Denne protokollen beskriver den kvantitative luminescerende deteksjonen av proteinnedbrytningskinetikk i levende celler som er konstruert ved hjelp av CRISPR / Cas9 for å uttrykke antistofffri endogen proteindeteksjonskode smeltet sammen med et målprotein. Detaljerte instruksjoner for beregning og innhenting av kvantitative degraderingsparametere, hastighet, Dmax, DC 50 og Dmax50 er inkludert.
Målrettede proteinnedbrytningsforbindelser, inkludert molekylære lim eller proteolyse rettet mot kimærer, er en spennende ny terapeutisk modalitet i oppdagelse av små molekyler. Denne klassen av forbindelser induserer proteinnedbrytning ved å bringe i nærheten av målproteinet og E3-ligasemaskinproteinene som kreves for å ubiquitinere og til slutt nedbryte målproteinet gjennom ubiquitin-proteasomal pathway (UPP). Profilering av målproteinnedbrytning på en høy gjennomstrømningsmåte er imidlertid fortsatt svært utfordrende gitt kompleksiteten av cellulære veier som kreves for å oppnå nedbrytning. Her presenterer vi en protokoll og screeningstrategi basert på bruk av CRISPR/Cas9 endogen merking av målproteiner med 11 aminosyren HiBiT-taggen som utfyller med høy affinitet til LgBiT-proteinet, for å produsere et selvlysende protein. Disse CRISPR-målrettede cellelinjene med endogene koder kan brukes til å måle sammensatt indusert nedbrytning i enten sanntids, kinetisk levende celle eller endepunktlytisk modus ved å overvåke luminescerende signal ved hjelp av en luminescerende platebasert leser. Her skisserer vi de anbefalte screeningprotokollene for de forskjellige formatene, og beskriver også beregningen av viktige nedbrytningsparametere for hastighet, Dmax, DC 50, Dmax50, samt multipleksing med celle levedyktighetsanalyser. Disse tilnærmingene muliggjør rask oppdagelse og triaging av forbindelser i tidlig stadium, samtidig som endogent uttrykk og regulering av målproteiner opprettholdes i relevante cellulære bakgrunner, noe som muliggjør effektiv optimalisering av blyterapeutiske forbindelser.
Målrettet proteinnedbrytning har dukket opp som et av de raskest voksende områdene i oppdagelse av små molekylmedikamenter, styrket sterkt av den terapeutiske suksessen til immunmodulerende molekylære limforbindelser (f.eks. IMiD) for kreftbehandling, og lovende tidlige kliniske studiedata for proteolyse Målretting av kimeraforbindelser 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Målrettede proteinnedbrytningsforbindelser fungerer ved å bringe i nærheten av et målprotein med E3 ligase maskinproteiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Denne forbindelsesinduserte rekrutteringen av målproteinet til E3-ligasen fører til målproteinet ubiquitinering og nedbrytning via ubiquitinproteasomal pathway (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historisk sett har screeningprogrammer for småmolekylære legemiddelfunn vært avhengige av innledende biokjemiske analyser for å vurdere aktivitet og rangordensforbindelser. Dette har imidlertid presentert en betydelig utfordring for målrettede proteindegradere hvis ultimate aktivitet, nedbrytning via proteasomet, er avhengig av en kaskade av cellulære hendelser 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. De mange veiene og kompleksiteten til proteinkomplekser som kreves for vellykket målforringelse, nødvendiggjør cellulære analysetilnærminger for tidlig screening og triaging av innledende forbindelser. For tiden mangler tilgjengeligheten av teknologier for å overvåke nedbrytning av målprotein på en høy gjennomstrømningsmåte i sammenheng med det cellulære miljøet alvorlig14. Her vil vi presentere protokoller for sanntids kinetisk levende celle eller endepunkt lytisk nedbrytningsaktivitetsvurdering ved bruk av CRISPR / Cas9 endogent merket HiBiT målcellelinjer 18,19,20 for å overvåke tapet av målproteinet via luminescerende måling etter behandling med degraderingsforbindelser10,11,18,19.
For å oppnå vellykket nedbrytning av terapeutiske mål og for å utvide det medikamentbare proteomet, har det oppstått mange tilnærminger og typer degradere som kan målrette mot et bredt spekter av proteiner for destruksjon, inkludert de som er lokalisert ved eller i plasmamembranen, lysosomer, mitokondrielle membraner, cytoplasma og kjernen21-57. De to primære klassene av forbindelser som er mest omfattende studert er molekylære lim og protein rettet mot cimeras 2,4,5,6,7,12,26. Molekylære lim er monovalente, og dermed vanligvis mindre i størrelse, og letter et nytt protein: proteininteraksjonsgrensesnitt med et målprotein ved binding til en E3-ligasekomponent 2,12,26. De er oftest degraders som binder seg til Cereblon (CRBN) E3 ligase komponent 2,12,26,55,56,57. Nylig om spennende nye eksempler utnytte andre E3 ligase maskiner som DCAF1558,59,60 og CDK / Cyclin rekruttering til DDB145 viser potensialet for utvidelse av denne klassen av forbindelser. I motsetning til dette er PROTACs større, bivalente molekyler, bestående av en målbindende ligand, oftest en inhibitor, brokoblet via en kjemisk linker til et E3-ligasehåndtak 1,3,4,5,7,13. Som sådan er disse forbindelsene i stand til direkte binding til både E3-ligasen og målproteinet 1,3,4,5,7,13. Tallrike proteiner har vist seg å nedbrytes via disse bivalente molekylene, og de mest brukte E3-ligasehåndtakene rekrutterer enten CRBN eller Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Imidlertid vokser antallet tilgjengelige håndtak for E3-ligaserekruttering i kimærer rettet mot proteolysedesign raskt, og utvider egenskapene til denne klassen av forbindelser med potensial til å nedbryte ulike målklasser, samt forbedre celle- eller vevstypespesifisitet 24,48,61,62 . Kombinert med det minimale kravet om å engasjere et målprotein, selv med marginal affinitet, holder nedbrytningsforbindelser løfte om å utvide det medikamentbare proteomet.
Karakterisering av den cellulære dynamikken til proteintap, samt potensiell proteinutvinning etter behandling, er avgjørende for å forstå nedbrytningsforbindelsens funksjon og effekt. Selv om det er mulig å studere endogene proteinnivåendringer i relevante cellulære systemer med western blot-antistoffanalyser eller massespektrometri, er disse tilnærmingene vanskelige å tilpasse seg screeningformater med høy gjennomstrømning, har begrenset kvantifiseringsevne eller evne til å måle kinetiske endringer på mange tidspunkter14. For å møte disse utfordringene har vi utviklet et platebasert cellulært luminescerende system for overvåking av endringer i endogene proteinnivåer, som benytter genomisk innsetting via CRISPR / Cas9 av 11-aminosyre-taggen, HiBiT, til stedet for eventuelle viktige nedbrytningsmål18,19,20. Dette peptidet komplementerer med høy affinitet til sin bindingspartner, LgBiT, for å produsere lys luminescens i nærvær av substratet 18,19,20,63, og dermed gjøre disse merkede endogene proteinene luminescerende i celler eller lysater 18,19,20,63 . De relative lysenhetene (RLU) målt med et lumiometerinstrument er direkte proporsjonale med de merkede målproteinnivåene 18,19,20,63. Med utviklingen av stabiliserte luciferasesubstrater er sanntids kinetiske proteinnivåmålinger over 24-48 timers tidsrammer mulig 18,53,64. Dette gjør det mulig å bestemme en fullstendig nedbrytningsprofil for et gitt mål ved en gitt sammensatt konsentrasjon, inkludert kvantitativ analyse av innledende nedbrytningshastighet, nedbrytningsmaksimum (Dmax) og utvinning etter sammensatt behandling18,53. Ved screening av store biblioteker av nedbrytningsforbindelser kan endepunktsanalyse imidlertid også enkelt utføres i 384-brønnformat ved forskjellige legemiddelkonsentrasjoner og angitte tidspunkter.
Protokollene som presenteres i dette manuskriptet representerer cellulære screeningstrategier for målrettede proteinnedbrytningsforbindelser, som gjelder for alle typer degradere. Bruken av HiBiT CRISPR-cellelinjer sammen med disse protokollene er imidlertid ikke begrenset til proteinnedbrytning, men de er generelle verktøy for overvåking av endogene målproteinnivåer som kan moduleres etter behandling for å studere virkningen av forbindelser eller til og med motstandsmekanismer 20,65,66. En forutsetning for disse luminescerende baserte deteksjonsmetodene er en CRISPR endogent merket HiBiT-målcellelinje, noe som er kritisk da det muliggjør sensitiv luminescerende deteksjon, samtidig som den opprettholder endogent måluttrykk og innfødt promotorregulering18,19,20. Det er gjort betydelige fremskritt i bruken av CRISRP/Cas9 for innsetting av genomiske koder, spesielt i skalerbarhet 20 og med høy sensitivitet for deteksjon, i forskjellige formater, inkludert CRISPR-bassenger eller kloner med enten heterozygote eller homozygote alleliske innsettinger18,19,20. Bruk av eksogent uttrykk av HiBiT eller andre reporterfusjoner i celler i stedet for endogen merking er mulig, men betydelig forsiktighet bør utvises ved bruk av systemer med proteinoveruttrykk14,18. Disse kan føre til artefakter for å forstå ekte sammensatt styrke og proteinutvinningsdynamikk14,18, inkludert potensielle transkripsjonelle tilbakemeldingssløyfer aktivert etter målforringelse. I tillegg kan forbindelser med lav styrke i tidlig stadium bli savnet, og presentere seg som falske negativer i screening. Siden proteintap kan skyldes sammensatt indusert toksisitet og celledød, inneholder protokollene beskrevet her sterkt anbefalte, men valgfrie celle levedyktighet selvlysende eller fluorescerende analyser parret med nedbrytningsprotokollen. Det er to hoveddeler i protokollen, lytisk endepunkt og kinetisk screening av levende celler. I hver av disse seksjonene er alternativer inkludert for multiplekset celle levedyktighetsmålinger i endepunkt eller kinetisk format. Overvåking av endringene i det merkede endogene proteinet krever komplementering med LgBiT i celler. Derfor refererer den kinetiske screeningseksjonen til viktige protokoller for innføring av dette, som kan oppnås via forbigående eller stabilt uttrykk og er avgjørende for å utføre levende celle selvlysende målinger. Alle tilnærminger som presenteres her, tillater rask rangeringsrekkefølge og aktivitetsvurdering av forbindelser, noe som muliggjør tidlig stadium sammensatt screeningsarbeid og raskere identifisering av blydegradere.
Denne protokollen er designet for studier av nedbrytningsforbindelser i forbindelse med en HiBiT CRISPR-cellelinje. Protokoller for generering av HiBiT CRISPR-innsettinger for en rekke mål har blitt skissert i flere nyere publikasjoner18,19,20.
Vi presenterer her to metoder for screening av nedbrytningsforbindelsesaktivitet i enten endepunktlytisk format eller live-celle kinetisk modus. Disse tilnærmingene er basert på de samme selvlysende måleprinsippene, men gir forskjellige detaljnivåer og forståelse. Valget av enten tilnærming vil trolig være avhengig av screening mål og størrelsen på sammensatte biblioteket. For store sammensatte screeningdekk eller primærskjermer for å observere påvisbar nedbrytning, tilbyr endepunktlytisk screening sensitiv og effektiv kompatibilitet med høy gjennomstrømning der andre endepunktstilnærminger, for eksempel western blot eller massespektrometri, kan være enten upraktiske eller vanskelige å tilpasse14. Et utgangspunkt for disse skjermbildene kan utføres med et begrenset antall konsentrasjoner og tidspunkter. Anbefalte innledende konsentrasjoner for å teste er i området 100 nM-10 μM, for å ta hensyn til innledende degraders som har lav styrke, dårlig permeabilitet, eller i noen tilfeller med svært potente forbindelser, tilstedeværelsen av en krokeffekt. Det anbefales videre at minst to forskjellige tidspunkter testes for å etablere tidlig nedbrytning ved 4-6 timer og latent eller vedvarende nedbrytning ved 18-24 timer. Forbindelser som utviser høy nedbrytningsstyrke og on-target mekanisme observeres lett innen en tidsramme på 4-6 timer, mens nedbrytning eller tilsynelatende proteintap observert bare ved senere tidspunkter kan skyldes en rekke mekanismer. Det anbefales sterkt å overvåke cellens levedyktighet på både tidlige og sene tidspunkter, slik at proteintap kan frikobles fra tap på grunn av celledød. I likhet med alle typer luminescerende eller fluorescerende analyser, er det et potensial for forbindelser i biblioteker for å forstyrre eller hemme signal, derfor vil ortogonale oppfølgingseksperimenter med blyforbindelser ved bruk av ikke-relaterte fusjoner eller alternative tilnærminger til overvåking av proteinnivå være viktig for å vurdere at tap av RLU i disse analysene er direkte forbundet med målproteinnedbrytning.
Evnen til å skjerme i levende cellekinetisk format over lengre perioder er avhengig av analysesignalet til bakgrunnen (S: B). Faktorer som bidrar til S: B inkluderer ekspresjonsnivået til selve målproteinet, som kan spenne over flere størrelsesordener, effektiviteten av LgBiT-uttrykk i cellelinjen valgt for peptidinnsetting, og tilgjengeligheten av det merkede målet for komplementering i sine forskjellige innfødte komplekser. Vi har etablert et generelt grensekrav som består av en S:B på 15 for å kunne måle nedbrytning i kinetisk modus med enten Endurazine eller Vivazine. S:B bestemmes ved å måle baselinesignalet til de HiBiT-redigerte cellene som uttrykker LgBiT i forhold til uredigerte foreldreceller som uttrykker LgBiT alene i nærvær av enten Endurazine eller Vivazine levende cellesubstrater. Vivazine vil produsere et høyere selvlysende signal, men vil forfalle raskere enn Endurazine og kan begrense signalinnsamlingen til 24 timer eller mindre. Videre kan S:B også være svært avhengig av om CRISPR-bassenger eller kloner brukes. For mål i cellelinjer som er mer mottagelige og har høy effektivitet for CRISPR / Cas9-prosjektering, kan en heterogen CRISPR-bassengpopulasjon av redigerte celler ha tilstrekkelig S: B for kinetisk analyse. For mål i vanskeligere cellelinjer der mindre effektiv genomisk integrasjon via CRISPR resulterer i bassenger med lav S:B, kan det være nødvendig å isolere CRISPR-kloner for å berike redigerte populasjoner og oppnå en tilstrekkelig høy S:B for kinetisk analyse. For noen av disse scenariene, hvis S:B er mindre enn 15 med enten Endurazine- eller Vivazine-substrater, anbefales endepunktlytisk screening.
For bedre forståelse og karakterisering av forbindelser, inkludert bestemmelse av en nedbrytningsprofil med kvantitative parametere, er sanntidskinetisk analyse i levende celler den anbefalte screeningtilnærmingen 14,18. I likhet med endepunktsanalyse diskutert ovenfor, kan innledende kinetisk screening gjøres med et begrenset antall konsentrasjoner i området 100nM-10μM på høy gjennomstrømningsmåte. I 384-brønnformat kan over 100 forbindelser lett screenes i tre eksemplarer i en konsentrasjon på en enkelt plate. De resulterende nedbrytningsprofilene vil gi veiledning ikke bare om omfanget av degradering observert, men graden av nedbrytning, varigheten av nedbrytningen og potensiell gjenvinning av proteinet14,18 (figur 2 og figur 3). Formene på nedbrytningsprofilen gir også verdifull informasjon. Spesifikke og potente degraders viser ofte et innledende raskt tap av målproteinet til et platå i løpet av timer18,53, mens andre mekanismer som transkripsjonell tilbakemelding eller sammensatt toksisitet vanligvis resulterer i mer lineært tap av proteinet over tid. Disse detaljene og nyansene blir savnet med endepunktlytisk analyse, og med sanntidsanalyse over 24-48 timer trenger man ikke å forutsi tiden for å fange den sanne Dmax innenfor sett med nye eller ukjente forbindelser.
Sanntidskinetikk gir også mulighet for effektiv doseresponsscreening for bedre å forstå forbindelseseffektivitet, hvordan sammensatt konsentrasjon påvirker innledende nedbrytningshastighet, og gir muligheter til å rangere forbindelser basert på mer enn én parameter. Klassiske målinger av nedbrytningsstyrke involverer DC50-beregninger på et bestemt tidspunkt basert på tilsynelatende nedbrytningsmaksimum. I motsetning til dette inkorporerer vår kinetiske tilnærming til å evaluere potens det sanne nedbrytningsmaksimumet ved hver konsentrasjon uavhengig av når det skjer i tid18. Vi kaller dette måling av kinetisk nedbrytningsstyrke, Dmax5018. Analyse på denne måten tar hensyn til forbindelser som kan initiere nedbrytning langsommere ved lavere konsentrasjoner og derfor ta lengre tid etter behandling for å nå Dmax. Det kan være spesielt informativt å rangere forbindelser på både nedbrytningshastighet og Dmax. For de mest potente degraderne vil dette ytterligere skille langsomme, men potente degradere fra de som er både raske og potente. Sammen er både lytisk og levende cellekinetisk screening ved bruk av HiBiT CRISPR-cellelinjer kraftige tilnærminger som gir et mer omfattende bilde av målrettet proteinnedbrytning, sammensatt funksjon og muliggjør screeningprosessen fra innledende aktivitetsvurdering til nedstrøms kjemisk optimalisering gjennom forbedring av viktige nedbrytningsparametere.
The authors have nothing to disclose.
K.M.R, S.D.M, M.U. og D.L.D er alle ansatte i Promega Corporation
CellTiter-Glo 2.0 reagent | Promega | G9241 | Cell Viability luminescent assay |
CellTiter-Fluor Cell Viability Assay | Promega | G6080 | Cell Viability fluorescent assay |
CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045-088 | Cell culture |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | For compound dilution and control |
DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
Fetal Bovine Serum | Seradigm | 89510-194 | Cell culture |
HEK293 LgBiT stable cell line | Promega | N2672 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
HiBiT CRISPR mammalian cell line | Promega | https://www.promega.com/crispr-tpd | |
Hygromycin B solution | Gibco | 10-687-010 | Cell culture |
LgBiT BacMam | Promega | CS1956C01 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
LgBiT Expression Vector | Promega | N2681 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
Luminometer Plate Reader | Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000) | ||
NanoGlo Endurazine live cell substrate | Promega | N2570 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo Vivazine live cell substrate | Promega | N2580 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo HiBiT Lytic Detection system | Promega | N3030 | Enpoint lytic HiBiT reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher) | ThermoFisher | 11058-021 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 96 well plate | Costar | 3917 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 384 well plate | Corning | 3570 | Cell culture |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25300 | Cell culture |