Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

Published: October 5, 2020 doi: 10.3791/61788
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

Summary

אלגנס נמטודה מתיחה גנטית Caenorhabditis יכול לשמש מודל פשוט וזול לגילוי תרופות. מתואר כאן פרוטוקול לזיהוי טיפולי נגדים המעכבים את האיתות במורד הזרם של חלבוני RAS ו- EGFR.

Abstract

השינויים לוקליזציה קרום פלזמה של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) ואת המחולל במורד הזרם שלה RAS היו מעורבים במספר מחלות כולל סרטן. הנמטודה C. elegans החיים החופשיים מחזיקה מפל אות EGFR-RAS-ERK MAP אבולוציוני ומשומר מבחינה תפקודית, שהוא מרכזי להתפתחות הפות. רווח של מוטציות פונקציה בהומולוגיה RAS LET-60 ו EGFR הומולוג LET-23 לגרום לדור של פסאודובולבה חוץ רחמית לא מתפקדת גלויה לאורך דופן הגוף הגחון של תולעים אלה. בעבר, פנוטיפ multivulval (Muv) בתולעים אלה הוכח להיות מעוכב על ידי מולקולות כימיות קטנות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בתולעת ב- assay מבוסס נוזל כדי לזהות מעכבים שמבטלים את הפעילות של חלבוני EGFR ו- RAS. באמצעות מטען זה, אנו מראים R-פנדלין, מעכב עקיף של K-RAS, מדכא את פנוטיפ Muv לידי ביטוי let-60(n1046) ו let-23(sa62) תולעים מוטנטיות. הבדיקה היא פשוטה, זולה, אינה גוזלת זמן להתקנה, וניתן להשתמש בה כפלטפורמה ראשונית לגילוי טיפולי נגד נגד.

Introduction

המסלולים התאיים המסדירים אירועים התפתחותיים בתוך אורגניזמים נשמרים מאוד בקרב כל metazoans. מסלול אחד כזה הוא EGFR-RAS-ERK מיטוגן מופעל חלבון קינאז (MAPK) איתות מפל שהוא מסלול קריטי השולט התפשטות תאים, בידול, הגירה והישרדות1,2. פגמים במסלול איתות זה יכולים להוביל מצבים פתולוגיים או מחלות כגון סרטן. קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR) הראה שהוא בא לידי ביטוי רב בגידולים אנושיים, כולל 50% של קרצינומות תאיקשקשאוראליים, ותורם להתפתחות גידולים ממאירים 3,4,5. בעוד מוטציות בשלושת איזופורמים RAS H-, K- ו- N-RAS הם מניעים עיקריים לשינוי ממאיר בסרטן אנושי מרובה. בין אלה שלושה isoforms RAS, מוטציות oncogenic ב K-RAS הם הנפוצים ביותר6,7,8. כדי ש-EGFR ו-RAS יפעלו, הם חייבים להתאים את קרום הפלזמה (PM). מניעת לוקליזציה של מולקולות אלה לראש הממשלה יכולה לעצור לחלוטין את הפעילות הביולוגית של מסלול איתות זה9,10. מכאן עיכוב של לוקליזציה של חלבונים אלה לראש הממשלה היא אסטרטגיה טיפולית כדי לחסום את איתות במורד הזרם ואת התוצאות השליליות וכתוצאה מכך. באמצעות בדיקת סינון בעלת תוכן גבוה, פנדלין, חוסם תעלות סידן מסוג L, זוהה כמעכב של פעילות K-RAS11. ננו-הכללה של K-RAS לעלון הפנימי של ראש הממשלה מצטמצמת באופן משמעותי בנוכחות פנדילין. יתר על כן, K-RAS מופץ מחדש מקרום הפלזמה לרטיקולום אנדופלסמי (ER), מנגנון גולגי, אנדוזומים וציטוסול. חשוב מכך, התפשטות של קווי תאים סרטניים בלבלב, המעי הגס, הריאות וארירית הרחם המבטאות מוטציה אונקוגנית K-RAS נחסמת על ידי עיכוב של איתות במורד הזרם על ידי פנדלין11. נתונים אלה מציעים פנדלין פונקציות כמו טיפול נגד K-RAS ספציפי שגורם לוקליזציה שגויה של חלבון RAS לראש הממשלה.

אלגנס מנמודה Caenorhabditis נחקר בהרחבה בהקשר של התפתחות. רבים מנתולי האות השולטים בהתפתחות התולעת הם אבולוציוניים ושמורבים מבחינה תפקודית. לדוגמה, ההפעלה המתווכת של EGFR של RAS וההפעלה הבאה של מפל האות ERK MAPK נשמרים בתולעת12. המפל מיוצג על ידי החלבונים הבאים: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 הוא הומולוגי ל RAS, בעוד LET-23 הוא הומולוגי EGFR. בתולעת, מסלול זה מסדיר את התפתחות הפות13. הפות הוא צמצם אפיתל על דופן הגוף הגחון של התולעת המאפשרת להניח ביצים מופרות. היווצרות הפות בתולעת תלויה בחשיפה של תאי המבשר הפותיים (VPC) למעבר צבע של הפעלת מפל האות EGFR-RAS-MAPK. במהלך ההתפתחות הרגילה, VPCs הפרוקסימלי לקבל אותות חזקים מתאי עוגן gonadal להבדיל לתוך 1° ו 2° גורל תאים אשר מעוררים פותפונקציונלית 12. בעוד ש-VPCs דיסטליים מבדילים לגורלי תאים של 3° שמתמזגים לסנכרון ההיפודרמלי ואינם יוצרים פות עקב איתות מדולדל. בהיעדר איתות, כל ה-VPCs מבדילים לגורל תאים של 3° וכתוצאה מכך נוצרים פות. עם זאת, איתות מהווה גורם מוביל להיווצרות פות אחת או יותר שאינה פונקציונלית בשל האינדוקציה של כל ה-VPN להניח גורל תא של 1° ו-2°.

מוטציות הגורמות אינדוקציה פות פגומה או מוגזמת זוהו עבור רבים מהגנים המקודדים חלבונים המייצגים מסלול זה. אינדוקציה פות פגומה גורמת פנוטיפ vulvaless (Vul), בעוד אינדוקציה פות מוגזמת תוצאות פנוטיפ multivulva (Muv) המיוצג על ידי התפתחות של פסאודוטובה חוץ רחמית לא מתפקדת רבים לאורך דופן הגוף הגחון. ה פנוטיפ Muv לידי ביטוי על ידי זן let-60(n1046) נובע רווח של מוטציה פונקציה ב RAS, בעוד בזן let-23(sa62) זה נובע מוטציה מפעילה EGFR14,15. פנוטיפ Muv חזק בזנים מוטנטיים אלה הוכח להיות מוטרד על ידי התערבויות פרמקולוגיות כפי שהוכח על ידי הטיפול של let-60(n1046) תולעים עם מעכב MEK-1 U012616,17. מעניין, הראינו כי R-פנדלין ומעכבים המשפיעים על חילוף החומרים של sphingomyelin לדכא את פנוטיפ Muv בתולעת18. כדי להדגים מעכבים אלה לחסום let-60 איתות ברמה של RAS, זן האפס lin-1 כבר מנוצל17. Lin-1 הוא גורם שעתוק מעכב דמוי Ets המתפקד כמדכא בהתפתחות הפות19. חזרה חזקה של פנוטיפ Muv בתולעים let-60(n1046) ואין השפעה על תולעים ריקות lin-1 מציע כי עכבות אלה מתרחשים ברמה של RAS.

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש ב- C. elegans כמודל לזיהוי מעכבים של חלבוני RAS ו- EGFR. באמצעות מצודה מבוססת נוזלים, אנו מדגימים את ההשפעות המעכבות של R-fendiline על ידי דיכוי פנוטיפים Muv ב let-60(n1046) ו let-23(sa62) זנים מוטנטיים של C. elegans. הבדיקה הזו מאמתת את השימוש ב- C. elegans ככלי בשלב הראשוני של גילוי תרופות לטיפולים נגד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת צלחת בינונית לצמיחה נמטודה (NGM)

  1. הוסף 2.5 גרם של פפטון ו 3 גרם של NaCl ל 970 מ"ל של מים deionized הכלולים בקבוק 2 L ארלנמייר. מערבבים את התכולה באמצעות מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן, להוסיף 20 גרם של אגר לבקבוקון. יש לקלף אוטומטית את תכולת הבקבוקון ב-121 °C (70 °F) ולחץ של 15ליברות/ב-2 למשך 30 דקות. לאחר עיקור, מניחים את הבקבוקון על צלחת ערבוב ומאפשרים למדיום להתקרר עד שהטמפרטורה מגיעה ל -50 מעלות צלזיוס.
  2. כדי להכין את לוחות NGM להוסיף את ריאגנטים הבאים למדיום מקורר: 25 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט חוצץ (pH = 6.0), 1 מ"ל של 1 M MgSO4, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של (5 מ"ג / מ"ל ב 95% אתנול) כולסטרול, 1 מ"ל של (10% v / w באתנול) nystatin, ו 1 mL של 25 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין.
  3. תחת זרימה למינארית, יוצקים את המדיום מקורר לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ סטרילי פטרי. תן את הצלחות להתמצזק במשך 2 שעות. צלחות אלה ניתן לשמור במשך חודש אחד ב 4 °C (5 °F).

2. הפצת ג. אלגנס

  1. ספוט 100 μL של לילה גדל E. coli OP50 על המרכז של כל צלחת NGM ולאפשר הצלחות להתייבש במשך 24 שעות במכסה המנוע למינאר. לאחר מכן, הלוחות ניתן לאחסן במיכל פוליסטירן.
    הערה: תרבות E. coli OP50 גדלה בתקשורת לוריא-ברטאני (LB) במדיה 37 °C לפני זריעת הצלחות. התרבות יכולה להיות מאוחסנת ב 4 °C (55 °F) במשך 1-2 חודשים ומשמשת זריעת צלחות תקופתית.
  2. באמצעות בחירת תולעים סטרילית, לאסוף 10-12 תולעים בוגרות gravid מצלחת שגדלה בעבר תחת מיקרוסקופ מנתח. העבר תולעים אלה ללוח NGM טרי זרעים עם E. coli OP50 ודגרת הצלחת במשך 24 שעות ב 20 °C (70 °F).
  3. לאחר השעה 24 שעות, באמצעות פיק תולעים סטרילי להסיר תולעים בוגרות מהצלחות. לדגור על הצלחות ב 20 °C (50 °F) במשך ~ 3 ימים. עוברים יתפתחו לתולעים בוגרות.

3. הכנת תרבות סי אלגנס סינכרונית

  1. לאסוף תולעים מבוגרות gravid לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל על ידי שטיפת 2-4 צלחות עם M9W.
    1. הכנת M9W: להמיס 5 גרם של NaCl, 6 גרם של Na2HPO4, ו 3 גרם של KH2PO4 במים deionized לנפח סופי של 1 L. Autoclave הפתרון ב 121 °C בלחץ של 15 lb / ב2 במשך 30 דקות. יש להוסיף 1 מ"ל של 1 M MgSO4 לפתרון מקורר.
  2. גלולה התולעים על ידי centrifuging הצינור ב 450 x g במשך 1 דקות. דק את supernatant מבלי להפריע לכדור התולעת.
  3. הכן תמיסת תולעת על ידי שילוב של 400 μL של 8.25% נתרן hypochlorite (אקונומיקה ביתית) ו 100 μL של 5 N NaOH. הוסף פתרון זה לכדור התולעת והעיף את הצינור כדי לערבב את התוכן של הצינור. למנוע להלבנה יתר של העוברים בצינור על ידי התבוננות תמוגה של התולעים תחת מיקרוסקופ ניתוח.
  4. הוסף 10 מ"ל של M9W לצינור החרוט כדי לדלל את תערובת תמוגה כאשר 70% מהתולעים הבוגרות יש ליס.
  5. צנטריפוגה הצינור ב 450 x גרם במשך 1 דקות. החלף את supernatant עם 10 מ"ל של M9W.
  6. חזור על שלב 3.5 פעמיים.
  7. לאחר השלמת שלבי הכביסה, להוסיף 3-5 מ"ל של M9W כדי resuspend את כדורי הביצה. סובב את הצינור למשך הלילה במהירות של 18 סל"ד על סיבוב צינור בטמפרטורת החדר (RT).
  8. לאחר דגירה לילה, להסיר את הצינור מן המסובב, גלולה זחלי L1 על ידי centrifuging הצינור ב 450 x גרם במשך 1 דקות. לשאוף M9W עד 250 μL נשאר בצינור.
  9. לנער את הצינור כדי respend הזחלים. מוסיפים שלוש טיפות μL המכילות את הזחלים על מכסה צלחת פטרי. באמצעות מיקרוסקופ מנתח לספור את מספר התולעים בכל טיפה ולקבוע את מספר התולעים ב 1 μL.

4. הכנת עשיית סמים

הערה: השלבים בבחון זה מוצגים באיור 1.

  1. לגדל 30 מ"ל של E. coli OP50 בצינור חרוט 50 מ"ל ב 37 °C (57 °F) לילה בשייקר מסלולית ב 150 סל"ד.
  2. ספין בן לילה גדל E. coli OP50 תרבות ב 4,000 x g במשך 10 דקות כדי כדורי התאים. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 3 מ"ל של M9W כדי לרכז את התרבות.
  3. לפני הכנת פתרונות העבודה לבדיקת התרופה, להוסיף 0.1 מ"ל של (5 מ"ג / מ"ל ב 95% אתנול) כולסטרול לתוך 100 מ"ל של M9W.
  4. הכן פתרונות עבודה של כל תרופה ניסיונית על ידי דילול כל תרופה פלוס רכב (דימתיל סולפוקסיד; DMSO) ב 4.8 מ"ל M9W בתוספת כולסטרול כדי להשיג את הריכוזים המתאימים. להמיס DMSO ב 4.8 מ"ל של M9W בתוספת כולסטרול כדי להכין את בקרת הרכב.
  5. הוסף 200 μL של תרבות מרוכזת E. coli OP50 לכל צינור המכיל את בקרת הרכב או סמים וצינורות מערבולת כדי להבטיח שהם מעורבים.
  6. כדי לבצע את הניסוי, להוסיף 2 מ"ל של כל פתרון סמים עובד או בקרת רכב לכל באר בצלחת תרבית רקמות 12 טוב. בדוק כל ריכוז סמים ובקרת רכב כפול.
  7. הוסף ~ 100 זחלי L1 לבאר (ראה שלבי תרבות C. elegans סינכרוניים) באמצעות מיקרופיט סטרילי. הגבל את נפח התולעים ל- 10 μL.
  8. לדגור על הצלחות ב 20 °C (50 °F).
  9. תוספת בארות עם 50 μL של 10x מרוכז E. coli OP50 ביום 3 של ההסמכה במידת הצורך.

5. הכנת כרית אגרוז למיקרוסקופיה

  1. הכן 2% w / v פתרון של אגרוז על ידי המסת 0.1 גרם של אגרוז ב 5 מ"ל של מים deionized. מחממים את התוכן במיקרוגל כדי להמיס את האגורוז. ניתן להכין 20 שקופיות מפתרון אגרוז 5 מ"ל.
  2. מניחים רצועות של סרט מעבדה לאורך שתי שקופיות זכוכית. הקלטת תפעל כמרווחים המגבילים את עובי רפידות האגורוז. לאחר מכן, הנח שקופית זכוכית נקייה שלישית בין השקופיות המודבקות.
  3. כדי להפוך כרית אגרוז, לזהות 100 μL של אגה מותכת על מרכז המגלשה הנקייה. מניחים עוד מגלשת זכוכית נקייה על גבי האגורוז ולחץ בעדינות כלפי מטה כדי ליצור כרית. הסר את השקופית העליונה כאשר הפנקס התמצק.

6. התבוננות בפנוטיפ של מואב בזני let-60, let-23 ו-lin-1

הערה: רק תרופות מועמד לדכא את פנוטיפים Muv ב let-23 ו let-60 זנים ייבחנו באמצעות זן lin-1 כדי לקבוע אם העיכוב מתרחשת ברמה של RAS או EGFR.

  1. כאשר מגיע לשלב המתאים של מחזור החיים (3 ימים עבור לזנים let-60 ו let-23, 5 ימים עבור זן lin-1), להסיר את הצלחות מן האינקובטור. ולאסוף את התולעים בצינורות חרוט 15 מ"ל באמצעות פיפטה.
  2. צנטריפוגות הצינורות ב 450 x g במשך 1 דקות. להסיר M9W מבלי להפריע גלולה תולעת ולהוסיף 5 מ"ל של M9W טרי.
  3. חזור על שלב 6.2 פעמיים.
  4. מבלי להפריע לכדור התולעת, הסר את כל ה- M9W הנותרים על ידי שאיפה. לאחר מכן, להוסיף 500 μL של 2 mM נתרן אזיד או 2 mM טטרמיסול הידרוכלוריד. אפשר צינורות לדגור ב RT במשך 15 דקות. 2 mM נתרן אזיד או 2 mM טטרמיסול הידרוכלוריד יהיה למרדים את התולעים להדמיה.
    אזהרה: הקפד ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) בעת טיפול נתרן אזיד. הפתרון חייב להיות מוכן תחת מכסה המנוע הכימי.
  5. הוסף 10 μL של השעיית תולעת מרדים למרכז כרית אגרוז. מניחים כיסוי #1.5 בעדינות מעל מתלה התולעת. במידת הצורך, לתקן את כיסוי עם קצת לק כדי למנוע התייבשות.
  6. השתמש במיקרוסקופ DIC כדי לבחון את הזנים let-60(n1046), let-23(sa62) ו- lin-1(sy254). צלם את התולעים בהגדלות של פי 10 ו-20.
  7. עבור let-60(n1046) ו let-23(sa62), להבקיע את התולעים הבוגרות בהתבסס על נוכחות או היעדר פנוטיפ Muv. בעוד שעבור זן lin-1, לספור את מספר VPCs שאימצו 1° או 2° גורל תא בצד הגחון של זחלי L4 באמצעות מיקרוסקופ DIC ברזולוציה גבוהה.
  8. לאחר ניקוד המיקרוגרפים עבור כל זן וטיפול תרופתי, בצעו את בדיקתt של התלמיד כדי לקבוע את ההבדלים הסטטיסטיים בין הטיפולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מדגימים תחילה כי R-פנדלין מסוגל לדכא את פנוטיפ Muv בזן המוטנטי let-60(n1046) בהשוואה לתולעים שטופלו ב- DMSO. הנתונים שלנו מראים כי R-fendiline הוא מסוגל לחסום את פנוטיפ Muv ב let-60(n1046) באופן תלוי מינון(איור 2A,B). עם זאת, אי היפוך של פנוטיפ Muv נצפתה בזן מוטציה null lin-1 בתגובה לריכוזים גוברים של R-fendiline (איור 2B). הנתונים מצביעים על כך בלוקים R-פנדלין מופעל let-60 איתות ברמה של RAS ב C. elegans. באופן דומה, ראינו את פנוטיפ Muv צומצם באופן משמעותי בזן let-23(sa62) בתגובה 3, 10 ו 30 מיקרומטר R-fendiline טיפול ביחס תולעים שטופלו DMSO (איור 2C,D). בכל הניסויים, נעשה שימוש ב-t-testשל סטודנטים כדי לקבוע את המשמעות הסטטיסטית.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה המייצג את השלבים הכרוכים בהכנת התרופות באמצעות זני let-60(n1046), let-23(sa62) ו-lin-1(sy254). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: R-פנדלין משנה את תפקוד ה-let-60 ו-let-23 ב-C. elegans באופן תלוי מינון. (A)תמונות מייצגות של תולעי let-60(n1046) בנוכחות רכב (DMSO) או 30 μM R-fendiline. (B)כימות של פנוטיפ Muv בתולעים let-60(n1046) שטופלו בנוכחות DMSO, 3, 10 ו 30 מיקרומטר R-פנדלין, או 30 μM U0126. (C)תמונות מייצגות של תולעי let-23(sa62) בנוכחות רכב (DMSO) או 30 מיקרומטר R-פנדלין. (D)כימות של פנוטיפ Muv בתולעים let-23(sa62) שטופלו בנוכחות DMSO, 3, 10 ו 30 מיקרומטר R- פנדלין, או 30 μM U0126. בכל התמונות pseudovulva מסומנים על ידי חצים לבנים ופות נורמליות על ידי כוכביות לבנות. בסך הכל 60 תולעים צולמו עבור כל טיפול. הניסוי חזר על עצמו 3 פעמים. (*** P<0.001 ו-** P<0.01 נחשבו משמעותיים) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההסתה שאנו מתארים באמצעות התולעת היא פשוטה וזולה לזיהוי מעכבים של פונקציית EGFR ו- RAS. C. elegans הוא מודל אטרקטיבי לגילוי סמים כי זה קל לגדול במעבדה בשל מחזור החיים הקצר (3 ימים ב 20 °C (20 °C) ואת היכולת לייצר מספר גדול של זחלים. חשוב מכך, מסלול EGFR-RAS-ERK MAPK נשמר מבחינה אבולוציונית ותפקודית עם יונקים המספקים מערכת מתיחה גנטית כדי לנתח את ההשפעות של מעכבי EGFR ו- RAS. יתר על כן, האופי השקוף של התולעים מאפשר לחוקר לדמיין מבנים נפרדים ולוקליזציה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או פלואורופור אחר הותך לחלבונים מעניינים על ידי DIC ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

הפרוטוקולים שבהם השתמשנו כדי להפיץ ולתחזק את C. elegans שונים המשמשים במחקר זה הוקמו בעבר20,21. עם זאת, בהכנת לוחות NG שילבנו סטרפטומיצין וניסטטין כדי למנוע זיהום חיידקי ופטריות. התוספת של סוכנים מיקרוביאליים אלה לא לעכב את התפתחות התולעים ואת האינדוקציה של פנוטיפ Muv.

ישנם מספר יתרונות להשגת זחלי L1 על ידי פרוטוקול סינכרון התולעים. ניתן להשיג זחלים רבים מ-2 צלחות או יותר המכילות מבוגרים gravid והזחלים שנאספו מסונכרנים כולם בגיל. זה מבטיח פיתוח של התולעים הוא עקבי בתוך האוכלוסייה. כמה זנים מוטנטיים המציגים את פנוטיפ Muv הם שכבות ביצה עניות וכתוצאה מכך תשואות נמוכות של זחלים כפי שניתן לראות במוטציה null המוחזקת בגורם התמלול המשפחתי Ets lin-119. טיפול אקונומיקה של לין-1 מבוגרים gravid יגדיל באופן משמעותי את מספר הזחלים הנדרשים לבדיקה.

חיוני להתבונן בתזה של התולעים במהלך הכנת תרבות C. elegans סינכרונית. קליפת הביצה העבה מגנה חלקית על העוברים מפני פעולת תערובת ההידרוקסידית של אקונומיקה-נתרן אפילו כאשר הזחלים והמבוגרים מתמוססים. עם זאת, חשיפה ממושכת לתמיסת התמרפה תחדור את המעטפת המגנה הזו המובילה למות העוברים. לכן חשוב להפסיק את הפעולה של תערובת אקונומיקה-נתרן הידרוקסיד כאשר 70% מהתולעים הבוגרות יש ליס. זה מושגת על ידי דילול פתרון תמוז עם M9W. התחזוקה של זחלי L1 שנעצרו היא צעד נוסף שיש לקחת בחשבון בפרוטוקול התרבות הסינכרוני של C. elegans. דגירה ממושכת של זחלי L1 שנעצרו ב- M9W יכולה לגרום להם להפוך לשלב דאואר עקב הצטברות של פרומון דאואר. כדי למנוע היווצרות של שלב דאואר, מומלץ להשתמש L1 נעצר זחלים בתוך 1-2 ימים של איסוף העוברים.

הפנוטיפ של מואב הוא 60%-90% ו-90% עבור התולעים let-60(n1046) ו-let-23(sa62), בהתאמה. זה מרמז על תולעי let-60(n1046) כפופים להסחפה פנוטיפית, ולכן, חשוב לדווח על רמות הביטוי הבזליות של פנוטיפ Muv. טיפול של let-60(n1046) ו let-23(sa62) תולעים עם R-פנדלין ומעכבי K-RAS אחרים להפחית את אחוז התולעים מבטאות את פנוטיפ Muv. עם זאת, הוא דיווח גם כי כמה מעכבים של מסלול EGFR-RAS-ERK MAPK עשוי להפחית את מספר pseudovulvae לכל תולעת לבד או עשוי להשפיע הן על הביטוי ואת מספר pseudovulvae17. לכן חשוב לספור את מספר pseudovulvae בתולעי Muv הן תולעים שטופלו בתרופה והן DMSO מטופלים תולעים. פנוטיפ Muv שבא לידי ביטוי let-60(n1046) ו let-23(sa62) תולעים בוגרות גלוי בבירור תחת מיקרוסקופ ניתוח. עם זאת, זן lin-1 (null) הוא יחסית לא בריא, לקוי התפתחותית ואת בליטות הפות הם מכובדים בצורה גרועה בתולעים הבוגרות. לכן, במקום בליטות הפות הקטופיות, בתולעים lin-1 (null), ניתן לספור VPCs שמאמצים גורל תא מאומץ של 1° או 2° בצד הגחון בשלב L4, ניתן לספור באמצעות מיקרוסקופ DIC ברזולוציה גבוהה.

ההסתה זולה, קלה ולא גוזלת זמן רב להתקנה. כדי לשפר עוד יותר את זמן העיבוד, התולעים יכולות להיות מרותקות לריכוז סופי של 2 מ"מ נתרן אזיד בתוך הבארות של צלחת תרבית הרקמות ותמונה באמצעות מיקרוסקופ ניתוח מצויד במצלמה. שינוי נוסף של בדיקת יהיה להשתמש בחום נהרג E. coli OP50 במקום חיידקים חיים23. הוכח כי חיידקים יכולים לעכל מולקולות קטנות מסוימות המובילות bioactivities מופחת24.

מחקרים קודמים הראו כי אינדוקציה של הפות בתולעת תלויה רמזים סביבתיים מסוימים. הפנוטיפים הפותיים של lin-3(n378) ו let-23(n1045) הראו שהם מדוכאים חלקית על ידי רעב ויציאה משלב דאואר14. יתר על כן, מחקר של Moghal et al., הראה כי lin-3-3(n378), let-23(sy1) ו let-60(sy95dn) מוטציות גדלו במאגר M9 היה מספר גבוה יותר של VPCs בהנחה גורל תאים פות לעומת בעלי חיים גדל על לוחות NG סטנדרטיים24. הנתונים מצביעים על כך שהתולעים הגדלות בסביבה נוזלית משפיעות על אינדוקציה פותית. עם זאת, במחקרים שלנו לא ראינו את הדיכוי של פנוטיפ Muv בסביבה נוזלית.

בפרוטוקול זה אנו מדגימים את השימוש של C. elegans כדי להעריך את המאפיינים נגד RAS של פנדילין. במחקר קודם, הראינו כי מעכבי sphingomyelinase חומצה מרובים, כולל תרופות טריציקליות כגון desipramine, imipramine, ו amitriptyline לעכב את פנוטיפ Muv18. יתר על כן, מעכבי המסלולים הביוסינתזה sphingomyelin ו ceramide לדכא את פנוטיפ Muv לידי ביטוי תולעים let-60(n1046). ממצאים אלה באמצעות התולעת אומתו בקווי תאים של יונקים.

לסיכום, אנו מדגימים את השימוש של C. elegans כדי לזהות מעכבים של פעילות EGFR ו RAS בבדיקה מבוססת נוזל. יתר על כן, התולעת מספקת מערכת אחרת כדי לזהות ולאפיין את מנגנוני הפעולה של טיפולי אנטי RAS ו- EGFR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר סוואטי ארור (MD אנדרסון מרכז הסרטן) על מתן let-60(n1046). אנו מודים גם לד"ר דיוויד ריינר (המכון למדעי הבריאות בטקסס A&M ביו-מדע וטכנולוגיה ביוסטון) על זן הלין-1. לבסוף, אנו מודים לד"ר דניאל גארסין ולמעבדה שלה (אוניברסיטת טקסס, בית הספר לרפואה מקגוורן) על שסיפקו חלק מהריגנטים. כמה זני תולעת סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). מחקר זה נתמך על ידי המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT) מענק RP200047 JF הנקוק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and chemicals
Agarose  Millipore Sigma  A9539-50G
Bacto Peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
Magnesium Sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
R-Fendiline Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide Millipore Sigma  S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite  Bleach
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride Millipore Sigma  L9756
UO126 (MEK inhibitor) Millipore Sigma  19-147
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 50-197-4804
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
MT2124   let-60(n1046) IV. CGC
MT7567 lin-1(sy254) IV. CGC
PS1839 let-23(sa62) II. CGC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
  2. Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
  3. Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
  4. Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
  5. Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
  6. Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
  7. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
  8. Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
  9. Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
  10. Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
  11. van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
  12. Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
  13. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
  14. Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
  15. Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
  16. Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
  17. Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
  18. van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
  19. Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  23. Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
  24. Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).

Tags

חקר הסרטן גיליון 164 אלגנס קאנורהבדיטיס LET-60 LET-23 K-RAS EGFR GFP
זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות <em>אלגנים של Caenorhabditis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Hoeven, D., Truong, T. N.… More

van der Hoeven, D., Truong, T. N. L., Naji, A., Thapa, S., Hancock, J. F., van der Hoeven, R. Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (164), e61788, doi:10.3791/61788 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter