Summary
De genetisch trekbare nematode Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als een eenvoudig en goedkoop model voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hier wordt een protocol beschreven om antikankertherapieën te identificeren die de downstream signalering van RAS- en EGFR-eiwitten remmen.
Abstract
De veranderingen in de plasmamembraanlokalisatie van de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) en de downstream-effector RAS zijn betrokken bij verschillende ziekten, waaronder kanker. De vrijlevende nematode C. elegans bezit een evolutionaire en functioneel geconserveerde EGFR-RAS-ERK MAP signaalcascade die centraal staat voor de ontwikkeling van de vulva. Toename van functiemutaties in RAS-homologe LET-60 en EGFR-homolog LET-23 induceert de generatie van zichtbare niet-functionele ectopische pseudovulva langs de ventrale lichaamswand van deze wormen. Eerder is aangetoond dat het multivulvale (Muv) fenotype in deze wormen wordt geremd door kleine chemische moleculen. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van de worm in een vloeistofgebaseerde test om remmers te identificeren die de activiteiten van EGFR- en RAS-eiwitten afschaffen. Met behulp van deze test tonen we R-fendiline, een indirecte remmer van K-RAS, onderdrukt het Muv fenotype uitgedrukt in de let-60(n1046) en let-23(sa62) mutant wormen. De test is eenvoudig, goedkoop, is niet tijdrovend om in te stellen en kan worden gebruikt als een eerste platform voor de ontdekking van antikankertherapieën.
Introduction
De cellulaire paden die ontwikkelingsgebeurtenissen in organismen reguleren, zijn sterk geconserveerd onder alle metazoën. Een van die routes is de EGFR-RAS-ERK mitogen activated protein kinase (MAPK) signaleringscascade, een kritieke route die de celproliferatie, differentiatie, migratie en overlevingregelt 1,2. Defecten in dit signaleringstraject kunnen leiden tot pathologische of ziektetoestanden zoals kanker. De epidermale groeifactorreceptor (EGFR) is sterk uitgedrukt in menselijke tumoren, waaronder 50% van orale plaveiselcelcarcinomen, en draagt bij aan de ontwikkeling van kwaadaardige tumoren3,4,5. Terwijl mutaties in de drie RAS-isovormen H-, K- en N-RAS belangrijke aanjagers zijn voor kwaadaardige transformatie bij meerdere menselijke kankers. Van deze drie RAS-isovormen komen oncogene mutaties in K-RAS het meest voor6,7,8. Om EGFR en RAS te laten functioneren, moeten ze lokaliseren naar het plasmamembraan (PM). Het voorkomen van de lokalisatie van deze moleculen naar de PM kan de biologische activiteit van deze signaalroute9,10volledig intrekken . Vandaar dat de remming van de lokalisatie van deze eiwitten naar de PM een therapeutische strategie is om de downstream signalering en de daaruit voortvloeiende negatieve resultaten te blokkeren. Met behulp van een screeningstest met een hoog gehalte werd fendiline, een calciumantagoneerder van het L-type, geïdentificeerd als een remmer van K-RAS-activiteit11. Nanoclustering van K-RAS naar de binnenste bijsluiter van de PM is significant verminderd in aanwezigheid van fendiline. Bovendien wordt K-RAS herverdeeld van het plasmamembraan naar het endoplasmatisch reticulum (ER), Golgi-apparaat, endosomen en cytosol. Wat nog belangrijker is, de proliferatie van pancreas-, dikke darm-, long- en endometriumkankercellijnen die oncogene mutant K-RAS uitdrukken, wordt geblokkeerd door de remming van downstreamsignalering door fendiline11. Deze gegevens suggereren fendiline functioneert als een specifieke K-RAS antikanker therapeutische die de verkeerde lokalisatie van het RAS-eiwit naar de PM veroorzaakt.
De nematode Caenorhabditis elegans is uitgebreid bestudeerd in de context van ontwikkeling. Veel van de signaalroutes die de ontwikkeling in de worm regelen, zijn evolutionair en functioneel geconserveerd. De EGFR-gemedieerde activering van RAS en de daaropvolgende activering van de ERK MAPK-signaalcascade worden bijvoorbeeld bewaard in worm12. De cascade wordt vertegenwoordigd door de volgende eiwitten: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 is homoloog voor RAS, terwijl LET-23 homoloog is voor EGFR. In de worm reguleert deze route de ontwikkeling van de vulva13. De vulva is een epitheelopening op de ventrale lichaamswand van de worm waarmee bevruchte eieren kunnen worden gelegd. De vorming van de vulva in de worm is afhankelijk van de blootstelling van de vulval precursorcellen (VPC) aan een gradiënt van activering van de EGFR-RAS-MAPK signaalcascade. Tijdens de normale ontwikkeling ontvangen de proximale VPC's sterke signalen van de gonadale ankercellen om zich te onderscheiden in 1° en 2° cel lot dat aanleiding geeft tot een functionele vulva12. Terwijl distale VPC's differentiëren in 3° cel lot dat fuseert met het hypodermale syncytium en geen vulva vormen als gevolg van uitgeputte signalering. Bij afwezigheid van signalering differentiëren alle VPC's in 3° cel lot wat resulteert in de vorming van geen vulva. Constitutieve signalering leidt echter tot de vorming van een of meer niet-functionele vulva als gevolg van de inductie van alle VPC's om 1° en 2° cel lot aan te nemen.
Mutaties die defecte of overmatige vulval inductie veroorzaken, zijn geïdentificeerd voor veel van de genen die coderen voor eiwitten die deze route vertegenwoordigen. Defecte vulval inductie resulteert in een vulvaless (Vul) fenotype, terwijl overmatige vulval inductie resulteert in een multivulva (Muv) fenotype dat wordt vertegenwoordigd door de ontwikkeling van talrijke niet-functionele ectopische pseudovulvae door de ventrale lichaamswand. Het Muv-fenotype uitgedrukt door de let-60(n1046) stam is te wijten aan een toename van functiemutatie in RAS, terwijl het bij de let-23(sa62) stam te wijten is aan een activerende mutatie in EGFR14,15. Het sterke Muv-fenotype in deze mutante stammen is verstoord door farmacologische interventies, zoals aangetoond door de behandeling van let-60(n1046) wormen met de MEK-1-remmer U012616,17. Interessant is dat we hebben aangetoond dat R-fendiline en remmers die het sphingomyelinemetabolisme beïnvloeden, het Muv-fenotype in de wormonderdrukken 18. Om aan te tonen dat deze remmers let-60 signalering op ras-niveau blokkeren, is de lin-1 null-stam gebruikt17. Lin-1 is een Ets-achtige remmende transcriptiefactor die fungeert als een repressor in de ontwikkeling van de vulva19. Sterke reversie van het Muv-fenotype bij let-60(n1046) wormen en geen effect op lin-1 null wormen suggereren dat deze remmingen optreden op het niveau van RAS.
In dit protocol demonstreren we het gebruik van C. elegans als model om remmers van RAS- en EGFR-eiwitten te identificeren. Met behulp van een vloeistofgebaseerde test tonen we de remmende effecten van R-fendiline aan door de Muv-fenotypen in de let-60(n1046) en let-23(sa62) mutante stammen van C. elegans teonderdrukken. Deze test valideert het gebruik van C. elegans als hulpmiddel in de beginfase van de ontdekking van geneesmiddelen voor antikankertherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nematoden groeimedium (NGM) plaatvoorbereiding
- Voeg 2,5 g pepton en 3 g NaCl toe aan 970 ml gedeïoniseerd water in een 2 L Erlenmeyer. Roer de inhoud met behulp van een magnetische roerstaaf. Voeg daarna 20 g agar toe aan de kolf. Autoclaaf de inhoud van de kolf bij 121 °C en een druk van 15 lb/in2 gedurende 30 min. Plaats de kolf na sterilisatie op een roerplaat en laat het medium afkoelen tot de temperatuur 50 °C bereikt.
- Om de NGM-platen te bereiden, voegt u de volgende reagentia toe aan het gekoelde medium: 25 ml kaliumfosfaatbuffer van 1 M (pH = 6,0), 1 ml van 1 M MgSO4, 1 ml van 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg/ml in 95% ethanol) cholesterol, 1 ml (10% v/w in ethanol) nystatine en 1 ml (10% v/w in ethanol) nystatine.
- Giet onder een laminaire stroming het afgekoelde medium in steriele petrischalen van 60 mm x 15 mm. Laat de platen 2 uur stollen. Deze platen kunnen 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
2. Vermeerdering van C. elegans
- Plaats 100 μL 's nachts gekweekte E. coli OP50 in het midden van elke NGM-plaat en laat de platen 24 uur drogen in een laminaire kap. Vervolgens kunnen de platen worden opgeslagen in een polystyreencontainer.
OPMERKING: De E. coli OP50-cultuur wordt geteeld in Luria-Bertani (LB) media op 37 °C media voorafgaand aan het zaaien van de platen. De kweek kan 1-2 maanden bij 4 °C worden bewaard en worden gebruikt voor het periodiek zaaien van platen. - Verzamel met behulp van een steriele wormpriem 10-12 gravid volwassen wormen van een eerder gekweekte plaat onder een ontleedmicroscoop. Breng deze wormen over op een verse NGM-plaat gezaaid met E. coli OP50 en incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 20 °C.
- Verwijder na 24 uur met een steriele wormpluk volwassen wormen van de platen. Incubeer de platen bij 20 °C gedurende ~ 3 dagen. Embryo's zullen zich ontwikkelen tot gravid volwassen wormen.
3. Voorbereiding van een synchrone C. elegans cultuur
- Verzamel gravid volwassen wormen in een conische buis van 15 ml door 2-4 platen te wassen met M9W.
- Bereiding van M9W: Los 5 g NaCl, 6 g Na2HPO4en 3 g KH2PO4 op in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 1 L. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C bij een druk van 15 lb/in2 gedurende 30 min. Voeg 1 ml 1 M MgSO4 toe aan de gekoelde oplossing.
- Pellet de wormen door de buis gedurende 1 min op 450 x g te centrifugeren. Decanteer het supernatant zonder de wormkorrel te verstoren.
- Bereid wormlysisoplossing door 400 μL natriumhypochloriet (huishoudelijk bleekmiddel) en 100 μL 5 N NaOH te combineren. Voeg deze oplossing toe aan de wormkorrel en veeg de buis om de inhoud van de buis te mengen. Voorkom overbleaching van de embryo's in de buis door de lysis van de wormen onder een ontledende microscoop te observeren.
- Voeg 10 ml M9W toe aan de conische buis om het lysismengsel te verdunnen wanneer 70% van de volwassen wormen is gelyseerd.
- Centrifugeer de buis gedurende 1 min op 450 x g. Vervang het supernatant door 10 ml M9W.
- Herhaal stap 3.5 twee keer.
- Voeg na het voltooien van de wasstappen 3-5 ml M9W toe om de eierkorrel opnieuw te suspenden. Draai de buis 's nachts met een snelheid van 18 tpm op een buisrotator bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder na de nachtelijke incubatie de buis uit de rotator, pellet de L1-larven door de buis gedurende 1 minuut op 450 x g te centrifugeren. Aspireer de M9W tot 250 μL in de buis blijft.
- Schud de buis om de larven te resuspend. Voeg drie druppels van 5 μL met de larven toe aan een petrischaaldeksel. Tel met behulp van een ontleedmicroscoop het aantal wormen in elke druppel en bepaal het aantal wormen in 1 μL.
4. Voorbereiding van drugstesten
OPMERKING: De stappen in deze test zijn weergegeven in figuur 1.
- Kweek 's nachts 30 ml E. coli OP50 in een conische buis van 50 ml bij 37 °C in een orbitale shaker bij 150 tpm.
- Draai 's nachts gekweekte E. coli OP50-cultuur op 4.000 x g gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 3 ml M9W om de cultuur te concentreren.
- Voeg voorafgaand aan het voorbereiden van de werkoplossingen voor de geneesmiddelentest 0,1 ml (5 mg/ml in 95% ethanol) cholesterol toe aan 100 ml M9W.
- Bereid werkoplossingen voor van elk experimenteel geneesmiddel door elk geneesmiddel plus voertuig te verdunnen (dimethylsulfoxide; DMSO) in 4,8 ml M9W aangevuld met cholesterol om de juiste concentraties te verkrijgen. Los DMSO op in 4,8 ml M9W aangevuld met cholesterol om de voertuigcontrole voor te bereiden.
- Voeg 200 μL geconcentreerde E. coli OP50-cultuur toe aan elke buis die de voertuigbesturings- of drugs- en vortexbuizen bevat om ervoor te zorgen dat ze worden gemengd.
- Om het experiment uit te voeren, voegt u 2 ml van elke werkende medicijnoplossing of voertuigcontrole toe aan elke put in een 12-put weefselkweekplaat. Test elke drugsconcentratie en voertuigcontrole in tweevoud.
- Voeg ~100 L1 larven per put toe (zie synchrone C. elegans kweekstappen) met behulp van een steriele micropipet. Beperk het aantal wormen tot 10 μL.
- Incubeer de platen bij 20 °C.
- Vul putten aan met 50 μL 10x geconcentreerde E. coli OP50 op dag 3 van de test indien nodig.
5. Agarose pad voorbereiding voor microscopie
- Bereid een 2% w/v oplossing van agarose door 0,1 g agarose op te lossen in 5 ml gedeioneerd water. Verwarm de inhoud in een magnetron om de agarose op te lossen. 20 dia's kunnen worden bereid vanaf 5 ml agarose-oplossing.
- Plaats stroken labtape langs twee glazen dia's. De tape zal fungeren als afstandhouders die de dikte van de agarose pads beperken. Plaats daarna een derde schone glazen schuif tussen de getapete dia's.
- Om een agarose pad te maken, spot 100 μL gesmolten agarose op het midden van de schone glijbaan. Plaats nog een schone glazen schuif over en bovenop de agarose en druk voorzichtig naar beneden om een pad te vormen. Verwijder de bovenste dia wanneer de pad is gestold.
6. Observatie van het Muv fenotype in de let-60, let-23 en lin-1 stammen
OPMERKING: Alleen kandidaat-geneesmiddelen die de Muv-fenotypen onderdrukken in let-23- en let-60-stammen worden met behulp van de lin-1-stam bepaald om te bepalen of de remming optreedt op het niveau van RAS of EGFR.
- Wanneer de juiste fase van de levenscyclus is bereikt (3 dagen voor de let-60 en let-23 stammen, 5 dagen voor de lin-1 stam), verwijder je de platen uit de incubator. en verzamel de wormen in 15 ml conische buizen met behulp van een pipet.
- Centrifugeer de buizen gedurende 1 min op 450 x g. Verwijder M9W zonder de wormkorrel te verstoren en voeg 5 ml verse M9W toe.
- Herhaal stap 6.2 twee keer.
- Verwijder zonder de wormkorrel te verstoren alle resterende M9W door aspiratie. Voeg daarna 500 μL 2 mM natrium azide of 2 mM tetramisole hydrochloride toe. Laat buizen bij RT gedurende 15 min. 2 mM natrium azide of 2 mM tetramisole hydrochloride incuberen om de wormen te verdoven voor beeldvorming.
LET OP: Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) draagt bij het hanteren van natrium azide. De oplossing moet onder een chemische kap worden bereid. - Voeg 10 μL van de verdoofde wormsuspensie toe aan het midden van een agarosepad. Plaats een #1,5 deklip voorzichtig over de wormsuspensie. Bevestig indien nodig de hoeslip met wat nagellak om uitdroging te voorkomen.
- Gebruik een DIC microscoop om de let-60(n1046), let-23(sa62) en lin-1(sy254) stammen te observeren. Beeld de wormen op de 10x en 20x vergrotingen.
- Voor let-60(n1046) en let-23(sa62) scoor de volwassen wormen op basis van de aan- of afwezigheid van het Muv-fenotype. Tel voor de lin-1 stam het aantal VPC's dat 1° of 2° cel lot heeft aangenomen aan de ventrale kant van L4 larven met behulp van een hoge resolutie DIC microscoop.
- Na het scoren van de micrografen voor elke stam- en medicamenteuze behandeling, voert u de t-testvan student uit om de statistische verschillen tussen de behandelingen te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We tonen eerst aan dat R-fendiline in staat is om het Muv fenotype te onderdrukken in de let-60(n1046) mutant stam in vergelijking met de DMSO behandelde wormen. Onze gegevens tonen aan dat R-fendiline in staat is om het Muv fenotype in de let-60(n1046) op een dosisafhankelijke manier te blokkeren (Figuur 2A,B). Echter, niet-omkering van het Muv fenotype werd waargenomen in de lin-1 null mutant stam als reactie op toenemende concentraties van R-fendiline (Figuur 2B). De gegevens suggereren dat R-fendiline blokken geactiveerde let-60 signalering op het niveau van RAS in C. elegans. Evenzo zagen we dat het Muv-fenotype significant werd verminderd in de let-23(sa62) stam als reactie op 3, 10 en 30 μM R-fendiline behandeling ten opzichte van de DMSO behandelde wormen (Figuur 2C,D). In alle experimenten werd de student t-toetsgebruikt om de statistische significantie te bepalen.
Figuur 1: Stroomdiagram dat de stappen weergeeft die nodig zijn bij het voorbereiden van de medicijntesten met let-60(n1046), let-23(sa62) en lin-1(sy254) stammen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: R-fendiline verandert let-60 en let-23 functie in C. elegans op een dosisafhankelijke manier. (A) Representatieve beelden van let-60(n1046) wormen in aanwezigheid van voertuig (DMSO) of 30 μM R-fendiline. (B) Kwantificering van het Muv-fenotype bij laat-60(n1046) wormen behandeld in aanwezigheid van DMSO, 3, 10 en 30 μM R-fendiline, of 30 μM U0126. (C) Representatieve beelden van let-23(sa62) wormen in aanwezigheid van voertuig (DMSO) of 30 μM R-fendiline. (D) Kwantificering van het Muv-fenotype bij laat-23(sa62) wormen behandeld in aanwezigheid van DMSO, 3, 10 en 30 μM R-fendiline, of 30 μM U0126. In alle afbeeldingen worden de pseudovulva aangegeven met witte pijlen en normale vulva door witte sterretjes. In totaal werden 60 wormen afgebeeld voor elke behandeling. Het experiment werd 3 keer herhaald. (*** P<0,001 en ** P<0,01 werden als significant beschouwd) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De test die we beschrijven met behulp van de worm zijn eenvoudig en goedkoop om remmers van EGFR en RAS-functie te identificeren. C. elegans is een aantrekkelijk model voor het ontdekken van geneesmiddelen omdat het gemakkelijk te kweken is in het lab vanwege de korte levenscyclus (3 dagen bij 20 °C) en het vermogen om grote aantallen larven te genereren. Wat nog belangrijker is, de EGFR-RAS-ERK MAPK-route is evolutionair en functioneel geconserveerd met zoogdieren die een genetisch tracteerbaar systeem bieden om de effecten van EGFR- en RAS-remmers te analyseren. Verder stelt de transparante aard van de wormen een onderzoeker in staat om verschillende structuren en de lokalisatie van groen fluorescerend eiwit (GFP) of andere fluorofoor versmolten met eiwitten van belang door DIC en fluorescerende microscopie te visualiseren.
De protocollen die we gebruikten om de verschillende C. elegans die in deze studie werden gebruikt te vermeerderen en teonderhouden,waren eerder vastgesteld20,21. Bij de bereiding van NG-platen hebben we echter streptomycine en nystatine opgenomen om bacteriële en schimmelbesmetting te voorkomen. De toevoeging van deze antimicrobiële middelen belemmerde de ontwikkeling van de wormen en de inductie van het Muv-fenotype niet.
Er zijn verschillende voordelen voor het verkrijgen van L1-larven door het wormsynchronisatieprotocol. Veel larven kunnen worden verkregen uit 2 of meer platen met gravid volwassenen en de verzamelde larven zijn allemaal leeftijd gesynchroniseerd. Dit zorgt ervoor dat de ontwikkeling van de wormen consistent is binnen de populatie. Sommige mutante stammen die het Muv-fenotype vertonen, zijn slechte eilagen, wat resulteert in lage opbrengsten van larven, zoals te zien is in de nulmutatie die is opgenomen in de Ets-familietranscriptiefactor lin-119. Bleekbehandeling van de lin-1 gravid volwassenen zal het aantal larven dat nodig is voor de test aanzienlijk verhogen.
Het is van vitaal belang om de lysis van de wormen te observeren tijdens de voorbereiding van een synchrone C. elegans-cultuur. De dikke eierschaal beschermt de embryo's gedeeltelijk tegen de werking van de bleeknatriumhydroxidemix, zelfs als de cuticula van de larven en volwassenen oplossen. Langdurige blootstelling aan de lysisoplossing zal echter deze beschermende behuizing binnendringen, wat leidt tot de dood van de embryo's. Daarom is het belangrijk om de werking van de bleeknatriumhydroxidemix te stoppen wanneer 70% van de volwassen wormen is gelyseerd. Dit wordt bereikt door de lysisoplossing te verdunnen met M9W. Het onderhoud van de gearresteerde L1-larven is een andere stap om te overwegen in het synchrone C. elegans-cultuurprotocol. Langdurige incubatie van de L1 gearresteerde larven in M9W kan ervoor zorgen dat ze veranderen in het dauer-stadium als gevolg van accumulatie van het dauer-feromoon. Om de vorming van het dauerstadium te voorkomen, wordt voorgesteld om de L1-gearresteerde larven binnen 1-2 dagen na het verzamelen van de embryo's te gebruiken.
Het basale Muv fenotype is respectievelijk 60%–90% en 90% voor de let-60(n1046) en let-23(sa62) wormen. Dit suggereert dat de let-60(n1046) wormen onderhevig zijn aan fenotypische drift en daarom is het belangrijk om de basale expressieniveaus van het Muv-fenotype te rapporteren. Behandeling van let-60(n1046) en let-23(sa62) wormen met R-fendiline en andere K-RAS remmers verminderen het percentage wormen dat het Muv fenotype uitdrukt. Er wordt echter ook gemeld dat sommige remmers van de EGFR-RAS-ERK MAPK-route alleen het aantal pseudovulvae per worm kunnen verminderen of zowel de expressie als het aantal pseudovulvae17kunnen beïnvloeden . Daarom is het belangrijk om het aantal pseudovulvae in de Muv-wormen te tellen in zowel met geneesmiddelen als DMSO behandelde wormen. Het Muv fenotype uitgedrukt in let-60(n1046) en let-23(sa62) volwassen wormen is duidelijk zichtbaar onder een ontledende microscoop. De lin-1 (null) stam is echter relatief ongezond, ontwikkelingsstoornissen en de vulvale uitsteeksels zijn slecht te onderscheiden bij de volwassen wormen. Daarom kunnen IN PLAATS van de ectopische vulvale uitsteeksels, in lin-1 (null) wormen, VPC's die een aangenomen 1° of 2° cel lot aannemen aan de ventrale kant in de L4-fase, worden geteld met behulp van een hoge resolutie DIC-microscoop.
De test is goedkoop, gemakkelijk en niet tijdrovend om in te stellen. Om de verwerkingstijd verder te verbeteren, kunnen de wormen worden verdoofd tot een uiteindelijke concentratie van 2 mM natrium azide in de putten van weefselkweekplaat en worden afgebeeld met behulp van een ontleedmicroscoop uitgerust met een camera. Een andere wijziging van de test zou zijn om warmte gedode E. coli OP50 te gebruiken in plaats van levende bacteriën23. Het is aangetoond dat bacteriën bepaalde kleine moleculen kunnen metaboliseren, wat leidt tot verminderde bioactiviteit24.
Eerdere studies hebben aangetoond dat de inductie van de vulva in de worm afhankelijk is van bepaalde omgevingssignalen. De vulvaless fenotypes van lin-3(n378) en let-23(n1045) zijn gedeeltelijk onderdrukt door verhongering en het verlaten van de dauer fase14. Bovendien toonde een studie van Moghal et al., aan dat vulvaless lin-3(n378), let-23(sy1) en let-60(sy95dn) mutanten gekweekt in M9 buffer een hoger aantal VPC's hadden die vulval cell fates aanname in vergelijking met dieren gekweekt op standaard NG-platen24. De gegevens suggereren dat wormen gekweekt in een vloeibare omgeving vulval inductie beïnvloeden. In onze studies hebben we echter de onderdrukking van het Muv-fenotype in een vloeibare omgeving niet waargenomen.
In dit protocol demonstreren we het gebruik van C. elegans om de anti-RAS eigenschappen van fendiline te evalueren. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat meerdere zure sphingomyelinaseremmers, waaronder tricyclische antidepressiva zoals desipramine, imipramine en amitriptyline, het Muv-fenotyperemmen 18. Bovendien onderdrukken remmers van de sphingomyeline- en ceramidebiosyntheseroutes het Muv-fenotype, uitgedrukt in de let-60(n1046) wormen. Deze bevindingen met behulp van de worm werden gevalideerd in zoogdiercellijnen.
Concluderend tonen we het gebruik van C. elegans aan om remmers van EGFR- en RAS-activiteit te identificeren in een vloeistofgebaseerde test. Bovendien biedt de worm een ander systeem om de werkingsmechanismen van anti-RAS- en EGFR-therapieën te identificeren en te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We danken Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) voor het leveren van de let-60(n1046). We danken ook Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences &Technology in Houston) voor de lin-1 soort. Tot slot bedanken we Dr. Danielle Garsin en haar lab (De Universiteit van Texas, McGovern Medical School) voor het verstrekken van enkele van de reagentia. Sommige wormstammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dit onderzoek werd ondersteund door de Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) subsidie RP200047 aan JF Hancock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
References
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
