Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Identifisering av EGFR- og RAS-hemmere ved bruk av Caenorhabditis elegans

Published: October 5, 2020 doi: 10.3791/61788
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

Summary

Den genetisk gjennomførbare nematoden Caenorhabditis elegans kan brukes som en enkel og billig modell for legemiddeloppdagelse. Beskrevet her er en protokoll for å identifisere anticancer terapeutiske som hemmer nedstrøms signalering av RAS og EGFR proteiner.

Abstract

Endringene i plasmamembranlokaliseringen av den epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR) og dens nedstrøms effektor RAS har vært involvert i flere sykdommer, inkludert kreft. Den frittlevende nematoden C. elegans har en evolusjonær og funksjonelt bevart EGFR-RAS-ERK MAP signal kaskade som er sentral for utviklingen av vulva. Gevinst av funksjonsmutasjoner i RAS homolog LET-60 og EGFR homolog LET-23 induserer genereringen av synlig ikke-fungerende ektopisk pseudovulva langs den ventrale kroppsveggen til disse ormene. Tidligere har multivulval (Muv) fenotypen i disse ormene vist seg å være hemmet av små kjemiske molekyler. Her beskriver vi en protokoll for bruk av ormen i en væskebasert analyse for å identifisere hemmere som avskaffer aktivitetene til EGFR- og RAS-proteiner. Ved hjelp av denne analysen viser vi R-fendiline, en indirekte hemmer av K-RAS, undertrykker Muv-fenotypen uttrykt i let-60(n1046) og let-23(sa62) mutant ormer. Analysen er enkel, billig, er ikke tidkrevende å sette opp, og kan brukes som en innledende plattform for oppdagelsen av anticancer terapeutiske midler.

Introduction

De cellulære veiene som regulerer utviklingshendelser innen organismer er sterkt bevart blant alle metazoer. En slik vei er EGFR-RAS-ERK mitogenaktivert protein kinase (MAPK) som signaliserer kaskade som er en kritisk vei som styrer celleproliferasjon, differensiering, migrasjon og overlevelse1,2. Defekter i denne signalveien kan føre til patologiske eller sykdomstilstander som kreft. Den epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR) har vist seg å være sterkt uttrykt i menneskelige svulster, inkludert 50% av orale squamouscellekarsinomer, og bidrar til utvikling av ondartede svulster3,4,5. Mens mutasjoner i de tre RAS-isoformene H-, K- og N-RAS er store drivere for ondartet transformasjon i flere menneskelige kreftformer. Blant disse tre RAS-isoformene er onkogene mutasjoner i K-RAS mestutbredte 6,7,8. For at EGFR og RAS skal fungere, må de lokaliseres til plasmamembranen (PM). Forebygging av lokalisering av disse molekylene til statsministeren kan fullstendig avvike den biologiske aktiviteten til denne signalveien9,10. Derfor er hemming av lokaliseringen av disse proteinene til statsministeren en terapeutisk strategi for å blokkere nedstrømssignalering og de resulterende negative resultatene. Ved hjelp av en screeninganalyse med høyt innhold ble fendilin, en L-type kalsiumkanalblokker, identifisert som en hemmer av K-RAS-aktivitet11. Nanoclustering av K-RAS til det indre pakningsvedlegget til PM er betydelig redusert i nærvær av fendilin. Videre omfordeles K-RAS fra plasmamembranen til det endoplasmatiske retikulumet (ER), Golgi-apparatet, endosomer og cytosol. Enda viktigere er at spredningen av bukspyttkjertelen, tykktarmen, lungen og endometriekreftcellelinjene som uttrykker onkogen mutant K-RAS, blokkeres ved hemming av nedstrømssignalering ved fendilin11. Disse dataene antyder at fendilin fungerer som en spesifikk K-RAS anticancer terapeutisk som forårsaker feillokalisering av RAS-proteinet til PM.

Nematoden Caenorhabditis elegans har blitt grundig studert i sammenheng med utvikling. Mange av signalveiene som styrer utviklingen i ormen er evolusjonære og funksjonelt bevart. Egfr-mediert aktivering av RAS og den påfølgende aktiveringen av ERK MAPK-signalkaskaden er for eksempel bevart i ormen12. Kaskaden er representert av følgende proteiner: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 er homolog til RAS, mens LET-23 er homolog til EGFR. I ormen regulerer denne banen utviklingen av vulva13. Vulvaen er en epitelåpning på ormens ventrale kroppsvegg som gjør at befruktede egg kan legges. Dannelsen av vulvaen i ormen er avhengig av eksponeringen av vulvalforløpercellene (VPC) til en gradient av aktivering av EGFR-RAS-MAPK-signalkaskaden. Under den normale utviklingen mottar de proksimale VPCene sterke signaler fra gonadale ankerceller for å skille seg ut i 1 ° og 2 ° celle skjebner som gir opphav til en funksjonell vulva12. Mens distale VPCer skiller seg ut i 3 ° celle skjebner som smelter til hypodermal synkronisering og ikke danner vulva på grunn av utarmet signalering. I mangel av signalering skiller alle VPCer seg til 3 ° celle skjebner som resulterer i dannelsen av ingen vulva. Konstituerende signalering fører imidlertid til dannelsen en eller flere ikke-funksjonelle vulva på grunn av induksjon av alle VPCer for å anta 1 ° og 2 ° celle skjebner.

Mutasjoner som forårsaker defekt eller overdreven vulval induksjon er identifisert for mange av genene som koder for proteiner som representerer denne banen. Defekt vulval induksjon resulterer i en vulvaless (Vul) fenotype, mens overdreven vulval induksjon resulterer i en multivulva (Muv) fenotype som er representert ved utvikling av mange ikke-fungerende ektopiske pseudovulvae gjennom den ventrale kroppsveggen. Muv-fenotypen uttrykt av let-60(n1046)-stammen skyldes en gevinst av funksjonsmutasjon i RAS, mens i let-23 (sa62) stammen skyldes det en aktiverende mutasjon i EGFR14,15. Den sterke Muv-fenotypen i disse mutantstammene har vist seg å være forstyrret av farmakologiske intervensjoner som vist ved behandling av la-60 (n1046) ormer med MEK-1-hemmeren U012616,17. Interessant nok har vi vist at R-fendiline og inhibitorer som påvirker sphingomyelin metabolisme undertrykkeR Muv-fenotypen i ormen18. For å demonstrere disse inhibitorene blokkere let-60 signalering på nivået av RAS, lin-1 null stammen har blitt brukt17. Lin-1 er en Ets-lignende hemmende transkripsjonsfaktor som fungerer som undertrykker i utviklingen av vulva19. Sterk tilbakevending av Muv-fenotypen i la-60(n1046) ormer og ingen effekt på lin-1 null ormer tyder på at disse hemningene forekommer på RAS-nivået.

I denne protokollen demonstrerer vi bruken av C. elegans som modell for å identifisere hemmere av RAS- og EGFR-proteiner. Ved hjelp av en væskebasert analyse demonstrerer vi de hemmende effektene av R-fendilin ved å undertrykke Muv-fenotypene i let-60 (n1046) og la-23 (sa62) mutantstammer av C. elegans. Denne analysen validerer bruken av C. elegans som et verktøy i den første fasen av legemiddeloppdagelse for anticancer terapeutiske behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nematode vekst medium (NGM) plate forberedelse

  1. Tilsett 2,5 g peptone og 3 g NaCl til 970 ml deionisert vann som finnes i en 2 L Erlenmeyer-kolbe. Rør innholdet ved hjelp av en magnetisk rørestang. Deretter legger du til 20 g agar i kolben. Autoklaver innholdet i kolben ved 121 °C og et trykk på2 i 30 minutter. Etter sterilisering, plasser kolben på en røreplate og la mediet avkjøles til temperaturen når 50 °C.
  2. For å forberede NGM-platene legger du til følgende reagenser til det avkjølte mediet: 25 ml 1 M kaliumfosfatbuffer (pH = 6,0), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg/ml i 95 % etanol) kolesterol, 1 ml (10 % v/w i etanol) nystatin og 1 ml 25 mg/ml streptomycin.
  3. Under en laminær strømning, hell det avkjølte mediet i 60 mm x 15 mm sterile Petri-retter. La platene størkne i 2 timer. Disse platene kan oppbevares i 1 måned ved 4 °C.

2. Forplantning av C. elegans

  1. Spot 100 μL over natten dyrket E. coli OP50 på midten av hver NGM-plate og la platene tørke i 24 timer i en laminær hette. Deretter kan platene lagres i polystyrenbeholder.
    MERK: E. coli OP50-kulturen dyrkes i Luria-Bertani (LB) medier ved 37 °C media før sådd av platene. Kulturen kan lagres ved 4 °C i 1–2 måneder og brukes til periodisk såing av plater.
  2. Ved hjelp av en steril orm plukke, samle 10-12 gravid voksen ormer fra en tidligere dyrket plate under et dissekerende mikroskop. Overfør disse ormene til en frisk NGM-platefrø med E. coli OP50 og inkuber platen i 24 timer ved 20 °C.
  3. Etter 24 timer, bruk en steril ormplukking, fjern voksne ormer fra platene. Inkuber platene ved 20 °C i ~ 3 dager. Embryoer vil utvikle seg til gravid voksne ormer.

3. Forberedelse av en synkron C. elegans kultur

  1. Samle gravid voksne ormer i et 15 ml konisk rør ved å vaske 2-4 plater med M9W.
    1. Tilberedning av M9W: Løs opp 5 g NaCl, 6 g Na2HPO4og 3 g KH2PO4 i deionisert vann til et endelig volum på 1 L. Autoklaver oppløsningen ved 121 °C ved et trykk på 15 lb/in2 i 30 min. Tilsett 1 ml 1 M MgSO4 til den avkjølte oppløsningen.
  2. Pellet ormene ved å sentrifugere røret på 450 x g i 1 min. Dekanter supernatanten uten å forstyrre ormepellet.
  3. Forbered ormlyseoppløsning ved å kombinere 400 μL 8,25% natriumhypokloritt (husholdningsblekemiddel) og 100 μL 5 N NaOH. Tilsett denne løsningen til ormepellet og sveip røret for å blande innholdet i røret. Forhindre overbleaching av embryoene i røret ved å observere ormenes lysis under et dissekerende mikroskop.
  4. Tilsett 10 ml M9W i det koniske røret for å fortynne lysisblandingen når 70% av de voksne ormene har lysnet.
  5. Sentrifuger røret på 450 x g i 1 min. Bytt ut supernatanten med 10 ml M9W.
  6. Gjenta trinn 3,5 to ganger.
  7. Etter å ha fullført vasketrinnene, tilsett 3-5 ml M9W for å resuspendere eggpellet. Roter røret over natten med en hastighet på 18 o/min på en rørrotator ved romtemperatur (RT).
  8. Etter overnatting inkubasjon, fjern røret fra rotatoren, pellet L1 larver ved å sentrifugere røret på 450 x g i 1 min. Aspirer M9W til 250 μL er igjen i røret.
  9. Rist røret for å gjenopplive larver. Tilsett tre 5 μL dråper som inneholder larver på et Petri-parabolens lokk. Ved hjelp av et dissekeringsmikroskop teller antall ormer i hver dråpe og bestemmer antall ormer i 1 μL.

4. Utarbeidelse av legemiddelanalyser

MERK: Trinnene i denne analysen er vist i figur 1.

  1. Vokse 30 ml E. coli OP50 i et 50 ml konisk rør ved 37 °C over natten i en orbital shaker ved 150 o/min.
  2. Spinn over natten dyrket E. coli OP50 kultur på 4000 x g i 10 min for å pellet cellene. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 3 ml M9W for å konsentrere kulturen.
  3. Før du forbereder arbeidsløsningene for legemiddelanalysen, tilsett 0,1 ml (5 mg / ml i 95% etanol) kolesterol i 100 ml M9W.
  4. Forbered arbeidsløsninger for hvert eksperimentelt stoff ved å fortynne hvert legemiddel pluss kjøretøy (dimetylsulfoksid; DMSO) i 4,8 ml M9W supplert med kolesterol for å oppnå de riktige konsentrasjonene. Løs opp DMSO i 4,8 ml M9W supplert med kolesterol for å forberede kjøretøykontrollen.
  5. Tilsett 200 μL konsentrert E. coli OP50-kultur til hvert rør som inneholder kjøretøykontroll eller narkotika og virvelrør for å sikre at de blandes.
  6. For å utføre eksperimentet, legg til 2 ml av hver fungerende legemiddelløsning eller kjøretøykontroll til hver brønn i en 12-brønns vevskulturplate. Test hver legemiddelkonsentrasjon og kjøretøykontroll i duplikat.
  7. Tilsett ~100 L1 larver per brønn (se synkron C. elegans kulturtrinn) ved hjelp av en steril mikropipette. Begrens volumet av ormer til 10 μL.
  8. Inkuber platene ved 20 °C.
  9. Supplerende brønner med 50 μL 10x konsentrert E. coli OP50 på dag 3 av analysen om nødvendig.

5. Agarose pad forberedelse for mikroskopi

  1. Forbered en 2% m / v løsning av agarose ved å oppløse 0,1 g agarose i 5 ml deionisert vann. Varm innholdet i en mikrobølgeovn for å oppløse agarose. 20 lysbilder kan fremstilles fra 5 ml agaroseoppløsning.
  2. Plasser strimler av lab tape langs to glass lysbilder. Båndet vil fungere som avstandsstykker som begrenser tykkelsen på agarose pads. Deretter plasserer du et tredje rent glasssklie mellom de teipede lysbildene.
  3. For å lage en agarosepute, spot 100 μL smeltet agarose på midten av den rene lysbildet. Plasser en annen ren glasssklie over og på toppen av agarose og trykk forsiktig ned for å danne en pute. Fjern det øverste lysbildet når blokken er størknet.

6. Observasjon av Muv-fenotypen i stammene let-60, let-23 og lin-1

MERK: Bare kandidatmedisiner som undertrykker Muv-fenotypene i la-23 og let-60 stammer vil bli analysert ved hjelp av lin-1-stammen for å avgjøre om hemmingen oppstår på nivået av RAS eller EGFR.

  1. Når riktig stadium av livssyklusen er nådd (3 dager for la-60 og la-23 stammer, 5 dager for lin-1-stammen), fjern platene fra inkubatoren. og samle ormene i 15 ml koniske rør ved hjelp av en pipette.
  2. Sentrifuger rørene ved 450 x g i 1 min. Fjern M9W uten å forstyrre ormepellet og tilsett 5 ml fersk M9W.
  3. Gjenta trinn 6.2 to ganger.
  4. Uten å forstyrre ormepellet, fjern alle gjenværende M9W ved aspirasjon. Deretter tilsetter du 500 μL 2 mM natriumazid eller 2 mM tetramisolhydroklorid. La rørene inkubere ved RT i 15 min. 2 mM natriumazid eller 2 mM tetramisolhydroklorid vil bedøve ormene for avbildning.
    FORSIKTIG: Sørg for å bruke personlig verneutstyr (PVU) ved håndtering av natriumazid. Løsningen må fremstilles under en kjemisk hette.
  5. Tilsett 10 μL av den bedøvede ormfjæringen på midten av en agarosepute. Plasser en #1,5 deksler forsiktig over ormeopphenget. Fest om nødvendig dekslene med litt neglelakk for å forhindre uttørking.
  6. Bruk et DIC-mikroskop til å observere stammene let-60(n1046), let-23(sa62) og lin-1(sy254). Bilde ormene på 10x og 20x forstørrelser.
  7. For let-60(n1046) og let-23(sa62), score voksen ormer basert på tilstedeværelse eller fravær av Muv fenotype. Mens for lin-1-stammen, telle antall VPCer som vedtok 1 ° eller 2 ° celle skjebner på ventral side av L4 larver ved hjelp av en høyoppløselig DIC mikroskop.
  8. Etter å ha scoret mikrografene for hver belastning og narkotikabehandling, utfør Studentens t-testfor å bestemme de statistiske forskjellene mellom behandlingene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viser først at R-fendilin er i stand til å undertrykke Muv-fenotypen i la-60 (n1046) mutantstammen sammenlignet med DMSO-behandlede ormer. Våre data viser at R-fendilin er i stand til å blokkere Muv-fenotypen i let-60(n1046) på en doseavhengig måte (Figur 2A,B). Imidlertid ble det observert ikke-reversering av Muv-fenotypen i lin-1 null mutantstammen som svar på økende konsentrasjoner av R-fendilin (figur 2B). Dataene antyder at R-fendiline blokkerer aktivert let-60 signalering på nivået av RAS i C. elegans. På samme måte observerte vi at Muv-fenotypen ble betydelig redusert i la-23(sa62) stammen som svar på 3, 10 og 30 μM R-fendiline behandling i forhold til DMSO-behandlede ormer (Figur 2C,D). I alle eksperimenter ble Students t-test brukt til å bestemme den statistiske betydningen.

Figure 1
Figur 1: Flytskjema som representerer trinnene som er involvert i å forberede legemiddelanalysene ved hjelp av la-60(n1046), let-23(sa62) og lin-1(sy254) stammer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: R-fendilin endrer let-60 og let-23 funksjon i C. elegans på en doseavhengig måte. (A) Representative bilder av let-60(n1046) ormer i nærvær av kjøretøy (DMSO) eller 30 μM R-fendiline. (B) Kvantifisering av Muv fenotype i let-60(n1046) ormer behandlet i nærvær av DMSO, 3, 10 og 30 μM R-fendiline, eller 30 μM U0126. (C) Representative bilder av la-23(sa62) ormer i nærvær av kjøretøy (DMSO) eller 30 μM R-fendiline. (D) Kvantifisering av Muv fenotype i la-23(sa62) ormer behandlet i nærvær av DMSO, 3, 10 og 30 μM R-fendiline, eller 30 μM U0126. I alle bilder er pseudovulva indikert med hvite piler og normal vulva av hvite stjerner. Totalt 60 ormer ble avbildet for hver behandling. Eksperimentet ble gjentatt 3 ganger. (*** P<0,001 og ** P<0,01 ble ansett som signifikant) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analysene vi beskriver ved hjelp av ormen er enkle og rimelige for å identifisere hemmere av EGFR- og RAS-funksjonen. C. elegans er en attraktiv modell for narkotikaoppdagelse fordi det er lett å vokse i laboratoriet på grunn av den korte livssyklusen (3 dager ved 20 °C) og evnen til å generere et stort antall larver. Enda viktigere er at EGFR-RAS-ERK MAPK-banen er evolusjonært og funksjonelt bevart med pattedyr som gir et genetisk gjennomførbart system for å analysere effekten av EGFR- og RAS-hemmere. Videre gjør ormenes gjennomsiktige natur det mulig for en undersøker å visualisere distinkte strukturer og lokalisering av grønt fluorescerende protein (GFP) eller annen fluorofor smeltet til proteiner av interesse av DIC og fluorescerende mikroskopi.

Protokollene vi brukte til å forplante og vedlikeholde de forskjellige C. eleganene som ble brukt i denne studien, ble tidligere etablert20,21. Men ved utarbeidelse av NG-plater inkorporerte vi streptomycin og nystatin for å forhindre bakteriell og soppforurensning. Tilsetningen av disse antimikrobielle midlene hindret ikke utviklingen av ormene og induksjonen av Muv-fenotypen.

Det er flere fordeler med å skaffe L1 larver av ormsynkroniseringsprotokollen. Mange larver kan fås fra 2 eller flere plater som inneholder gravide voksne og larvene som samles inn, er alle alderssynkroniserte. Dette sikrer at utviklingen av ormene er konsistent i befolkningen. Noen mutante stammer som viser Muv-fenotypen er dårlige egglag som resulterer i lave utbytter av larver sett i nullmutasjonen som ligger i Ets-familiens transkripsjonsfaktor lin-119. Blekemiddelbehandling av lin-1 gravid voksne vil øke antall larver som kreves for analysen betydelig.

Det er viktig å observere ormenes lysis under utarbeidelsen av en synkron C. eleganskultur. Det tykke eggeskallet beskytter delvis embryoene mot virkningen av blekemiddel-natriumhydroksidblandingen, selv når neglebåndet til larver og voksne oppløses. Imidlertid vil langvarig eksponering for lysis-løsningen trenge inn i dette beskyttende huset som fører til embryoenes død. Derfor er det viktig å stoppe virkningen av blekemiddel-natriumhydroksidblandingen når 70% av de voksne ormene har lysnet. Dette oppnås ved å fortynne lysisløsningen med M9W. Vedlikehold av de arresterte L1 larver er et annet skritt å vurdere i den synkrone C. elegans kulturprotokollen. Langvarig inkubasjon av L1 arresterte larver i M9W kan føre til at de forvandles til dauerstadiet på grunn av akkumulering av dauer feromonen. For å unngå dannelsen av dauerstadiet, foreslås det å bruke L1 arresterte larver innen 1-2 dager etter innsamling av embryoene.

Basal Muv-fenotypen er henholdsvis 60%-90% og 90% for let-60(n1046) og let-23(sa62) ormer. Dette antyder at la-60 (n1046) ormer er gjenstand for fenotypisk drift, og derfor er det viktig å rapportere de basale uttrykksnivåene av Muv-fenotypen. Behandling av la-60(n1046) og let-23(sa62) ormer med R-fendilin og andre K-RAS-hemmere reduserer prosentandelen ormer som uttrykker Muv-fenotypen. Det rapporteres imidlertid også at noen hemmere av EGFR-RAS-ERK MAPK-banen kan redusere antall pseudovulvae per orm alene eller kan påvirke både uttrykket og antall pseudovulvae17. Derfor er det viktig å telle antall pseudovulvae i Muv-ormene i både stoff og DMSO-behandlede ormer. Muv-fenotypen uttrykt i let-60(n1046) og let-23(sa62) voksne ormer er tydelig synlige under et dissekerende mikroskop. Lin-1 (null) stammen er imidlertid relativt usunn, utviklingshemmet og vulvalutstikkene er dårlig preget i de voksne ormene. Derfor, i stedet for ektopiske vulval fremspring, i lin-1 (null) ormer, VPCer som vedtar en vedtatt 1 ° eller 2 ° celle skjebner på ventral side i L4-scenen, kan telles ved hjelp av en høyoppløselig DIC mikroskop.

Analysen er billig, enkel og ikke tidkrevende å sette opp. For å forbedre behandlingstiden ytterligere, kan ormene bedøves til en endelig konsentrasjon på 2 mM natriumazid i brønnene til vevskulturplaten og avbildet ved hjelp av et dissekeringsmikroskop utstyrt med et kamera. En annen modifikasjon av analysen ville være å bruke varme drept E. coli OP50 i stedet for levende bakterier23. Det har vist seg at bakterier kan metabolisere visse små molekyler som fører til redusert bioaktiviteter24.

Tidligere studier har vist at induksjonen av vulvaen i ormen er avhengig av visse miljøsignaler. De vulvaløse fenotypene av lin-3 (n378) og let-23(n1045) har vist seg å være delvis undertrykt av sult og utgang av dauer scenen14. Videre viste en studie av Moghal et al., at vulvaless lin-3(n378), let-23(sy1) og let-60(sy95dn) mutanter dyrket i M9 buffer hadde et høyere antall VPCer forutsatt vulvalcelle skjebner sammenlignet med dyr dyrket på standard NG-plater24. Dataene antyder at ormer dyrket i et flytende miljø påvirker vulval induksjon. Men i våre studier observerte vi ikke undertrykkelsen av Muv-fenotypen i et flytende miljø.

I denne protokollen demonstrerer vi bruken av C. elegans for å evaluere anti-RAS-egenskapene til fendilin. I en tidligere studie har vi vist at flere syre sphingomyelinase inhibitors, inkludert trisykliske antidepressiva som desipramin, imipramin og amitriptylin hemmer Muv fenotype18. Videre undertrykker hemmere av sphingomyelin og ceramid biosyntetiske veier Muv-fenotypen uttrykt i la-60 (n1046) ormer. Disse funnene ved hjelp av ormen ble validert i pattedyrcellelinjer.

Til slutt demonstrerer vi bruken av C. elegans for å identifisere hemmere av EGFR- og RAS-aktivitet i en væskebasert analyse. Videre gir ormen et annet system for å identifisere og karakterisere virkningsmekanismene for anti-RAS- og EGFR-terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) for å ha gitt let-60(n1046). Vi takker også Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences &Technology i Houston) for lin-1-stammen. Til slutt takker vi Dr. Danielle Garsin og laboratoriet hennes (University of Texas, McGovern Medical School) for å ha gitt noen av reagensene. Noen ormstammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Denne forskningen ble støttet av Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) grant RP200047 til JF Hancock.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and chemicals
Agarose  Millipore Sigma  A9539-50G
Bacto Peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
Magnesium Sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
R-Fendiline Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide Millipore Sigma  S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite  Bleach
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride Millipore Sigma  L9756
UO126 (MEK inhibitor) Millipore Sigma  19-147
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 50-197-4804
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
MT2124   let-60(n1046) IV. CGC
MT7567 lin-1(sy254) IV. CGC
PS1839 let-23(sa62) II. CGC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
  2. Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
  3. Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
  4. Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
  5. Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
  6. Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
  7. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
  8. Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
  9. Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
  10. Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
  11. van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
  12. Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
  13. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
  14. Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
  15. Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
  16. Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
  17. Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
  18. van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
  19. Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  23. Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
  24. Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).

Tags

Kreftforskning Utgave 164 Caenorhabditis elegans LET-60 LET-23 K-RAS EGFR GFP
Identifisering av EGFR- og RAS-hemmere ved bruk av <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Hoeven, D., Truong, T. N.… More

van der Hoeven, D., Truong, T. N. L., Naji, A., Thapa, S., Hancock, J. F., van der Hoeven, R. Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (164), e61788, doi:10.3791/61788 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter