Summary
유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.
Abstract
표피 성장 인자 수용체(EGFR)와 다운스트림 이펙터 RAS의 혈장 막 국소화의 변화는 암을 포함한 여러 질병에 연루되어 있다. 자유 살아있는 선충 C. elegans는 외음부의 발달을 위한 중심인 진화적이고 기능적으로 보존된 EGFR-RAS-ERK MAP 신호 폭포를 가지고 있습니다. RAS homolog LET-60 및 EGFR homolog LET-23에서 기능 돌연변이의 이득은 이러한 웜의 복부 바디 월을 따라 눈에 보이는 비기능성 외투 성 의사 물음부의 생성을 유도한다. 이전에는 이러한 웜에서 다발성(Muv) 표현형이 작은 화학 분자에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 여기서 우리는 EGFR 및 RAS 단백질의 활동을 폐지하는 억제제를 확인하기 위해 액체 기반 분석에서 웜을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 분석법을 사용하여, 우리는 R-fendiline, K-RAS의 간접 억제제를 보여주고, let-60 (n1046) 및 let-23 (sa62) 돌연변이 벌레에 표현된 Muv 표현형을 억제합니다. 분석은 간단하고 저렴하며 설정에 시간이 많이 걸리지 않으며 항암 치료제의 발견을위한 초기 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
Introduction
유기체 내의 발달 사건을 통제하는 세포 통로는 모든 메타조인 사이에서 높게 보존됩니다. 이러한 경로 중 하나는 EGFR-RAS-ERK 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 신호 캐스케이드이며 세포 증식, 분화, 이주 및 생존1,2를제어하는 중요한 통로이다. 이 신호 통로에 있는 결점은 암과 같은 병리학 또는 질병 국가로 이끌어 낼 수 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 구강 편평상피 세포 암종의 50%를 포함하여 인간 종양에서 높게 발현되는 것으로 나타났으며, 악성 종양3,4,5의발달에 기여한다. 3개의 RAS 동위상체에 있는 돌연변이는 H-, K-및 N-RAS는 다중 인간적인 암에 있는 악성 변환을 위한 중요한 동인인 인 반면. 이 세 가지 RAS 동소 형태 중, K-RAS의 종양 발생 돌연변이는가장널리 퍼진6,7,8. EGFR과 RAS가 작동하려면 플라즈마 멤브레인(PM)으로 국한되어야 합니다. PM에 이러한 분자의 국소화를 방지하면 이 신호 경로9,10의생물학적 활성을 완전히 부정할 수 있다. 따라서 PM에 이러한 단백질의 국소화의 억제는 다운스트림 신호 및 결과 불리 한 결과 차단 하는 치료 전략. 고함량 스크리닝 분석법을 사용하여 L형 칼슘 채널 차단제인 펜딜린(fendiline)은 K-RAS활동(11)의억제제로 확인되었다. K-RAS의 나노 클러스터링은 펜딜린의 존재에서 PM의 내부 전단지에 크게 감소된다. 더욱이, K-RAS는 혈장 막에서 내피성 망상(ER), 골기 장치, 내시경 및 사이토솔로 재분배된다. 더 중요한 것은, 종양유발 돌연변이 K-RAS를 발현하는 췌장, 결장, 폐 및 자궁내막암 세포주의의 증식은펜딜린(11)에의한 하류 신호의 억제에 의해 차단된다. 이러한 데이터는 PM에 RAS 단백질의 잘못된 국소화를 일으키는 특정 K-RAS 항암 치료제로서 펜딜린 기능을 제안합니다.
선충 케노르하비티스 엘레간은 개발의 맥락에서 광범위하게 연구되었습니다. 웜의 발달을 지배하는 많은 신호 경로는 진화적이고 기능적으로 보존됩니다. 예를 들어, EGFR은 RAS의 활성화를 중재하고 ERK MAPK 신호 캐스케이드의 후속 활성화는웜(12)에보존된다. 폭포는 다음과 같은 단백질에 의해 표현된다: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60은 RAS에 동종이며 LET-23은 EGFR에 동종입니다. 웜에서, 이 통로는외음부(13)의발달을 조절한다. 외음부는 수정란을 낳을 수 있도록 벌레의 복부 바디 월의 상피 조리개입니다. 웜내외음부의 형성은 EGFR-RAS-MAPK 신호 캐스케이드의 활성화의 그라데이션에 대한 저속 전구체 세포(VPC)의 노출에 의존한다. 정상 발달 동안 근위 VP는 고나달 앵커 셀로부터 강력한 신호를 수신하여 기능성외음부(12)를야기하는 1° 및 2° 세포 운명으로 분화한다. 탈매 한 VPCs는 피하 싱크티움에 융합하고 고갈 된 신호로 인해 외음부를 형성하지 않는 3 ° 세포 운명으로 분화하는 반면. 신호가 없는 경우 모든 VP는 3° 셀 운명으로 분화하여 외음부가 형성되지 않습니다. 그러나, 구성 신호는 1° 및 2° 세포 운명을 가정하기 위해 모든 VP의 유도로 인해 하나 이상의 비기능 외음부 형성으로 이어집니다.
결함이 있거나 과도한 저속 유도를 일으키는 돌연변이는 이 통로를 나타내는 단백질을 위해 인코딩하는 많은 유전자를 위해 확인되었습니다. 결함이 있는 저속 유도는 외음부(Vul) 표현형을 초래하며, 과도한 저속 유도는 복부 바디 월 전체에 걸쳐 수많은 비기능성 외투성 의사 외음부의 발달로 표현되는 다발음부(Muv) 표현형을 초래한다. let-60(n1046) 균주에 의해 발현된 Muv 표현형은 RAS에서 기능 돌연변이의 이득에 기인하며, let-23(sa62) 균주에서는 EGFR14,15에서돌연변이를 활성화하기 때문이다. 이러한 돌연변이 균주에서 의 강한 Muv 표현형은 MEK-1 억제제 U012616,17을가진 let-60(n1046) 웜의 치료에 의해 입증된 바와 같이 약리학적 개입에 의해 교반되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 우리는 스핑크고미엘린 대사에 영향을 미치는 R-펜딜린 및 억제제가벌레(18)의Muv 표현형을 억제한다는 것을 보여주었다. 이러한 억제제 블록 let-60 을 RAS 수준에서 시그널링하는 것을 입증하기 위해 lin-1 null 균주는17을활용하였다. Lin-1은외음부(19)의발달에서 억압자로 기능하는 Ets와 같은 억제 전사 인자이다. let-60(n1046) 웜에서 Muv 표현형의 강력한 복귀와 lin-1 null 웜에 미치는 영향은 이러한 억제가 RAS 수준에서 발생한다는 것을 시사한다.
이 프로토콜에서, 우리는 RAS와 EGFR 단백질의 억제제를 확인하기 위한 모형으로 C. elegans의 사용을 보여줍니다. 액체 계 분석법을 이용하여, 우리는 Let-60(n1046) 및 Let-23(sa62) C. elegans의돌연변이 균주에서 Muv 표현형을 억제함으로써 R-fendiline의 억제 효과를 입증한다. 이 분석은 항암 치료제에 대한 약물 발견의 초기 단계에서 도구로 C. elegans의 사용을 검증합니다.
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Protocol
1. 선충 성장 매체 (NGM) 플레이트 준비
- 2L 에렌마이어 플라스크에 포함된 970mL의 디온화 된 물에 펩톤 2.5 g와 NaCl 3 g을 추가합니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 내용물들을 저어줍니다. 그 후 플라스크에 20g의 한고를 넣습니다. 플라스크의 내용내용은 121°C에서, 30분 동안 15파운드/in2의 압력을 가한다. 살균 후 플라스크를 교반판에 놓고 온도가 50°C에 도달할 때까지 매체를 식힙니다.
- NGM 플레이트를 준비하기 위해 냉각 된 매체에 다음 시약을 추가 : 1 M 칼륨 인산염 버퍼 (pH = 6.0),1 mL의 1 mL4,1 M CaCl2의1 mL, 1 mL (95 % 에탄올에서 5 mg / mL) 콜레스테롤, 1 mL의 (에탄올에서 10% v/w) nystatin, 그리고 1 mL 의 25 mg/mL 연쇄 절제술.
- 라미나르 의 흐름 아래, 60mm x 15mm 멸균 페트리 접시에 냉각 된 매체를 부어. 플레이트가 2시간 동안 굳어지게 합니다. 이 플레이트는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. C. 예인자의 전파
- 하룻밤 재배된 대장균 OP50의 100 μL을 각 NGM 플레이트의 중앙에 점하고 라미나르 후드에서 플레이트가 24시간 동안 건조되도록 합니다. 이어서, 플레이트는 폴리스티렌 용기에 보관할 수 있다.
참고: 대장균 OP50 배양은 플레이트의 파종 전에 37°C 배지에서루리아-베르타니(LB) 배지에서 재배된다. 배양은 1-2 개월 동안 4 °C에서 저장하고 플레이트의 주기적인 파종에 사용할 수 있습니다. - 멸균 벌레 선택을 사용하여 이전에 재배한 판에서 10-12개의 중력성 성웜을 해부하는 현미경으로 수집합니다. 이러한 웜을 대장균 OP50으로 시드된 신선한 NGM 플레이트로 옮기고 20°C에서 24시간 동안 플레이트를 배양한다.
- 24 시간 후, 멸균 웜 픽을 사용하여 접시에서 성인 웜을 제거합니다. ~ 3 일 동안 20 °C에서 플레이트를 배양합니다. 배아는 중력 성동물 벌레로 발전할 것입니다.
3. 동기 C. 예인선 문화의 준비
- M9W로 2-4 플레이트를 세척하여 15mL 원상 관에 중력 성 웜을 수집합니다.
- M9W의 제제: NaCl 5g, Na2HPO46g, KH2PO4 3g을 1L. Autoclave의 최종 부피로 121°C의 최종 부피로 용액을 15lb/in2의 압력으로 30분 동안 용해한다. 냉각된 용액에 1M MgSO4의 1mL를 추가합니다.
- 1 분 동안 450 x g에서 튜브를 원심분리하여 벌레를 펠렛. 웜 펠릿을 방해하지 않고 상류제를 장식합니다.
- 8.25%의 염화나트륨(가정용 표백제)의 400 μL과 5N NaOH의 100 μL을 결합하여 웜 용액을 준비한다. 이 솔루션을 웜 펠릿에 추가하고 튜브의 내용을 혼합하기 위해 튜브를 쓸어 넘깁니다. 해부 현미경의 밑에 벌레의 lysis를 관찰하여 관에 있는 태아의 과표백을 방지합니다.
- 성인 웜의 70%가 lysed경우 리시스 믹스를 희석하기 위해 원문 튜브에 10mL의 M9W를 추가합니다.
- 튜브를 450 x g에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 M9W의 10mL로 교체하십시오.
- 3.5 단계를 두 번 반복합니다.
- 세척 단계를 완료한 후 3-5mL의 M9W를 추가하여 달걀 펠릿을 다시 놓습니다. 실온(RT)에서 튜브 회전기에서 18rpm의 속도로 하룻밤 동안 튜브를 회전합니다.
- 하룻밤 동안 배양 후 회전기에서 튜브를 제거하고 L1 애벌레를 원심분리하여 튜브를 1 분 동안 450 x g로 원심분리합니다. 250 μL이 튜브에 남아있을 때까지 M9W를 흡인합니다.
- 튜브를 흔들어 애벌레를 다시 보냅니다. 페트리 접시 뚜껑에 애벌레가 들어 있는 5μL 방울 3방울을 넣습니다. 해부 현미경을 사용하여 각 낙하의 웜 수를 계산하고 1 μL의 웜 수를 결정합니다.
4. 약물 검사 준비
참고: 이 분석의 단계는 그림 1에표시됩니다.
- 150 rpm에서 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 37 °C에서 50 mL 원문 튜브에서 대장균 OP50의 30 mL성장.
- 하룻밤 동안 성장 한 대장균 OP50 배양을 4,000 x g에서 10 분 동안 세포에 펠릿하십시오. 상체를 제거하고 M9W의 3mL에서 펠릿을 재놓아 문화를 집중한다.
- 약물 분석에 대한 작업 용액을 준비하기 전에 M9W의 100 mL에 콜레스테롤 (95 % 에탄올에서 5 mg / mL) 콜레스테롤의 0.1 mL을 추가하십시오.
- 각 약물 플러스 차량(디메틸 설프리산화물)을 희석하여 각 실험 약물의 작업 용액을 준비합니다. DMSO) 4.8 mL M9W에서 적절한 농도를 얻기 위해 콜레스테롤을 보충하였다. DMSO를 M9W 의 4.8mL에 녹여 차량 제어를 준비하도록 콜레스테롤을 보충합니다.
- 200 μL의 집중 된 대장균 OP50 배양을 차량 제어 또는 약물 및 소용돌이 튜브를 포함하는 각 튜브에 추가하여 혼합되었는지 확인하십시오.
- 실험을 수행하기 위해, 12웰 조직 배양 플레이트에 각 작업 약물 용액 또는 차량 제어의 2mL을 각 우물에 추가한다. 각 약물 농도 및 차량 제어를 복제하여 테스트합니다.
- 멸균 마이크로파이프를 사용하여 우물당 ~100 L1 애벌레를 추가합니다(동기 C. 예르간 배양 단계 참조). 웜의 부피를 10μL로 제한합니다.
- 플레이트를 20°C에서 배양합니다.
- 필요한 경우 분석 3일째에 10배 농축 대장균 OP50의 50μL을 보충합니다.
5. 현미경 검사법을 위한 아가로즈 패드 준비
- 5mL의 해수에서 아가로즈 0.1g을 용해하여 아가로즈의 2%w/v 용액을 준비한다. 내용물들을 전자레인지에 가열하여 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈 용액의 5mL로부터 20개의 슬라이드를 준비할 수 있습니다.
- 두 개의 유리 슬라이드를 따라 실험실 테이프 스트립을 배치합니다. 테이프는 아가로즈 패드의 두께를 제한하는 스페이서 역할을합니다. 그 후, 녹화 된 슬라이드 사이에 세 번째 깨끗한 유리 슬라이드를 배치합니다.
- 아가로즈 패드를 만들려면, 깨끗한 슬라이드의 중앙에 녹은 아가로즈 100 μL을 발견하십시오. 아가로즈 를 가로질러 내려와 서서히 눌러 패드를 형성합니다. 패드가 고형화되면 상단 슬라이드를 제거합니다.
6. 렛-60, 렛-23 및 린-1 균주에서 무브 표현형 의 관찰
참고: LET-23 및 let-60 균주에서 Muv 표현형을 억제하는 후보 약물만 lin-1 균주를 사용하여 분석하여 억제가 RAS 또는 EGFR 수준에서 발생하는지 여부를 결정합니다.
- 수명 주기의 적절한 단계에 도달하면 (let-60 및 let-23 균주에 대한 3 일, 린 -1 균주에 대한 5 일), 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 파이펫을 사용하여 15mL 원물 튜브에서 웜을 수집합니다.
- 원심 분리튜브를 450 x g에서 1분 동안 제거합니다.
- 6.2 단계를 두 번 반복합니다.
- 웜 펠릿을 방해하지 않고, 포부로 남아있는 모든 M9W를 제거하십시오. 그 후, 2mM 나트륨 아지드 또는 2m 테트라미솔 염산염의 500 μL을 추가합니다. 튜브가 15 분 동안 RT에서 배양 할 수 있도록. 2 mM 나트륨 아지드 또는 2 mM 테트라미솔 염산염은 이미징을 위해 벌레를 마취합니다.
주의: 나트륨 아지드를 취급할 때 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 용액은 화학 후드 아래에 준비해야합니다. - 마취된 벌레 서스펜션의 10 μL을 아가로즈 패드 중앙에 추가합니다. #1.5 커버슬립을 웜 서스펜션 위에 부드럽게 놓습니다. 필요한 경우, 건조를 방지하기 위해 몇 가지 매니큐어로 커버 슬립을 수정합니다.
- DIC 현미경을 사용하여 let-60(n1046)및 let-23(sa62) 및 lin-1(sy254) 균주를 관찰한다. 10배 및 20배 배율로 웜을 이미지화합니다.
- let-60(n1046) 및 let-23(sa62)의 경우, Muv 표현형의 존재 또는 부재에 따라 성인 웜을 점수. lin-1 스트레인의 경우 고해상도 DIC 현미경을 사용하여 L4 애벌레의 복부 측에 1° 또는 2° 셀 운명을 채택한 VPC 수를 계산합니다.
- 각 균주와 약물 치료에 대한 현미경 검사를 받은 후 학생의 t-테스트를수행하여 치료 간의 통계적 차이를 결정합니다.
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Representative Results
우리는 먼저 R-펜딜린이 DMSO 처리 된 웜에 비해 let-60 (n1046) 돌연변이 균주에서 Muv 표현형을 억제 할 수 있음을 입증한다. 우리의 데이터는 R-fendiline이 용량 의존적 방식으로 let-60(n1046)에서 Muv 표현형을 차단할 수 있음을보여줍니다(그림 2A, B). 그러나, Muv 표현형의 비반전은 R-fendiline(도2B)의농도 증가에 대응하여 린-1 널 돌연변이 균주에서 관찰되었다. 데이터는 R-fendiline 블록이 C. elegans의RAS 수준에서 활성화 된 let-60 신호임을 시사한다. 유사하게, 우리는 Muv 표현형이 DMSO 처리된 벌레(도 2C,D)에비해 3, 10 및 30 μM R-fendiline 치료에 반응하여 let-23(sa62) 균주에서 현저히 감소된 것을 관찰하였다. 모든 실험에서 학생 t-test는 통계적 유의를 결정하는 데 사용되었습니다.
도 1: 플로우차트는 let-60(n1046)및 let-23(sa62) 및 lin-1(sy254) 균주를 사용하여 약물 애사를 준비하는 데 관련된 단계를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: R-fendiline 변경 let-60 및 let-23 용량 의존 방식으로 C. elegans에서 기능. (A)차량(DMSO) 또는 30 μM R-펜딜린이 있는 동안 의한 벌레 60(n1046) 웜의 대표적인 이미지. (B)Muv 표현형의 정량화는 DMSO, 3, 10 및 30 μM R-펜딜린 또는 30 μM U0126의 존재에서 처리된 벌레-60(n1046) 벌레의 정량화. (C)차량(DMSO) 또는 30 μM R-펜딜린이 있는 동안 let-23(sa62) 웜의 대표적인 이미지. (D)DMSO, 3, 10 및 30 μM R-펜딜린 또는 30 μM U0126의 존재에서 처리된 let-23(sa62) 벌레에서 Muv 표현형의 정량화. 모든 이미지에서 의사 vudovulva흰색 별표에 의해 흰색 화살표와 일반 외음부로 표시됩니다. 각 치료에 대해 총 60개의 벌레가 이미지화되었습니다. 실험은 3회 반복되었다. (*** P<0.001 및 ** P<0.01은 중요한 것으로 간주되었습니다) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리가 벌레를 사용하여 설명하는 소사는 EGFR 및 RAS 기능의 억제제를 확인하기 위하여 간단하고 저렴합니다. C. elegans는 짧은 수명 주기(20°C에서 3일)와 많은 수의 애벌레를 생성하는 능력으로 인해 실험실에서 쉽게 성장할 수 있기 때문에 약물 발견을 위한 매력적인 모델이다. 더 중요한 것은, EGFR-RAS-ERK MAPK 통로는 EGFR 및 RAS 억제제의 효력을 분석하기 위하여 유전으로 기관시스템을 제공하는 포유동물로 진화적이고 기능적으로 보존됩니다. 또한, 벌레의 투명한 특성으로 인해 조사관은 DIC 및 형광 현미경 검사법에 의해 관심 있는 단백질에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 기타 형광제의 뚜렷한 구조와 국소화를 시각화할 수 있습니다.
우리가 전파하고 이 연구에서 사용된 각종 C. elegans를 유지하는 데 사용한 프로토콜은 이전에20,21로설치되었다. 그러나, NG 플레이트의 준비에서 우리는 세균성 및 곰팡이 오염을 방지하기 위해 연쇄상 구균과 nystatin을 통합했습니다. 이러한 항균제의 첨가는 Muv 표현형의 웜 및 유도의 발달을 방해하지 않았다.
웜 동기화 프로토콜에 의해 L1 애벌레를 얻기위한 몇 가지 장점이 있습니다. 많은 애벌레는 중력 성인을 포함하는 2 개 이상의 플레이트에서 얻을 수 있으며 수집 된 애벌레는 모두 연령을 동기화합니다. 이렇게 하면 웜개발이 인구 내에서 일관되게 유지됩니다. Muv 표현형을 표시하는 몇몇 돌연변이 균주는 Ets 가족 전사 인자 lin-119에품어져 있는 null 돌연변이에서 보인 것과 같이 애벌레의 낮은 수율귀에 있는 가난한 계란 층입니다. 린-1 그레이드 성인의 표백제 치료는 분석에 필요한 애벌레의 수를 크게 증가시킬 것이다.
동기 C. elegans 문화를 준비하는 동안 벌레의 용이를 관찰하는 것이 중요합니다. 두꺼운 달걀 껍질은 유충과 성인의 큐티클이 용해되더라도 표백제 -수산화 나트륨 혼합물의 작용으로부터 배아를 부분적으로 보호합니다. 그러나, 용액에 장기간 노출은 배아의 죽음으로 이끌어 내는 이 보호 케이스를 관통할 것입니다. 따라서 성인 벌레의 70 %가 용해되었을 때 표백제 - 수산화 나트륨 혼합의 작용을 중지하는 것이 중요합니다. 이는 용해 용액을 M9W로 희석하여 달성합니다. 체포 된 L1 애벌레의 유지 보수는 동기 C. elegans 문화 프로토콜에서 고려해야 할 또 다른 단계입니다. M9W에서 체포된 L1 유충의 장기간 배양으로 인해 도어 페로몬의 축적으로 인해 다이어 스테이지로 변신할 수 있습니다. dauer 단계의 형성을 피하기 위해, 그것은 배아를 수집 의 1-2 일 이내에 체포 된 유충을 사용하는 것이 좋습니다.
기저 Muv 표현형은 각각 60%-90%와 90%로 렛-60(n1046) 및 let-23(sa62) 웜의 경우 90%이다. 이것은 let-60 (n1046) 벌레가 표현형 드리프트의 대상이 되고, 따라서, Muv 표현형의 발현의 기저 수준을 보고하는 것이 중요하다는 것을 건의합니다. Let-60(n1046) 및 Let-23(sa62) 웜을 R-펜딜린 및 기타 K-RAS 억제제로 치료하는 것은 Muv 표현형을 발현하는 웜의 비율을 감소시다. 그러나, EGFR-RAS-ERK MAPK 통로의 일부 억제제는 웜당 슈도부바의 수를 단독으로 감소시킬 수 있거나, 발현과슈도불바(17)의수 모두에 영향을 미칠 수 있다고 보고된다. 따라서 약물과 DMSO 처리 된 웜 모두에서 Muv 웜에서 의사 vulvae의 수를 계산하는 것이 중요합니다. let-60(n1046) 및 let-23(sa62) 성인 웜에서 발현된 Muv 표현형은 해부 현미경으로 명확하게 볼 수 있다. 그러나 lin-1(null) 균주는 비교적 건강에 해롭고 발달 장애가 있으며 저속돌출은 성인 웜에서 잘 구별되지 않습니다. 따라서, 외피성 발출 대신, lin-1(null) 웜에서 L4 단계의 복부 측에 채택된 1° 또는 2° 세포 운명을 채택하는 VPC는 고해상도 DIC 현미경을 사용하여 계산될 수 있다.
분석은 저렴하고 쉽고 설정에 시간이 많이 걸리지 않습니다. 처리 시간을 더욱 개선하기 위해, 벌레는 조직 배양 판의 우물 내에서 2 mM 나트륨 아지드의 최종 농도로 마취되고 카메라가 장착된 해부 현미경을 사용하여 심화될 수 있다. 분석의 또 다른 수정은 살아있는 박테리아23대신 대장균 OP50을 죽인 열을 사용하는 것입니다. 박테리아가 감소된 생체활동(24)으로이어지는 특정 소분자를 대사할 수 있음을 보여주었습니다.
이전 연구는 벌레에 있는 외음부의 유도가 특정 환경 단서에 달려 있다는 것을 보여주었습니다. lin-3(n378) 및 let-23(n1045)의 외음부 표현형은 기아에 의해 부분적으로 억제되고14단계를빠져나가는 것으로 나타났다. 더욱이, Moghal 외.에 의한 연구는 M9 완충제에서 자란 외음부 린-3(n378), let-23(sy1) 및 let-60(sy95dn) 돌연변이체가 표준 NG플레이트(24)에서자란 동물에 비해 저속세포 운명을 가정하는 VPC의 수가 더 많았다는 것을 보여주었다. 이 데이터는 액체 환경에서 자란 벌레가 저속 유도에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 그러나, 우리의 연구에서 우리는 액체 환경에서 Muv 표현형의 억제를 관찰하지 않았다.
이 프로토콜에서는 펜딜린의 항 RAS 특성을 평가하기 위해 C. elegans의 사용을 보여줍니다. 이전 연구에서는, 우리는 다산 스프린고미엘리나제 억제제, 데시프라민, 이미프라민 및 아미트립틸린과 같은 삼혈성 항우울제를 포함하는 Muv phenotype18을억제하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 스핑크고미엘린 및 세라마이드 생합성 경로의 억제제는 let-60(n1046) 벌레에 발현된 Muv 표현형을 억제한다. 벌레를 이용한 이들 발견은 포유류 세포주에서 검증되었다.
결론적으로, 우리는 액체 기반 분석에서 EGFR 및 RAS 활성의 억제제를 식별하기 위해 C. elegans의 사용을 보여줍니다. 더욱이, 웜은 항RAS 및 EGFR 치료제의 작용 메커니즘을 식별하고 특성화하는 또 다른 시스템을 제공한다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
Let-60(n1046)을제공한 와티 아루르 박사(MD 앤더슨 암 센터)에게 감사드립니다. 우리는 또한 린 -1 균주에 대한 박사 데이비드 라이너 (휴스턴의 생명 과학 및 기술의 텍사스 A&M 건강 과학 센터 연구소)에 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 시약의 일부를 제공 에 대한 박사 다니엘 Garsin과 그녀의 실험실 (텍사스 대학, 맥거번 의과 대학)에 감사드립니다. 일부 웜 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC에 의해 제공되었다. 이 연구는 JF 핸콕에 RP200047을 부여 텍사스의 암 예방 및 연구소 (CPRIT)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
References
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