Summary
Den genetisk tractable nematode Caenorhabditis elegans kan bruges som en enkel og billig model for lægemiddelforskning. Beskrevet her er en protokol til at identificere anticancerterapi, der hæmmer downstream-signalering af RAS- og EGFR-proteiner.
Abstract
Ændringerne i plasmamembranlokaliseringen af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) og dens downstream-effektor RAS har været involveret i flere sygdomme, herunder kræft. Den fritlevende nematode C. elegans besidder en evolutionær og funktionelt bevaret EGFR-RAS-ERK MAP signalkaskade, som er central for udviklingen af vulva. Forstærkning af funktionsmutationer i RAS homolog LET-60 og EGFR homolog LET-23 fremkalder generering af synlig ikke-funktionel ektopisk pseudovulva langs disse ormes ventrale kropsvæg. Tidligere har den multivulval (Muv) fænotype i disse orme vist sig at være hæmmet af små kemiske molekyler. Her beskriver vi en protokol for brug af ormen i en væskebaseret analyse til at identificere hæmmere, der afskaffer aktiviteterne i EGFR- og RAS-proteiner. Ved hjælp af denne analyse viser vi R-fendiline, en indirekte hæmmer af K-RAS, undertrykker Muv-fænotypen udtrykt i let-60(n1046) og let-23(sa62) mutantorme. Analysen er enkel, billig, er ikke tidskrævende at sætte op, og kan bruges som en indledende platform for opdagelsen af anticancer terapi.
Introduction
De cellulære veje, der regulerer udviklingsmæssige begivenheder inden for organismer, er stærkt bevaret blandt alle metazoaner. En sådan vej er EGFR-RAS-ERK mitogen aktiveret protein kinase (MAPK) signalering kaskade, som er en kritisk vej, der styrer cellespredning, differentiering, migration og overlevelse1,2. Defekter i denne signalering vej kan føre til patologiske eller sygdomstilstande såsom kræft. Den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) har vist sig at være stærkt udtrykt i menneskelige tumorer, herunder 50% af oral squamous celle karcinomer, og bidrager til udviklingen af ondartede tumorer3,4,5. Mens mutationer i de tre RAS isoformer H-, K- og N-RAS er vigtige drivkræfter for ondartet transformation i flere humane kræftformer. Blandt disse tre RAS isoformer, onkogene mutationer i K-RAS er mestudbredte 6,7,8. For at EGFR og RAS kan fungere, skal de lokaliseres til plasmamembranen (PM). Forebyggelse af lokalisering af disse molekyler til PM kan helt ophæve den biologiske aktivitet af denne signalvej9,10. Derfor hæmning af lokalisering af disse proteiner til PM er en terapeutisk strategi for at blokere downstream signalering og de deraf følgende negative resultater. Ved hjælp af en screeningsanalyse med højt indhold blev fendiline, en L-type calciumkanalblokker, identificeret som en hæmmer af K-RAS-aktivitet11. Nanohobning af K-RAS til pm'ens indvendige folder reduceres betydeligt i nærværelse af fendiline. Desuden omfordeles K-RAS fra plasmamembranen til det endoplasmiske reticulum (ER), Golgi-apparatur, endosomer og cytosol. Endnu vigtigere er det, at spredningen af bugspytkirtel-, tyktarms-, lunge- og endometriekræftcellelinjer, der udtrykker onkogen mutant K-RAS, blokeres af hæmningen af downstream-signalering ved fendiline11. Disse data tyder fendiline fungerer som en specifik K-RAS anticancer terapeutisk, der forårsager mis-lokalisering af RAS protein til PM.
Nematode Caenorhabditis elegans er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med udvikling. Mange af de signalveje, der styrer udviklingen i ormen, er evolutionære og funktionelt bevaret. Egfr medieret aktivering af RAS og den efterfølgende aktivering af ERK MAPK-signalkaskaden bevares f.eks. Kaskaden er repræsenteret af følgende proteiner: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 er homologt for RAS, mens LET-23 er homologt for EGFR. I ormen regulerer denne vej udviklingen af vulva13. Vulva er en epitelåbning på ormens ventrale kropsvæg, der gør det muligt at lægges befrugtede æg. Dannelsen af vulvaen i ormen afhænger af, at vulvalprækursorcellerne (VPC) udsættes for en gradient for aktivering af EGFR-RAS-MAPK-signalkaskaden. Under den normale udvikling modtager de proksimale VPCs stærke signaler fra gonadal ankercellerne for at differentiere sig til 1° og 2° celle skæbner, som giver anledning til en funktionel vulva12. Mens distale VPCs differentierer sig til 3 ° celle skæbner, der smelter sammen til hypodermal syncytium og ikke danner vulva på grund af udtømt signalering. I mangel af signalering differentierer alle VPCs sig til 3° celle skæbner, hvilket resulterer i dannelsen af ingen vulva. Konstituerende signalering fører imidlertid til dannelsen af en eller flere ikke-funktionelle vulva på grund af induktion af alle VPCs til at antage 1 ° og 2 ° celle skæbner.
Mutationer, der forårsager defekt eller overdreven vulval induktion er blevet identificeret for mange af de gener, der koder for proteiner, der repræsenterer denne vej. Defekt vulval induktion resulterer i en vulvaless (Vul) fænotype, mens overdreven vulval induktion resulterer i en multivulva (Muv) fænotype, der er repræsenteret ved udviklingen af talrige nonfunctional ektopiske pseudovulvae hele ventral kropsvæggen. Den Muv fænotype udtrykt ved let-60(n1046) stamme skyldes en gevinst af funktion mutation i RAS, mens der i let-23(sa62) stamme det skyldes en aktiverende mutation i EGFR14,15. Den stærke Muv fænotype i disse mutante stammer har vist sig at være forstyrret af farmakologiske indgreb som påvist ved behandling af let-60(n1046) orme med MEK-1-hæmmer U012616,17. Interessant nok har vi vist, at R-fendiline og hæmmere, der påvirker sphingomyelin metabolisme undertrykke Muv fænotype i ormen18. For at demonstrere disse hæmmere blok let-60 signalering på niveau med RAS, lin-1 null stamme er blevet udnyttet17. Lin-1 er en Ets-lignende hæmmende transskriptionsfaktor, der fungerer som et undertrykker i udviklingen af vulva19. Stærk tilbagevenden af Muv fænotype i lad-60(n1046) orme og ingen effekt på lin-1 null orme tyder på, at disse hæmninger forekommer på niveau med RAS.
I denne protokol demonstrerer vi brugen af C. elegans som model til at identificere hæmmere af RAS- og EGFR-proteiner. Ved hjælp af en væskebaseret analyse demonstrerer vi de hæmmende virkninger af R-fendiline ved at undertrykke Muv-fænotyperne i lad-60(n1046) og let-23(sa62) mutantstammer af C. elegans. Denne analyse validerer brugen af C. elegans som et redskab i den indledende fase af lægemiddelforskning for kræftbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nematode vækstmedium (NGM) pladeforberedelse
- Der tilsættes 2,5 g pepton og 3 g NaCl til 970 mL deioniseret vand indeholdt i en 2 L Erlenmeyer kolbe. Rør indhold ved hjælp af en magnetisk rørestang. Derefter tilsættes 20 g agar til kolben. Kolbens indhold ved 121 °C og et tryk på 15 lb/in2 i 30 min. Efter sterilisering anbringes kolben på en omrøreplade, og mediet afkøles, indtil temperaturen når op på 50 °C.
- Tilberedning af NGM-pladerne tilsættes følgende reagenser til det afkølede medium: 25 ml 1 M kaliumphosphatbuffer (pH = 6,0), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg/mL i 95% ethanol) kolesterol, 1 ml (10% v/w ethanol) nystatin og 1 ml 25 mg/mL streptomycin.
- Under et laminarflow hældes det afkølede medium i 60 mm x 15 mm sterile petriskåle. Lad pladerne størkne i 2 timer. Disse plader kan opbevares i 1 måned ved 4 °C.
2. Udbredelse af C. elegans
- Spot 100 μL af natten dyrket E. coli OP50 på midten af hver NGM plade og lad pladerne tørre i 24 timer i en laminar hætte. Efterfølgende kan pladerne opbevares i polystyrenbeholder.
BEMÆRK: E. coli OP50-kulturen dyrkes i Luria-Bertani (LB) medier på 37 °C medier før såning af pladerne. Kulturen kan opbevares ved 4 °C i 1-2 måneder og anvendes til periodisk såning af plader. - Ved hjælp af en steril orm pick, indsamle 10-12 gravid voksne orme fra en tidligere dyrket plade under en dissekere mikroskop. Disse orme overføres til en frisk NGM-plade, der er seedet med E. coli OP50, og pladen inkuberes i 24 timer ved 20 °C.
- Efter 24 timer, ved hjælp af en steril orm-pick fjerne voksne orme fra pladerne. Pladerne inkuberes ved 20 °C i ~ 3 dage. Embryoner vil udvikle sig til gravid voksen orme.
3. Forberedelse af en synkron C. elegans kultur
- Saml gravide voksne orme i et 15 mL konisk rør ved at vaske 2-4 plader med M9W.
- Forberedelse af M9W: 5 g NaCl opløses, 6 g Na2HPO4og 3 g KH2PO4 opløses i deioniseret vand til et slutvolumen på 1 L. Autoklave opløsningen ved 121 °C ved et tryk på 15 lb/in2 i 30 min. Der tilsættes 1 ml 1 M MgSO4 til den afkølede opløsning.
- Pellet ormene ved centrifuging røret på 450 x g i 1 min. Dekanter supernatanten uden at forstyrre ormepillen.
- Der fremstilles en orm-lysisopløsning ved at kombinere 400 μL 8,25% natriumhypochlorit (husholdningsblegemiddel) og 100 μL 5 N NaOH. Tilsæt denne opløsning til ormen pellet og svirp røret til at blande indholdet af røret. Undgå overbleaching af embryonerne i røret ved at observere ormenes lysis under et dissekerende mikroskop.
- Tilsæt 10 mL M9W til konisk rør for at fortynde lysisblandingen, når 70% af de voksne orme har lyset.
- Centrifuge røret ved 450 x g i 1 min. Supernatanten udskiftes med 10 mL M9W.
- Gentag trin 3.5 to gange.
- Når vasketrinnene er afsluttet, tilsættes 3-5 mL M9W for at genbruge ægpillen. Drej røret natten over med en hastighed på 18 omdrejninger på en rør rotator ved stuetemperatur (RT).
- Efter natten inkubation, fjern røret fra rotator, pellet L1 larverne ved centrifugering røret på 450 x g i 1 min. Aspirere M9W indtil 250 μL er tilbage i røret.
- Ryst røret for at genbruge larverne. Tre 5 μL dråber med larverne tilsættes på et petriskålslåg. Ved hjælp af et dissekerende mikroskop tælle antallet af orme i hver dråbe og bestemme antallet af orme i 1 μL.
4. Forberedelse af narkotika assays
BEMÆRK: Trinnene i denne analyse er vist i figur 1.
- Der til grow 30 mL E. coli OP50 i et 50 mL konisk rør ved 37 °C natten over i en orbital shaker ved 150 omdrejninger i minuttet.
- Spin natten dyrket E. coli OP50 kultur på 4.000 x g i 10 min til pellet cellerne. Fjern supernatanten og genbrug pellet i 3 mL M9W for at koncentrere kulturen.
- Før du forbereder arbejdsopløsningerne til lægemiddelanalysen, tilsættes 0,1 mL (5 mg / mL i 95% ethanol) kolesterol i 100 mL M9W.
- Forbered arbejdsopløsninger af hvert eksperimentelt lægemiddel ved at fortynde hvert lægemiddel plus køretøj (dimethylsulfoxid; DMSO) i 4,8 mL M9W suppleret med kolesterol for at opnå de relevante koncentrationer. DMSO opløses i 4,8 mL M9W suppleret med kolesterol for at forberede køretøjets kontrol.
- Der tilsættes 200 μL koncentreret E. coli OP50-dyrkning til hvert rør, der indeholder køretøjets kontrol eller stoffer og hvirvelrør, for at sikre, at de blandes.
- For at udføre eksperimentet tilsættes 2 ml af hver arbejdsmedicinopløsning eller køretøjskontrol til hver brønd i en 12-brønds vævskulturplade. Test hver lægemiddelkoncentration og køretøjskontrol i to eksemplarer.
- Tilføj ~ 100 L1 larver per brønd (se synkrone C. elegans kultur trin) ved hjælp af en steril mikropipette. Begræns mængden af orme til 10 μL.
- Pladerne inkuberes ved 20 °C.
- Kommenter brønde med 50 μL af 10x koncentreret E. coli OP50 på dag 3 af analysen, hvis det er nødvendigt.
5. Agarose pad forberedelse til mikroskopi
- Der fremstilles en opløsning på 2% m/v agarose ved at opløse 0,1 g agarose i 5 ml deioniseret vand. Varm indholdet i en mikrobølgeovn for at opløse agarose. 20 rutsjebaner kan fremstilles af 5 ml agaroseopløsning.
- Placer strimler af lab tape langs to glas dias. Båndet vil fungere som afstandsstykke, der begrænser tykkelsen af agarose puderne. Placer derefter en tredje ren glasrutsjebane mellem de tapede dias.
- For at lave en agarose pad, spot 100 μL smeltet agarose på midten af den rene dias. Placer en anden ren glasrutsjebane på tværs og oven på agarose og tryk forsigtigt ned for at danne en pude. Fjern det øverste dias, når puden er størknet.
6. Observation af Muv fænotype i let-60, lad-23 og lin-1 stammer
BEMÆRK: Kun kandidat medicin, der undertrykker Muv fænotyper i let-23 og lad-60 stammer vil blive analyseret ved hjælp af lin-1 stamme til at afgøre, om hæmning sker på niveau med RAS eller EGFR.
- Når den relevante fase af livscyklussen er nået (3 dage for let-60 og let-23 stammer, 5 dage for lin-1 stamme), fjerne pladerne fra inkubatoren. og saml ormene i 15 mL koniske rør ved hjælp af en pipette.
- Centrifuge rørene ved 450 x g i 1 min. Fjern M9W uden at forstyrre ormen pellet og tilsæt 5 mL frisk M9W.
- Gentag trin 6.2 to gange.
- Uden at forstyrre ormen pellet, fjerne alle resterende M9W ved aspiration. Derefter tilsættes 500 μL 2 mM natriumazid eller 2 mM tetramisolhydrochlorid. Lad rør inkubere ved RT i 15 min. 2 mM natriumazid eller 2 mM tetramisolhydrochlorid vil bedøve ormene til billeddannelse.
ADVARSEL: Sørg for at bære personlige værnemidler (PPE), når du håndterer natrium azide. Opløsningen skal fremstilles under en kemisk emhætte. - Der tilsættes 10 μL af den bedøvede ormeaffjedring til midten af en agarosepude. Placer en #1,5 coverslip forsigtigt over ormen suspension. Hvis det er nødvendigt, fastsætte coverslip med nogle neglelak for at forhindre udtørring.
- Brug et DIC-mikroskop til at observere let-60(n1046), let-23(sa62) og lin-1(sy254) stammer. Billede ormene på 10x og 20x forstørrelser.
- For let-60(n1046) og let-23(sa62) skal du score de voksne orme baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af Muv-fænotypen. Mens du er for lin-1-stammen, skal du tælle antallet VPCs, der vedtog 1 ° eller 2 ° celle skæbner på ventralsiden af L4 larver ved hjælp af et DIC-mikroskop med høj opløsning.
- Efter at have scoret mikrograferne for hver stamme og lægemiddelbehandling, skal du udføre Student's t-testfor at bestemme de statistiske forskelle mellem behandlingerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi først viser, at R-fendiline er i stand til at undertrykke Muv fænotype i let-60(n1046) mutant stamme i forhold til DMSO behandlede orme. Vores data viser, at R-fendiline er i stand til at blokere Muv fænotype i let-60(n1046) på en dosisafhængig måde (Figur 2A, B). Der blev imidlertid observeret ikke-vending af Muv-fænotypen i lin-1-null-mutantstammen som reaktion på stigende koncentrationer af R-fendilin (figur 2B). Dataene tyder på, at R-fendiline blokke aktiveret lad-60 signalering på niveau med RAS i C. elegans. På samme måde observerede vi, at Muv-fænotypen blev reduceret betydeligt i let-23(sa62)-stammen som reaktion på 3, 10 og 30 μM R-fendilinbehandling i forhold til de DMSO-behandlede orme (Figur 2C, D). I alle eksperimenter blev Students t-testbrugt til at bestemme den statistiske betydning.
Figur 1: Rutediagram, der repræsenterer de skridt, der er involveret i forberedelsen af narkotikaanalyserne ved hjælp af let-60(n1046), let-23(sa62) og lin-1(sy254) stammer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: R-fendiline ændrer let-60 og let-23 funktion i C. elegans på en dosisafhængig måde. (A) Repræsentative billeder af orme, der er anbragt i let-60(n1046) i nærværelse af køretøjet (DMSO) eller 30 μM R-fendiline. (B) Kvantificering af Muv-fænotype i lad-60(n1046) orme behandlet under tilstedeværelse af DMSO, 3, 10 og 30 μM R-fendilin eller 30 μM U0126. (C) Repræsentative billeder af orme, der er udlejet til 23 orme (sa62) i nærværelse af køretøjet (DMSO) eller 30 μM R-fendiline. d) Kvantificering af Muv-fænotype i let-23(sa62)-orme behandlet under tilstedeværelse af DMSO, 3, 10 og 30 μM R-fendilin eller 30 μM U0126. På alle billeder er pseudovulvaen angivet med hvide pile og normal vulva af hvide stjerner. I alt 60 orme blev afbildet for hver behandling. Eksperimentet blev gentaget 3 gange. (*** P<0,001 og ** P<0,01 blev anset for betydelige) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De analyser, vi beskriver ved hjælp af ormen, er enkle og billige til at identificere hæmmere af EGFR- og RAS-funktionen. C. elegans er en attraktiv model for lægemiddelforskning, fordi det er let at vokse i laboratoriet på grund af den korte livscyklus (3 dage ved 20 °C) og evnen til at generere et stort antal larver. Endnu vigtigere er det, at EGFR-RAS-ERK MAPK-vejen evolutionært og funktionelt bevares med pattedyr, der giver et genetisk tractable system til at analysere virkningerne af EGFR- og RAS-hæmmere. Desuden gør ormenes gennemsigtige karakter det muligt for en efterforsker at visualisere forskellige strukturer og lokaliseringen af grønt fluorescerende protein (GFP) eller andet fluorophore, der er smeltet til proteiner af interesse ved DIC og fluorescerende mikroskopi.
De protokoller, vi brugte til at formere og vedligeholde de forskellige C. elegans, der blev brugt i denneundersøgelse,blev tidligere etableret20,21. Men i forberedelsen af NG plader vi indarbejdet streptomycin og nystatin for at forhindre bakteriel og svampe forurening. Tilsætningen af disse antimikrobielle midler forhindrede ikke udviklingen af ormene og induktionen af Muv-fænotypen.
Der er flere fordele ved at opnå L1 larver ved ormen synkronisering protokol. Mange larver kan fås fra 2 eller flere plader, der indeholder gravide voksne, og de indsamlede larver er alle alderssynkronerede. Dette sikrer, at udviklingen af ormene er konsistent i befolkningen. Nogle mutant stammer viser Muv fænotype er dårlige æg lag resulterer i lave udbytter af larver som det ses i null mutation husede i Ets familien transskription faktor lin-119. Blegemiddel behandling af lin-1 gravid voksne vil øge antallet af larver, der kræves for analysen.
Det er vigtigt at observere ormenes lysis under forberedelsen af en synkron C. elegans kultur. Den tykke æggeskal beskytter delvist embryonerne mod virkningen af blegemiddel-natriumhydroxidblandingen, selv når larvernes og voksnes kutikula opløses. Langvarig udsættelse for lysisopløsningen vil imidlertid trænge ind i dette beskyttende hus, der fører til embryonernes død. Derfor er det vigtigt at stoppe virkningen af blegemiddel-natriumhydroxidblandingen, når 70% af de voksne orme har lyset. Dette opnås ved at fortynde lysisopløsningen med M9W. Vedligeholdelsen af de anholdte L1 larver er endnu et skridt at overveje i den synkrone C. elegans kulturprotokol. Langvarig inkubation af de L1-anholdte larver i M9W kan få dem til at omdanne sig til dauerstadiet på grund af akkumulering af dauer-feromonen. For at undgå dannelsen af dauer-scenen foreslås det at bruge de L1-arresterede larver inden for 1-2 dage efter indsamling af embryonerne.
Den basale Muv fænotype er henholdsvis 60%-90% og 90% for ormene let-60(n1046) og let-23(sa62). Dette tyder på, at let-60(n1046) orme er underlagt fænotypisk drift, og derfor er det vigtigt at rapportere de basale niveauer af udtryk for Muv fænotype. Behandling af let-60(n1046) og let-23(sa62) orme med R-fendiline og andre K-RAS-hæmmere reducerer procentdelen af orme, der udtrykker Muv-fænotypen. Det forlyder dog også, at nogle hæmmere af EGFR-RAS-ERK MAPK-vejen kan reducere antallet af pseudovulvae pr. orm alene eller påvirke både udtrykket og antallet af pseudovulvae17. Derfor er det vigtigt at tælle antallet af pseudovulvae i Muv orme i både narkotika og DMSO behandlet orme. Muv-fænotypen udtrykt i let-60(n1046) og let-23(sa62) voksne orme er tydeligt synlige under et dissekerende mikroskop. Men lin-1 (null) stammen er relativt usund, udviklingshæmmede og vulval fremspring er dårligt skelnet i de voksne orme. Derfor, i stedet for de ektopiske vulval fremspring, i lin-1 (null) orme, VPN'er, der vedtager en vedtaget 1 ° eller 2 ° celle skæbner på ventral side i L4 fase, kan tælles ved hjælp af en høj opløsning DIC mikroskop.
Analysen er billig, nem og ikke tidskrævende at opsætte. For yderligere at forbedre behandlingstiden kan ormene bedøves til en endelig koncentration på 2 mM natriumazid i brøndene på vævskulturpladen og afbildes ved hjælp af et dissekerende mikroskop udstyret med et kamera. En anden ændring af analysen ville være at bruge varme dræbt E. coli OP50 i stedet for levende bakterier23. Det har vist sig, at bakterier kan metabolisere visse små molekyler, der fører til reducerede bioaktiviteter24.
Tidligere undersøgelser har vist, at induktionen af vulvaen i ormen er afhængig af visse miljømæssige signaler. De vulvaless fænotyper af lin-3(n378) og let-23(n1045) har vist sig at være delvist undertrykt af sult og spændende dauer fase14. Desuden viste en undersøgelse foretaget af Moghal et al., at vulvaless lin-3(n378), let-23(sy1) og let-60(sy95dn) mutanter dyrket i M9 buffer havde et højere antal VPCs under forudsætning af vulval celler skæbner sammenlignet med dyr dyrket på standard NG plader24. Dataene tyder på orme dyrket i et flydende miljø påvirker vulval induktion. Men i vores undersøgelser observerede vi ikke undertrykkelsen af Muv-fænotypen i et flydende miljø.
I denne protokol demonstrerer vi brugen af C. elegans til at evaluere fendilinens anti-RAS-egenskaber. I en tidligere undersøgelse har vi vist, at flere syre sphingomyelinase-hæmmere, herunder tricykliske antidepressiva som desipramin, imipramine og amitriptylin hæmmer Muv phenotype18. Desuden undertrykker hæmmere af sphingomyelin og ceramid biosyntetiske veje Muv-fænotypen udtrykt i let-60(n1046) ormene. Disse fund ved hjælp af ormen blev valideret i pattedyr cellelinjer.
Afslutningsvis demonstrerer vi brugen af C. elegans til at identificere hæmmere af EGFR- og RAS-aktivitet i en væskebaseret analyse. Desuden giver ormen et andet system til at identificere og karakterisere virkningsmekanismerne for anti-RAS og EGFR-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) for at give let-60(n1046). Vi takker også Dr. David Reiner (Texas A &M Health Science Center Institute of Biosciences &technology i Houston) for lin-1 stammen. Endelig takker vi Dr. Danielle Garsin og hendes laboratorium (The University of Texas, McGovern Medical School) for at give nogle af de reagenser. Nogle orm stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Denne forskning blev støttet af Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) tilskud RP200047 til JF Hancock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
References
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
