Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Идентификация ингибиторов EGFR и RAS с использованием Caenorhabditis elegans

Published: October 5, 2020 doi: 10.3791/61788
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

Summary

Генетически поддающегося нематоде Caenorhabditis elegans можно использовать в качестве простой и недорогой модели для открытия лекарств. Здесь описан протокол для идентификации противоопухолевых терапевтических средств, которые ингибируют нисходящую передачу сигналов белков RAS и EGFR.

Abstract

Изменения в локализации плазматической мембраны рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и его последующего эффектора RAS были вовлечены в несколько заболеваний, включая рак. Свободноживущая нематода C. elegans обладает эволюционным и функционально сохраненным сигнальным каскадом EGFR-RAS-ERK MAP, который является центральным для развития вульвы. Усиление функциональных мутаций в гомологе RAS LET-60 и гомологе EGFR LET-23 индуцирует генерацию видимой нефункциональной эктопической псевдовульвы вдоль стенки вентрального тела этих червей. Ранее было показано, что фенотип мультивульвала (Muv) у этих червей ингибируется небольшими химическими молекулами. Здесь мы описываем протокол использования червя в жидкостном анализе для выявления ингибиторов, которые отменяют активность белков EGFR и RAS. Используя этот анализ, мы показываем, что R-фендилин, косвенный ингибитор K-RAS, подавляет фенотип Muv, экспрессируемый у мутантных червей let-60(n1046) и let-23(sa62). Анализ прост, недорог, не занимает много времени для настройки и может быть использован в качестве первоначальной платформы для открытия противоопухолевых терапевтических средств.

Introduction

Клеточные пути, которые регулируют события развития внутри организмов, высоко сохраняются среди всех метазоанов. Одним из таких путей является сигнальный каскад EGFR-RAS-ERK, активированный митогеном протеинкиназой (MAPK), который является критическим путем, который управляет пролиферацией, дифференцировкой, миграцией и выживанием клеток1,2. Дефекты в этом сигнальном пути могут привести к патологическим или болезненным состояниям, таким как рак. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) показал высокую экспрессию в опухолях человека, включая 50% плоскоклеточных карцином полости рта, и способствует развитию злокачественных опухолей3,4,5. Принимая во внимание, что мутации в трех изоформах RAS H-, K- и N-RAS являются основными факторами злокачественной трансформации при множественных раковых заболеваниях человека. Среди этих трех изоформ RAS наиболее распространены онкогенные мутации в K-RAS6,7,8. Чтобы EGFR и RAS функционировали, они должны локализоваться на плазматической мембране (PM). Предотвращение локализации этих молекул к ТЧ может полностью отменить биологическую активность этого сигнального пути9,10. Следовательно, ингибирование локализации этих белков в ТЧ является терапевтической стратегией для блокирования нисходящей передачи сигналов и возникающих в результате неблагоприятных исходов. С помощью скринингового анализа с высоким содержанием фендилин, блокатор кальциевых каналов L-типа, был идентифицирован как ингибитор активности K-RAS11. Нанокластерие K-RAS на внутренний листок ТЧ значительно снижается в присутствии фендилина. Кроме того, K-RAS перераспределяется от плазматической мембраны к эндоплазматическому ретикулуму (ER), аппарату Гольджи, эндосомам и цитозолу. Что еще более важно, пролиферация клеточных линий рака поджелудочной железы, толстой кишки, легких и эндометрия, экспрессировающих онкогенный мутант K-RAS, блокируется ингибированием нисходящей передачи сигналов фендилином11. Эти данные свидетельствуют о том, что фендилин функционирует как специфический противоопухолевый препарат K-RAS, который вызывает неправильную локализацию белка RAS в PM.

Нематода Caenorhabditis elegans была широко изучена в контексте развития. Многие из сигнальных путей, которые управляют развитием червя, являются эволюционными и функционально сохраненными. Например, опосредоваемая EGFR активация RAS и последующая активация сигнального каскада ERK MAPK сохраняется в черве12. Каскад представлен следующими белками: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 гомологична RAS, в то время как LET-23 гомологична EGFR. У червя этот путь регулирует развитие вульвы13. Вульва представляет собой эпителиальное отверстие на стенке вентрального тела червя, которое позволяет откладывать оплодотворенные яйца. Формирование вульвы у червя зависит от воздействия на клетки-предшественники вульвы (VPC) градиента активации сигнального каскада EGFR-RAS-MAPK. Во время нормального развития проксимальные VPC получают сильные сигналы от клеток гонадного якоря для дифференцировки в 1° и 2° клеточных судеб, которые дают начало функциональной вульве12. В то время как дистальные VPC дифференцируются в 3° клеточные судьбы, которые сливаются с подкожным синцитием и не образуют вульву из-за истощения сигналов. При отсутствии сигнализации все VPC дифференцируются в 3° клеточные судьбы, что приводит к образованию вульвы. Однако конститутивная сигнализация приводит к образованию одной или нескольких нефункциональных вульв из-за индукции всех VPC предполагать судьбы клеток 1° и 2°.

Мутации, которые вызывают дефектную или чрезмерную индукцию вульвы, были идентифицированы для многих генов, которые кодируют белки, представляющие этот путь. Дефектная индукция вульвы приводит к фенотипу без вульвы (Vul), в то время как чрезмерная индукция вульвы приводит к фенотипу мультивульвы (Muv), который представлен развитием многочисленных нефункциональных эктопических псевдовульв по всей стенке вентрального тела. Фенотип Muv, экспрессируемый штаммом let-60(n1046), обусловлен усилением мутации функции в RAS, в то время как у штамма let-23(sa62) он обусловлен активирующей мутацией в EGFR14,15. Было показано, что сильный фенотип Muv в этих мутантных штаммах возмущается фармакологическими вмешательствами, как продемонстрировано лечением червей let-60(n1046) ингибитором MEK-1 U012616,17. Интересно, что мы показали, что R-фендилин и ингибиторы, влияющие на метаболизм сфингомиелина, подавляют фенотип Muv у червя18. Для демонстрации этих ингибиторов блока передачи сигналов let-60 на уровне RAS был использован нулевой штамм lin-1 17. Lin-1 является Ets-подобным ингибирующим фактором транскрипции, который функционирует как репрессор в развитии вульвы19. Сильная реверсия фенотипа Muv у червей let-60(n1046) и отсутствие влияния на нулевых червей lin-1 позволяют предположить, что эти ингибирования происходят на уровне RAS.

В этом протоколе мы демонстрируем использование C. elegans в качестве модели для идентификации ингибиторов белков RAS и EGFR. Используя жидкостный анализ, мы демонстрируем ингибирующие эффекты R-фендилина путем подавления фенотипов Muv в мутантных штаммах let-60(n1046) и let-23(sa62) C. elegans. Этот анализ подтверждает использование C. elegans в качестве инструмента на начальном этапе открытия лекарств для противоопухолевой терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка пластины среды роста нематоды (NGM)

  1. Добавьте 2,5 г пептона и 3 г NaCl к 970 мл деионизированной воды, содержащейся в 2-м лиле колбы Эрленмейера. Перемешайте содержимое с помощью магнитного перемешивания. После этого добавьте в колбу 20 г агарова. Автоклав содержимого колбы при 121 °C и давлении 15 фунтов/в2 в течение 30 мин. После стерилизации поместите колбу на перемешиваемую пластину и дайте среде остыть до тех пор, пока температура не достигнет 50 °C.
  2. Для приготовления пластин NGM добавляют в охлаждаемую среду следующие реагенты: 25 мл 1 М калийфосфатного буфера (рН = 6,0), 1 мл 1 М МгСО4,1 мл 1 М CaCl2,1 мл (5 мг/мл в 95% этаноле) холестерина, 1 мл (10% v/w в этаноле) нистатина и 1 мл 25 мг/мл стрептомицина.
  3. Под ламинарной струей перелейте охлажденный носитель в стерильные чашки Петри 60 мм х 15 мм. Дайте пластинам затвердеть в течение 2 ч. Эти пластины можно хранить в течение 1 месяца при 4 °C.

2. Размножение C. elegans

  1. Нанесите 100 мкл выращенной на ночь E. coli OP50 на центр каждой пластины NGM и дайте пластинам высохнуть в течение 24 ч в ламинарной вытяжке. Впоследствии пластины можно хранить в полистирольной таре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культуру E. coli OP50 выращивают в среде Luria-Bertani (LB) при 37 °C до посева пластин. Культуру можно хранить при 4 °C в течение 1–2 месяцев и использовать для периодического посева пластин.
  2. Используя стерильную червячную кирку, соберите 10-12 взрослых червей с ранее выращенной пластины под рассекающим микроскопом. Переложите этих червей на свежую пластину NGM, засеянное E. coli OP50, и инкубируют пластину в течение 24 ч при 20 °C.
  3. Через 24 ч с помощью стерильной червячной кирки удаляют взрослых червей с пластин. Инкубировать пластины при 20 °C в течение ~ 3 дней. Эмбрионы будут развиваться в гравидных взрослых червей.

3. Подготовка синхронной культуры C. elegans

  1. Соберите взрослых червей в коническую трубку 15 мл, промыв 2–4 пластины M9W.
    1. Приготовление M9W: Растворить 5 г NaCl, 6 г Na2HPO4и 3 г KH2PO4 в деионизированной воде до конечного объема 1 л. Автоклав раствора при 121 °C при давлении 15 фунтов/в2 в течение 30 мин. Добавить 1 мл 1 М МгСО4 в охлажденный раствор.
  2. Гранулируют червей центрифугированием в трубке при 450 х г в течение 1 мин. Декантирование супернатанта, не нарушая гранулу червя.
  3. Готовят раствор для червячного лизиса, сочетая 400 мкл 8,25% гипохлорита натрия (бытовой отбеливатель) и 100 мкл 5 N NaOH. Добавьте этот раствор в червячную гранулу и проведите по трубке, чтобы перемешать содержимое трубки. Предотвратите перебеливание эмбрионов в трубке, наблюдая лизис червей под рассекающим микроскопом.
  4. Добавьте 10 мл M9W в коническую трубку, чтобы разбавить смесь лизиса, когда 70% взрослых червей лизировались.
  5. Центрифугировать трубку при 450 х г в течение 1 мин. Замените супернатант на 10 мл M9W.
  6. Повторите шаг 3.5 два раза.
  7. После завершения этапов промывки добавьте 3–5 мл M9W для повторного суспендирования гранулы яйца. Вращайте трубку в течение ночи со скоростью 18 об/мин на трубном ротаторе при комнатной температуре (RT).
  8. После ночной инкубации извлеките трубку из ротатора, гранулируют личинки L1 путем центрифугирования трубки при 450 х г в течение 1 мин. Аспирировать M9W до 250 мкл остается в трубке.
  9. Встряхните трубку, чтобы повторно суспендировать личинок. Добавьте три капли по 5 мкл, содержащие личинок, на крышку чашки Петри. С помощью рассекающего микроскопа подсчитайте количество червей в каждой капле и определите количество червей в 1 мкл.

4. Подготовка анализов на наркотики

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги в этом анализе показаны на рисунке 1.

  1. Вырастите 30 мл E. coli OP50 в конической трубке 50 мл при 37 °C в течение ночи в орбитальном шейкере при 150 об/мин.
  2. Отжим на ночь выращенной культуры E. coli OP50 при 4000 х г в течение 10 мин, чтобы гранулировать клетки. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в 3 мл M9W, чтобы сконцентрировать культуру.
  3. Перед приготовлением рабочих растворов для анализа препарата добавляют 0,1 мл (5 мг/мл в 95% этаноле) холестерина в 100 мл M9W.
  4. Готовят рабочие растворы каждого экспериментального препарата путем разбавления каждого лекарственного средства плюс носитель (диметилсульфоксид; DMSO) в 4,8 мл M9W, дополненных холестерином, для получения соответствующих концентраций. Растворите ДМСО в 4,8 мл M9W, дополненного холестерином, для подготовки контроля транспортного средства.
  5. Добавьте 200 мкл концентрированной культуры E. coli OP50 в каждую трубку, содержащую контроль транспортного средства или лекарства и вихревые трубки, чтобы убедиться, что они смешаны.
  6. Для выполнения эксперимента добавляют 2 мл каждого рабочего раствора лекарственного средства или контроля транспортного средства в каждую скважину в 12-скважинной тканевой культуре. Проверьте концентрацию каждого препарата и контроль транспортного средства в двух экземплярах.
  7. Добавьте ~100 личинок L1 на лунку (см. синхронные этапы культивирования C. elegans) с помощью стерильной микропипетки. Ограничьте объем червей до 10 мкл.
  8. Инкубировать пластины при 20 °C.
  9. При необходимости дополнив колодцы 50 мкл 10x концентрированной E. coli OP50 на 3-й день анализа.

5. Подготовка агарозной прокладки к микроскопии

  1. Готовят 2% мас./об.раствор агарозы, растворяя 0,1 г агарозы в 5 мл деионизированной воды. Нагрейте содержимое в микроволновой печи, чтобы растворить агарозу. Из 5 мл раствора агарозы можно приготовить 20 слайдов.
  2. Поместите полоски лабораторной ленты вдоль двух стеклянных слайдов. Лента будет действовать как прокладки, ограничивающие толщину агарозных подушечек. После этого поместите третий чистый стеклянный слайд между заклеенными слайдами.
  3. Чтобы сделать агарозную прокладку, нанесите 100 мкл расплавленной агарозы на центр чистого слайда. Поместите еще один чистый стеклянный слайд поперек и поверх агарозы и осторожно надавите вниз, чтобы сформировать подушечку. Снимите верхний слайд, когда подушечка затвердеет.

6. Наблюдение фенотипа Muv в штаммах let-60, let-23 и lin-1

ПРИМЕЧАНИЕ: Только препараты-кандидаты, которые подавляют фенотипы Muv в штаммах let-23 и let-60, будут анализированы с использованием штамма lin-1, чтобы определить, происходит ли ингибирование на уровне RAS или EGFR.

  1. Когда будет достигнута соответствующая стадия жизненного цикла (3 дня для штаммов let-60 и let-23, 5 дней для штамма lin-1), удалите пластины из инкубатора. и соберите червей в конические трубки по 15 мл с помощью пипетки.
  2. Центрифугировать пробирки по 450 х г в течение 1 мин. Удалите M9W, не нарушая гранулы червя, и добавьте 5 мл свежего M9W.
  3. Повторите шаг 6.2 два раза.
  4. Не нарушая червячную гранулу, удалите все оставшиеся M9W путем аспирации. После этого добавляют 500 мкл 2 мМ азида натрия или 2 мМ тетрамизола гидрохлорида. Дайте трубкам инкубироваться на RT в течение 15 мин. 2 мМ азида натрия или 2 мМ тетрамизола гидрохлорида обезболивают червей для визуализации.
    ВНИМАНИЕ: Обязательно носите средства индивидуальной защиты (СИЗ) при обращении с азидом натрия. Раствор необходимо готовить под химическим капотом.
  5. Добавьте 10 мкл анестезированной суспензии червя в центр агарозной прокладки. Аккуратно положите на суспензию червя #1,5 крышки. При необходимости закрепите обтекание лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание.
  6. Используйте микроскоп DIC для наблюдения за штаммами let-60(n1046), let-23(sa62) и lin-1(sy254). Изобразим червей в 10-кратном и 20-кратном увеличении.
  7. Для let-60(n1046) и let-23(sa62) оценивают взрослых червей на основе наличия или отсутствия фенотипа Muv. В то время как для штамма lin-1 подсчитайте количество VPC, которые приняли 1° или 2° клеточные судьбы на вентральной стороне личинок L4, используя микроскоп с высоким разрешением DIC.
  8. После оценки микрофотографий для каждого штамма и лечения препаратом, выполните тестСтьюденса, чтобы определить статистические различия между методами лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Впервые мы демонстрируем, что R-фендилин способен подавлять фенотип Muv в мутантном штамме let-60(n1046) по сравнению с червями, обработанными DMSO. Наши данные показывают, что R-фендилин способен блокировать фенотип Muv в let-60(n1046) дозозависимым образом(рисунок 2A,B). Однако невратность фенотипа Мув наблюдалась у нулевого мутантного штамма lin-1 в ответ на повышение концентрации R-фендилина(Рисунок 2B). Данные свидетельствуют о том, что R-фендилиновые блоки активируют передачу сигналов let-60 на уровне RAS у C. elegans. Аналогичным образом, мы наблюдали, что фенотип Muv был значительно снижен в штамме let-23(sa62) в ответ на лечение 3, 10 и 30 мкМ R-фендилином по сравнению с червями, обработанными DMSO(рисунок 2C, D). Во всех экспериментах студентов t-тестиспользовался для определения статистической значимости.

Figure 1
Рисунок 1: Блок-схема, представляющая этапы, участвующие в приготовлении анализов лекарственного средства с использованием штаммов let-60(n1046), let-23(sa62) и lin-1(sy254). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: R-фендилин изменяет функцию let-60 и let-23 в C. elegans дозозависимым образом. (A)Репрезентативные изображения червей let-60(n1046) в присутствии транспортного средства (DMSO) или 30 мкМ R-фендилина. (B)Количественная оценка фенотипа Muv у червей let-60(n1046), обработанных в присутствии DMSO, 3, 10 и 30 мкМ R-фендилина или 30 мкМ U0126. (C)Репрезентативные изображения червей let-23(sa62) в присутствии транспортного средства (DMSO) или 30 мкМ R-фендилина. (D)Количественная оценка фенотипа Muv у червей let-23(sa62), обработанных в присутствии DMSO, 3, 10 и 30 мкМ R-фендилина или 30 мкМ U0126. На всех изображениях псевдовульва обозначена белыми стрелками, а нормальная вульва — белыми звездочками. В общей сложности 60 червей были изображены для каждого лечения. Эксперимент повторяли 3 раза. (*** P<0,001 и ** P<0,01 были признаны значительными) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализы, которые мы описываем с использованием червя, просты и недороги для выявления ингибиторов функции EGFR и RAS. C. elegans является привлекательной моделью для открытия лекарств, потому что его легко выращивать в лаборатории из-за короткого жизненного цикла (3 дня при 20 ° C) и способности генерировать большое количество личинок. Что еще более важно, путь EGFR-RAS-ERK MAPK эволюционно и функционально сохраняется с млекопитающими, обеспечивающими генетически поддающегося система для анализа эффектов ингибиторов EGFR и RAS. Кроме того, прозрачная природа червей позволяет исследователю визуализировать различные структуры и локализацию зеленого флуоресцентного белка (GFP) или другого флуорофора, слитого с белками, представляющими интерес, с помощью ДВС-системы и флуоресцентной микроскопии.

Протоколы, которые мы использовали для распространения и поддержания различных C. elegans, используемых в этом исследовании, были ранее установлены20,21. Однако при приготовлении пластин ПГ мы включили стрептомицин и нистатин для предотвращения бактериального и грибкового загрязнения. Добавление этих противомикробных средств не препятствовало развитию глистов и индукции фенотипа Muv.

Существует несколько преимуществ получения личинок L1 по протоколу синхронизации червей. Многие личинки могут быть получены из 2 или более пластин, содержащих гравидных взрослых особей, и собранные личинки синхронизированы по возрасту. Это гарантирует, что развитие червей будет последовательным внутри популяции. Некоторые мутантные штаммы, демонстрирующие фенотип Muv, являются плохими яйцекладуками, что приводит к низкой урожайности личинок, как видно из нулевой мутации, затаившейся в факторе транскрипции семейства Ets lin-119. Отбеливая обработка взрослых особей лин-1 значительно увеличит количество личинок, необходимых для анализа.

Очень важно наблюдать лизис червей во время приготовления синхронной культуры C. elegans. Толстая яичная скорлупа частично защищает эмбрионы от действия смеси отбеливателя и гидроксида натрия даже при растворении кутикулы личинок и взрослых особей. Однако длительное воздействие раствора лизиса проникнет в этот защитный корпус, что приведет к гибели эмбрионов. Следовательно, важно прекратить действие смеси отбеливателя и гидроксида натрия, когда 70% взрослых червей лизировали. Это достигается путем разбавления раствора лизиса M9W. Поддержание арестованных личинок L1 является еще одним шагом, который следует учитывать в синхронном протоколе культуры C. elegans. Длительная инкубация арестованных личинок L1 в M9W может привести к их трансформации в стадию дауэра из-за накопления феромона дауэра. Чтобы избежать образования стадии дауэра, рекомендуется использовать арестованных личинок L1 в течение 1–2 дней после сбора эмбрионов.

Базальный фенотип Muv составляет 60%-90% и 90% для червей let-60(n1046) и let-23(sa62) соответственно. Это говорит о том, что черви let-60(n1046) подвержены фенотипической дрейфе и, следовательно, важно сообщать о базальных уровнях экспрессии фенотипа Muv. Лечение глистов лет-60(n1046) и лет-23(sa62) R-фендилином и другими ингибиторами K-RAS снижает процент червей, экспрессирующих фенотип Мув. Однако также сообщается, что некоторые ингибиторы пути EGFR-RAS-ERK MAPK могут уменьшать количество псевдовульв на одного червя в одиночку или могут влиять как на экспрессию, так и на количество псевдовульв17. Следовательно, важно подсчитать количество псевдовульв у червей Muv как у глистов, обработанных лекарственными средствами, так и у червей, обработанных ДМСО. Фенотип Muv, выраженный у взрослых червей let-60(n1046) и let-23(sa62), хорошо виден под рассекающим микроскопом. Тем не менее, штамм lin-1 (нулевой) относительно нездоров, с нарушениями развития, а протрузии вульвы плохо различаются у взрослых червей. Поэтому вместо эктопических протрузий вульвы у червей lin-1 (нулевых) VPC, которые принимают 1° или 2° клеточные судьбы на вентральной стороне на стадии L4, могут быть подсчитаны с помощью микроскопа СВС-чвс высокого разрешения.

Анализ недорогой, простой и не отнимает много времени для настройки. Для дальнейшего улучшения времени обработки червей можно обезболить до конечной концентрации 2 мМ азида натрия в колодцах пластины культуры тканей и визуализировать с помощью рассекающего микроскопа, оснащенного камерой. Другой модификацией анализа было бы использование убитой теплом E. coli OP50 вместо живых бактерий23. Было показано, что бактерии могут метаболизировать определенные малые молекулы, что приводит к снижению биоактивности24.

Предыдущие исследования показали, что индукция вульвы у червя зависит от определенных сигналов окружающей среды. Оказалось, что фенотипы lin-3(n378) и let-23(n1045) частично подавляются голоданием и выходом из стадии дауэра14. Кроме того, исследование Moghal et al., показало, что мутанты безвульвы lin-3(n378), let-23(sy1) и let-60(sy95dn), выращенные в буфере M9, имели большее количество VPC, предполагающих судьбу вульвальных клеток, по сравнению с животными, выращенными на стандартных пластинах NG24. Данные свидетельствуют о том, что черви, выращенные в жидкой среде, влияют на индукцию вульвы. Однако в наших исследованиях мы не наблюдали подавления фенотипа Muv в жидкой среде.

В этом протоколе мы демонстрируем использование C. elegans для оценки анти-RAS свойств фендилина. В предыдущем исследовании мы показали, что множественные ингибиторы кислотной сфингомиелиназы, включая трициклические антидепрессанты, такие как дезипрамин, имипрамин и амитриптилин, ингибируют фенотип Muv18. Кроме того, ингибиторы биосинтетических путей сфингомиелина и керамида подавляют фенотип Muv, экспрессируемый у червей let-60(n1046). Эти результаты с использованием червя были подтверждены в клеточных линиях млекопитающих.

В заключение демонстрируется применение C. elegans для идентификации ингибиторов активности EGFR и RAS в жидкостном анализе. Кроме того, червь обеспечивает еще одну систему для выявления и характеристики механизмов действия анти-RAS и EGFR терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Свати Арура (MD Anderson Cancer Center) за предоставление let-60(n1046). Мы также благодарим доктора Дэвида Райнера (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology в Хьюстоне) за штамм lin-1. Наконец, мы благодарим доктора Даниэль Гарсин и ее лабораторию (Техасский университет, Медицинская школа Макговерна) за предоставление некоторых реагентов. Некоторые штаммы червей были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Это исследование было поддержано грантом Техасского института профилактики и исследований рака (CPRIT) RP200047 для JF Hancock.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and chemicals
Agarose  Millipore Sigma  A9539-50G
Bacto Peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
Magnesium Sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
R-Fendiline Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide Millipore Sigma  S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite  Bleach
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride Millipore Sigma  L9756
UO126 (MEK inhibitor) Millipore Sigma  19-147
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 50-197-4804
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
MT2124   let-60(n1046) IV. CGC
MT7567 lin-1(sy254) IV. CGC
PS1839 let-23(sa62) II. CGC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
  2. Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
  3. Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
  4. Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
  5. Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
  6. Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
  7. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
  8. Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
  9. Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
  10. Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
  11. van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
  12. Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
  13. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
  14. Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
  15. Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
  16. Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
  17. Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
  18. van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
  19. Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  23. Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
  24. Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).

Tags

Исследование рака выпуск 164 Caenorhabditis elegans LET-60 LET-23 K-RAS EGFR GFP
Идентификация ингибиторов EGFR и RAS с использованием <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Hoeven, D., Truong, T. N.… More

van der Hoeven, D., Truong, T. N. L., Naji, A., Thapa, S., Hancock, J. F., van der Hoeven, R. Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (164), e61788, doi:10.3791/61788 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter