde gemonteerde dikte in' (groen vakje). Voer de gemiddelde gemonteerde dikte in als 20,00 μm (blauwe doos). B) Definieer de grootte van het telframe. Vink onder Telkaderweergave 'Forceer de weergave van het telframe vierkant' en 'Centreer op livebeeld' (rood vak) aan. Voer onder Framegrootte tellen 47,5 μm in voor X en Y (groen vak). C) Definieer de indeling van het SRS-raster. Voer handmatig de rastergrootte in als 110 voor X en Y (rood vak). D) Definieer dissectoropties. Voer voor de hoogte van de bovenste beschermzone 1,00 μm (rode doos) in. Voor optische dissectorhoogte voert u 10 μm (groene doos) in. Selecteer onder Focusmethode 'Handmatige scherpstelling' (blauw vak). E) Bemonsteringsparameters opslaan. Als u deze instellingen wilt opslaan, voert u een naam en opmerking in en klikt u vervolgens op 'Uw huidige instellingen opslaan' (witte pijl). F) Controleer onder Huidige bemonsteringsparameterinstellingen of uw instellingen overeenkomen met de weergegeven instellingen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol voor de gouden standaardtechniek voor het opsommen van primordiale follikels van muizen, stereologie en de vaker gebruikte methode voor het direct tellen van follikels. Chemotherapiebehandeling werd gebruikt om de resultaten van deze twee verschillende methoden in de linker- en rechter eierstok van hetzelfde dier te vergelijken en te contrasteren. Beide methoden onthulden een hoge variabiliteit tussen dieren in primordiale follikelgetallen. Een significante uitputting van de ovariële reserve werd geregistreerd met behulp van stereologie, maar directe telling kon geen significante vermindering van het primordiale follikelnummer detecteren na toediening van chemotherapie versus controle.
Het is met name duidelijk dat zelfs bij een ingeteelde muizenstam, zoals C57BL6J, het eierstokreservaat bij jongvolwassen wilde (controle)vrouwtjes wijdverspreid is, zoals het geval is bij mensen. Factoren die hierop van invloed zijn en bijdragen tot de totstandbrenging van de eierstokreserve worden nog onderzocht18. Hoge variabiliteit tussen studies naar de ovariële functie van muizen stelt het veld voor talrijke uitdagingen om gegevens te vergelijken of te repliceren en om de klinische vertaling van nieuwe therapieën te bevorderen om het oöcytaantal en de kwaliteit te beschermen4. Deze variabiliteit is waarschijnlijk te wijten aan een aantal factoren, waaronder niet alleen de gebruikte telmethoden, maar ook aanvullende factoren zoals verschillen tussen dierstam en leeftijd; behandelingsschema's, zoals dosis en timing. Met deze factoren moet rekening worden gehouden bij het vergelijken van gegevens uit verschillende studies. Hoe dan ook, het follikeldepletiemodel dat in deze studie wordt gebruikt, benadrukt over het algemeen de nauwkeurige en gevoelige aard van het stereologieprotocol, terwijl het ook aantoont dat de wijdverspreide methode voor directe tellingen niet in staat is om een bekende significante primordiale follikeldepletie te detecteren.
Er zijn sterke punten en beperkingen van elke telmethode die in dit artikel wordt beschreven (tabel 1). Stereologie wordt beschouwd als de gouden standaardmethode vanwege de nauwkeurigheid ervan wanneer deze wordt gebruikt om het celnummer in verschillende organen te bepalen5. Nadelen van deze techniek zijn echter de tijd en kosten die hiermee gemoeid zijn, evenals de vereiste voor gespecialiseerde apparatuur en expertise. Samen heeft dit het wijdverspreide gebruik van deze procedure voor het verkrijgen van de meest gevoelige gegevens beperkt.
Daarentegen is de methode voor directe tellingen snel, eenvoudig, kan worden gedaan met gearchiveerde weefsels en worden bereid met behulp van standaard histologische technieken. Het vereist alleen een lichtmicroscoop met standaard beeldvormingsmogelijkheden. Het houdt echter geen rekening met volumeveranderingen veroorzaakt door histologische verwerking, die de driedimensionale structuur van de eierstok kunnen verstoren. Bijgevolg is follikelmorfologie niet altijd voldoende bewaard gebleven, waardoor identificatie en telnauwkeurigheid uitdagend zijn, vooral voor onervaren onderzoekers. Terwijl formaline was de fixatieve gebruikt voor directe tellingen in deze studie, Bouin's-vaste weefsels kunnen worden ingebed in paraffine en dit kan zorgen voor een betere morfologie en onderzoekers helpen om gemakkelijker te identificeren primordiale follikels. Bovendien variëren de bemonsteringsfracties voor de methode van directe tellingen sterk, variërend van elke3e tot elke 10e 5 μm paraffine sectie19, wat kan bijdragen aan grote verschillen in follikeltellingen tussen studies. Gezien het feit dat paraffinewassecties zo dun zijn, helpt het tellen van elke9 e sectie om oversampling en onnodig tellen te voorkomen.
Aanvullende methoden die niet in deze gids worden beschreven, maar vaak in de literatuur worden gerapporteerd, tellen in slechts één centrale sectie van de hele eierstok en beschouwen dit als representatief voor de hele eierstok, of follikeldichtheid. Deze eerste methode is zeer problematisch, omdat primordiale follikels niet gelijkmatig in de eierstok worden verdeeld en in clusters kunnen worden gevonden. Dit betekent dat een enkele of zelfs enkele delen van de eierstok niet representatief zijn voor het hele orgaan, waardoor systematische bemonstering een essentieel onderdeel is van elke telmethode. Follikeldichtheid omvat het tellen van follikels in een ovariële weefselmonster en vervolgens het uitdrukken van de tellingen per gebied weefsel. Gezien de beperkingen van het verkrijgen van primair menselijk weefsel, wordt follikeldichtheid vaak gebruikt als surrogaatmaat voor absoluut follikelgetal in de menselijke eierstok, hoewel meldingen bij muizen ook vaak voorkomen. Deze kwantificeringsmethode houdt echter geen rekening met de ongelijke verdeling van follikels over de eierstok of schommelingen in het eierstokvolume, die routinematig optreden tijdens de ovariële endocriene (luteale) cyclus. Dit is belangrijk omdat een nauwkeurige meting van de dichtheid tussen de monsters afhankelijk is van geconserveerd weefselgebied. Bovendien bemonstert deze methode vaak slechts een kleine biopsie of fractie van de eierstok bij het analyseren van menselijke weefsels, dus is niet representatief voor de hele eierstok. Follikeldichtheid mist de nauwkeurigheid die haalbaar is met stereologie. Zelfs met behulp van dezelfde hele eierstok kwamen vergelijkende metingen van follikelkwantificering na stereologische analyse, met follikeldichtheid, niet overeen in de eierstokken van muizen20.
Hoewel het het meest gebruikte proefdier is, is de muis slechts één modelsoort. Het verkrijgen van eierstokken van grotere soorten, waaronder huisdieren of niet-menselijke primaten, is mogelijk, dus follikelstellingen van hele eierstokken kunnen worden bereikt met behulp van een gewijzigd stereologisch protocol21,22. Ten slotte, hoewel het vermogen om follikelstellingen in hele menselijke eierstokken te analyseren inderdaad erg moeilijk is, kan het niettemin worden gedaan wanneer specimens beschikbaar zijn, met behulp van een gewijzigd stereologisch protocol23,24,25.
Toekomstige richtingen in het veld kunnen de uitbreiding en toepassing van nieuwe technieken omvatten. Zo is een nieuwe methodologie van geautomatiseerde detectie en telling voor primordiale follikeloöcyten beschreven26. Deze methode maakt gebruik van convolutionele neurale netwerken die worden aangedreven door gelabelde gegevenssets en een schuifvensteralgoritme om testgegevens te selecteren. Dit algoritme werd echter slechts getest over twee eierstokken en de wijdverspreide opname moet nog worden bepaald. Als alternatief hebben recente ontwikkelingen op het gebied van optische weefselopheldering en lichtbladmicroscopie een uitgebreide analyse van intacte weefsels mogelijk gemaakt en sommige studies hebben dit onderzocht voor follikel-opsomming in de eierstok van de muis27,28.
Kortom, hoewel direct follikeltelling een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve methode is voor het opsommen van primordiale follikels in de eierstok, kan deze techniek gevoeligheid, nauwkeurigheid missen en gevoelig zijn voor onderzoeksbias. Daarom blijft stereologie, ondanks de nadelen, de best beschikbare techniek voor het nauwkeurig en reproduceerbaar definiëren van primordiale follikelgetallen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd mogelijk gemaakt door Victorian State Government Operational Infrastructure Support en Australian Government NHMRC IRIISS en ondersteund door financiering van de National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) en de Australian Research Council (KJH #FT190100265). De auteurs willen graag de technische ondersteuning van het Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform en Monash Micro Imaging facility erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
