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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Identificación de inhibidores de EGFR y RAS mediante Caenorhabditis elegans

Published: October 5, 2020 doi: 10.3791/61788
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

Summary

El nematodo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans se puede utilizar como un modelo simple y económico para el descubrimiento de fármacos. Aquí se describe un protocolo para identificar terapias contra el cáncer que inhiben la señalización aguas abajo de las proteínas RAS y EGFR.

Abstract

Los cambios en la localización de la membrana plasmática del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y su efector aguas abajo RAS se han implicado en varias enfermedades, incluido el cáncer. El nematodo de vida libre C. elegans posee una cascada de señales EGFR-RAS-ERK MAP evolutiva y funcionalmente conservada que es central para el desarrollo de la vulva. Las mutaciones de ganancia de función en el homólogo RAS LET-60 y el homólogo EGFR LET-23 inducen la generación de pseudovulva ectópica no funcional visible a lo largo de la pared del cuerpo ventral de estos gusanos. Anteriormente, se ha demostrado que el fenotipo multivulval (Muv) en estos gusanos es inhibido por pequeñas moléculas químicas. Aquí describimos un protocolo para usar el gusano en un ensayo a base de líquido para identificar inhibidores que abolen las actividades de las proteínas EGFR y RAS. Usando este ensayo, mostramos que la R-fendilina, un inhibidor indirecto de K-RAS, suprime el fenotipo Muv expresado en los gusanos mutantes let-60(n1046) y let-23(sa62). El ensayo es simple, económico, no requiere mucho tiempo de configuración y se puede utilizar como una plataforma inicial para el descubrimiento de terapias contra el cáncer.

Introduction

Las vías celulares que regulan los eventos de desarrollo dentro de los organismos están altamente conservadas entre todos los metazoos. Una de estas vías es la cascada de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno EGFR-RAS-ERK (MAPK), que es una vía crítica que gobierna la proliferación, diferenciación, migración y supervivencia celular1,2. Los defectos en esta vía de señalización pueden conducir a estados patológicos o de enfermedad como el cáncer. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ha demostrado estar altamente expresado en tumores humanos, incluyendo el 50% de los carcinomas orales de células escamosas, y contribuye al desarrollo de tumores malignos3,4,5. Mientras que las mutaciones en las tres isoformas RAS H-, K- y N-RAS son los principales impulsores de la transformación maligna en múltiples cánceres humanos. Entre estas tres isoformas RAS, las mutaciones oncogénicas en K-RAS son las más prevalentes6,7,8. Para que EGFR y RAS funcionen, deben localizarse en la membrana plasmática (PM). Prevenir la localización de estas moléculas al PM puede abrogar completamente la actividad biológica de esta vía de señalización9,10. Por lo tanto, la inhibición de la localización de estas proteínas en el PM es una estrategia terapéutica para bloquear la señalización aguas abajo y los resultados adversos resultantes. Mediante un ensayo de cribado de alto contenido, se identificó la fendilina, un bloqueador de los canales de calcio de tipo L, como un inhibidor de la actividad de K-RAS11. La nanoagrupanción de K-RAS a la valva interna del PM se reduce significativamente en presencia de fendilina. Además, K-RAS se redistribuye desde la membrana plasmática al retículo endoplásmico (RE), el aparato de Golgi, los endosomas y el citosol. Más importante aún, la proliferación de líneas celulares de cáncer de páncreas, colon, pulmón y endometrio que expresan K-RAS mutante oncogénico está bloqueada por la inhibición de la señalización aguas abajo por fendilina11. Estos datos sugieren que la fendilina funciona como una terapia específica contra el cáncer K-RAS que causa la mala localización de la proteína RAS al PM.

El nematodo Caenorhabditis elegans ha sido ampliamente estudiado en el contexto del desarrollo. Muchas de las vías de señal que gobiernan el desarrollo en el gusano son evolutivas y funcionalmente conservadas. Por ejemplo, la activación mediada por EGFR de RAS y la posterior activación de la cascada de señal ERK MAPK se conserva en el gusano12. La cascada está representada por las siguientes proteínas: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 es homólogo a RAS, mientras que LET-23 es homólogo a EGFR. En el gusano, esta vía regula el desarrollo de la vulva13. La vulva es una abertura epitelial en la pared ventral del cuerpo del gusano que permite poner huevos fertilizados. La formación de la vulva en el gusano depende de la exposición de las células precursoras vulvales (VPC) a un gradiente de activación de la cascada de señales EGFR-RAS-MAPK. Durante el desarrollo normal, las VPC proximales reciben fuertes señales de las células de anclaje gonadal para diferenciarse en destinos celulares de 1° y 2° que dan lugar a una vulva funcional12. Mientras que las VPC distales se diferencian en destinos celulares de 3° que se fusionan con el sincitio hipodérmico y no forman vulva debido al agotamiento de la señalización. En ausencia de señalización, todas las VPC se diferencian en destinos celulares de 3°, lo que resulta en la formación de ninguna vulva. Sin embargo, la señalización constitutiva conduce a la formación de una o más vulva no funcionales debido a la inducción de todas las VPC para asumir destinos celulares de 1° y 2°.

Se han identificado mutaciones que causan una inducción vulvística defectuosa o excesiva para muchos de los genes que codifican para las proteínas que representan esta vía. La inducción vulvar defectuosa da como resultado un fenotipo sin vulva (Vul), mientras que la inducción vulvar excesiva da como resultado un fenotipo multivulva (Muv) que está representado por el desarrollo de numerosas pseudovulvas ectópicas no funcionales en toda la pared del cuerpo ventral. El fenotipo Muv expresado por la cepa let-60(n1046) se debe a una mutación de ganancia de función en RAS, mientras que en la cepa let-23(sa62) se debe a una mutación activadora en EGFR14,15. Se ha demostrado que el fuerte fenotipo Muv en estas cepas mutantes se ve perturbado por las intervenciones farmacológicas, como lo demuestra el tratamiento de los gusanos let-60(n1046) con el inhibidor de MEK-1 U012616,17. Curiosamente, hemos demostrado que la R-fendilina y los inhibidores que afectan al metabolismo de la esfingomielina suprimen el fenotipo Muv en el gusano18. Para demostrar que estos inhibidores bloquean la señalización let-60 a nivel de RAS, se ha utilizado la cepa nula lin-1 17. Lin-1 es un factor de transcripción inhibidor similar a Ets que funciona como represor en el desarrollo de la vulva19. La fuerte reversión del fenotipo Muv en gusanos let-60(n1046) y ningún efecto sobre los gusanos nulos lin-1 sugieren que estas inhibiciones ocurren a nivel de RAS.

En este protocolo, demostramos el uso de C. elegans como modelo para identificar inhibidores de las proteínas RAS y EGFR. Utilizando un ensayo a base de líquido, demostramos los efectos inhibitorios de la R-fendilina mediante la supresión de los fenotipos Muv en las cepas mutantes let-60(n1046) y let-23(sa62) de C. elegans. Este ensayo valida el uso de C. elegans como herramienta en la fase inicial de descubrimiento de fármacos para la terapéutica contra el cáncer.

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Protocol

1. Preparación de la placa del medio de crecimiento de nematodos (NGM)

  1. Añadir 2,5 g de peptona y 3 g de NaCl a 970 ml de agua desionizada contenida en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética. A partir de entonces, agregue 20 g de agar al matraz. Autoclave el contenido del matraz a 121 °C y una presión de 15 lb/in2 durante 30 min. Después de la esterilización, coloque el matraz en una placa de agitación y deje que el medio se enfríe hasta que la temperatura alcance los 50 ° C.
  2. Para preparar las placas NGM agregue los siguientes reactivos al medio enfriado: 25 mL de tampón de fosfato de potasio 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de (5 mg / ml en etanol al 95%) colesterol, 1 ml de (10% v / w en etanol) nistatina y 1 mL de 25 mg / ml de estreptomicina.
  3. Bajo un flujo laminar, vierta el medio enfriado en placas de Petri estériles de 60 mm x 15 mm. Deje que las placas se solidifiquen durante 2 h. Estas placas se pueden mantener durante 1 mes a 4 °C.

2. Propagación de C. elegans

  1. Coloca 100 μL de E. coli OP50 cultivada durante la noche en el centro de cada placa NGM y deja que las placas se sequen durante 24 h en una campana laminar. Posteriormente, las placas se pueden almacenar en un recipiente de poliestireno.
    NOTA: El cultivo de E. coli OP50 se cultiva en medios Luria-Bertani (LB) a 37 °C media antes de la siembra de las placas. El cultivo puede almacenarse a 4 °C durante 1-2 meses y utilizarse para la siembra periódica de placas.
  2. Usando una selección de gusanos estéril, reúna de 10 a 12 gusanos adultos grávidos de una placa previamente cultivada bajo un microscopio de disección. Transfiera estos gusanos a una placa NGM fresca secuesta con E. coli OP50 e incube la placa durante 24 h a 20 ° C.
  3. Después de 24 h, usando un gusano estéril, elimine los gusanos adultos de las placas. Incubar las placas a 20 °C durante ~ 3 días. Los embriones se convertirán en gusanos adultos grávidos.

3. Preparación de un cultivo síncrono de C. elegans

  1. Recolecte gusanos adultos grávidos en un tubo cónico de 15 ml lavando 2-4 placas con M9W.
    1. Preparación de M9W: Disolver 5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4y 3 g de KH2PO4 en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L. Autoclave la solución a 121 °C a una presión de 15 lb/in2 durante 30 min. Añadir 1 ml de 1 M mgSO4 a la solución refrigerada.
  2. Peletizar los gusanos centrifugando el tubo a 450 x g durante 1 min. Decantar el sobrenadante sin molestar la bolita del gusano.
  3. Preparar solución de lisis de lombrices combinando 400 μL de hipoclorito de sodio al 8,25% (lejía doméstica) y 100 μL de 5 N NaOH. Agregue esta solución a la bolita de gusano y mueva el tubo para mezclar el contenido del tubo. Evite el blanqueamiento excesivo de los embriones en el tubo observando la lisis de los gusanos bajo un microscopio de disección.
  4. Agregue 10 ml de M9W al tubo cónico para diluir la mezcla de lisis cuando el 70% de los gusanos adultos se hayan lisado.
  5. Centrifugar el tubo a 450 x g durante 1 min. Reemplace el sobrenadante con 10 ml de M9W.
  6. Repita el paso 3.5 dos veces.
  7. Después de completar los pasos de lavado, agregue 3-5 ml de M9W para volver a usar el pellet de huevo. Gire el tubo durante la noche a una velocidad de 18 rpm en un rotador de tubo a temperatura ambiente (RT).
  8. Después de la incubación durante la noche, retire el tubo del rotador, pelete las larvas de L1 centrifugando el tubo a 450 x g durante 1 min. Aspirar el M9W hasta que queden 250 μL en el tubo.
  9. Agite el tubo para volver a sususpend las larvas. Agregue tres gotas de 5 μL que contengan las larvas en la tapa de una placa de Petri. Usando un microscopio de disección, cuente el número de gusanos en cada gota y determine el número de gusanos en 1 μL.

4. Preparación de ensayos farmacológicos

NOTA: Los pasos de este ensayo se muestran en la Figura 1.

  1. Cultive 30 ml de E. coli OP50 en un tubo cónico de 50 ml a 37 °C durante la noche en un agitador orbital a 150 rpm.
  2. Girar durante la noche el cultivo de E. coli OP50 cultivada a 4.000 x g durante 10 min para gletizar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en 3 mL de M9W para concentrar el cultivo.
  3. Antes de preparar las soluciones de trabajo para el ensayo del fármaco, agregue 0.1 ml de colesterol (5 mg / ml en etanol al 95%) en 100 ml de M9W.
  4. Preparar soluciones de trabajo de cada fármaco experimental diluyendo cada fármaco más vehículo (dimetilsulfóxido; DMSO) en 4,8 mL M9W suplementado con colesterol para obtener las concentraciones adecuadas. Disolver DMSO en 4.8 mL de M9W suplementado con colesterol para preparar el control del vehículo.
  5. Agregue 200 μL de cultivo concentrado de E. coli OP50 a cada tubo que contenga el control del vehículo o los medicamentos y tubos de vórtice para asegurarse de que estén mezclados.
  6. Para realizar el experimento, agregue 2 ml de cada solución de fármaco en funcionamiento o control de vehículo a cada pozo en una placa de cultivo de tejido de 12 pozos. Pruebe cada concentración de drogas y el control del vehículo por duplicado.
  7. Agregue ~ 100 larvas L1 por pozo (ver pasos de cultivo sincrónicos de C. elegans) usando una micropipeta estéril. Limite el volumen de gusanos a 10 μL.
  8. Incubar las placas a 20 °C.
  9. Suplementar los pomos con 50 μL de E. coli OP50 concentrada 10x en el día 3 del ensayo si es necesario.

5. Preparación de la almohadilla de agarosa para microscopía

  1. Prepare una solución de agarosa al 2% p/v disolviendo 0,1 g de agarosa en 5 ml de agua desionizada. Calentar el contenido en un microondas para disolver la agarosa. Se pueden preparar 20 diapositivas a partir de 5 ml de solución de agarosa.
  2. Coloque tiras de cinta de laboratorio a lo largo de dos portaobjetos de vidrio. La cinta actuará como espaciadores limitando el grosor de las almohadillas de agarosa. A partir de entonces, coloque un tercer portaobjetos de vidrio limpio entre los portaobjetos con cinta adhesiva.
  3. Para hacer una almohadilla de agarosa, atelice 100 μL de agarosa fundida en el centro del portaobjetos limpio. Coloque otro portaobjetos de vidrio limpio a través y encima de la agarosa y presione suavemente hacia abajo para formar una almohadilla. Retire la corredera superior cuando la almohadilla se haya solidificado.

6. Observación del fenotipo Muv en las cepas let-60, let-23 y lin-1

NOTA: Solo los fármacos candidatos que suprimen los fenotipos Muv en las cepas let-23 y let-60 se analizarán utilizando la cepa lin-1 para determinar si la inhibición ocurre a nivel de RAS o EGFR.

  1. Cuando se alcance la etapa adecuada del ciclo de vida (3 días para las cepas let-60 y let-23, 5 días para la cepa lin-1), retire las placas de la incubadora. y recoger los gusanos en tubos cónicos de 15 ml utilizando una pipeta.
  2. Centrifugar los tubos a 450 x g durante 1 min. Retire el M9W sin molestar el pellet de gusano y agregue 5 mL de M9W fresco.
  3. Repita el paso 6.2 dos veces.
  4. Sin molestar el gránulo del gusano, retire todos los M9W restantes por aspiración. A partir de entonces, agregue 500 μL de azida de sodio de 2 mM o clorhidrato de tetramisole de 2 mM. Permita que los tubos se incuben en RT durante 15 min. 2 mM de azida de sodio o 2 mM de clorhidrato de tetramisole anestesiará a los gusanos para la obtención de imágenes.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de usar equipo de protección personal (EPP) cuando manipule azida de sodio. La solución debe prepararse bajo una capucha química.
  5. Agregue 10 μL de la suspensión de gusano anestesiada en el centro de una almohadilla de agarosa. Coloque un #1.5 suavemente sobre la suspensión del gusano. Si es necesario, fije la cubierta con un poco de esmalte de uñas para evitar que se seque.
  6. Utilice un microscopio DIC para observar las cepas let-60(n1046), let-23(sa62) y lin-1(sy254). Imagine los gusanos a los aumentos de 10x y 20x.
  7. Para let-60(n1046) y let-23(sa62), puntúe los gusanos adultos en función de la presencia o ausencia del fenotipo Muv. Mientras que para la cepa lin-1, cuente el número de VPC que adoptaron destinos celulares de 1 ° o 2 ° en el lado ventral de las larvas L4 utilizando un microscopio DIC de alta resolución.
  8. Después de calificar las micrografías para cada cepa y tratamiento farmacológico, realice la prueba tde Student para determinar las diferencias estadísticas entre los tratamientos.

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Representative Results

Primero demostramos que la R-fendilina es capaz de suprimir el fenotipo Muv en la cepa mutante let-60(n1046) en comparación con los gusanos tratados con DMSO. Nuestros datos muestran que la R-fendilina es capaz de bloquear el fenotipo Muv en el let-60(n1046) de una manera dependiente de la dosis(Figura 2A,B). Sin embargo, no se observó reversión del fenotipo Muv en la cepa mutante nula lin-1 en respuesta al aumento de las concentraciones de R-fendilina (Figura 2B). Los datos sugieren que los bloques de R-fendilina activaron la señalización let-60 a nivel de RAS en C. elegans. Del mismo modo, observamos que el fenotipo Muv se redujo significativamente en la cepa let-23(sa62) en respuesta al tratamiento con R-fendilina de 3, 10 y 30 μM en relación con los gusanos tratados con DMSO (Figura 2C, D). En todos los experimentos, se utilizó la prueba tde Students para determinar la significación estadística.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo que representa los pasos involucrados en la preparación de los ensayos de medicamentos utilizando cepas let-60(n1046), let-23(sa62) y lin-1(sy254). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: R-fendilina altera la función let-60 y let-23 en C. elegans de una manera dependiente de la dosis. (A) Imágenes representativas de gusanos let-60(n1046) en presencia de vehículo (DMSO) o 30 μM R-fendilina. (B) Cuantificación del fenotipo Muv en gusanos let-60(n1046) tratados en presencia de DMSO, 3, 10 y 30 μM R-fendilina, o 30 μM U0126. (C) Imágenes representativas de gusanos let-23(sa62) en presencia de vehículo (DMSO) o 30 μM R-fendilina. (D) Cuantificación del fenotipo Muv en gusanos let-23(sa62) tratados en presencia de DMSO, 3, 10 y 30 μM R- fendilina, o 30 μM U0126. En todas las imágenes las pseudovulvas están indicadas por flechas blancas y la vulva normal por asteriscos blancos. Se imágenes de un total de 60 gusanos para cada tratamiento. El experimento se repitió 3 veces. (*** P<0,001 y ** P<0,01 se consideraron significativos) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los ensayos que describimos utilizando el gusano son simples y económicos para identificar inhibidores de la función EGFR y RAS. C. elegans es un modelo atractivo para el descubrimiento de fármacos porque es fácil de cultivar en el laboratorio debido al corto ciclo de vida (3 días a 20 °C) y la capacidad de generar un gran número de larvas. Más importante aún, la vía EGFR-RAS-ERK MAPK se conserva evolutiva y funcionalmente con mamíferos que proporcionan un sistema genéticamente tratable para analizar los efectos de los inhibidores de EGFR y RAS. Además, la naturaleza transparente de los gusanos permite a un investigador visualizar estructuras distintas y la localización de la proteína fluorescente verde (GFP) u otro fluoróforo fusionado con proteínas de interés por DIC y microscopía fluorescente.

Los protocolos que utilizamos para propagar y mantener los diversos C. elegans utilizados en este estudio fueron establecidos previamente20,21. Sin embargo, en la preparación de las placas NG incorporamos estreptomicina y nistatina para prevenir la contaminación bacteriana y fúngica. La adición de estos agentes antimicrobianos no impidió el desarrollo de los gusanos y la inducción del fenotipo Muv.

Existen varias ventajas para la obtención de larvas L1 mediante el protocolo de sincronización de gusanos. Muchas larvas se pueden obtener de 2 o más placas que contienen adultos grávidos y las larvas recolectadas están sincronizadas por todas las edades. Esto asegura que el desarrollo de los gusanos sea consistente dentro de la población. Algunas cepas mutantes que muestran el fenotipo Muv son capas de huevos pobres, lo que resulta en bajos rendimientos de larvas como se ve en la mutación nula albergada en el factor de transcripción de la familia Ets lin-119. El tratamiento con lejía de los adultos grávidos lin-1 aumentará significativamente el número de larvas requeridas para el ensayo.

Es vital observar la lisis de los gusanos durante la preparación de un cultivo sincrónico de C. elegans. La gruesa cáscara de huevo protege parcialmente a los embriones de la acción de la mezcla de hidróxido de lejía y sodio, incluso cuando la cutícula de las larvas y los adultos se disuelve. Sin embargo, la exposición prolongada a la solución de lisis penetrará en esta carcasa protectora que conduce a la muerte de los embriones. Por lo tanto, es importante detener la acción de la mezcla de hidróxido de lejía y sodio cuando el 70% de los gusanos adultos se han lisado. Esto se logra diluyendo la solución de lisis con M9W. El mantenimiento de las larvas L1 detenidas es otro paso a considerar en el protocolo de cultivo síncrono de C. elegans. La incubación prolongada de las larvas detenidas L1 en M9W puede hacer que se transformen en la etapa dauer debido a la acumulación de la feromona dauer. Para evitar la formación de la etapa dauer, se sugiere usar las larvas detenidas L1 dentro de los 1-2 días posteriores a la recolección de los embriones.

El fenotipo muv basal es 60%-90% y 90% para los gusanos let-60(n1046) y let-23(sa62), respectivamente. Esto sugiere que los gusanos let-60(n1046) están sujetos a deriva fenotípica y, por lo tanto, es importante informar los niveles basales de expresión del fenotipo Muv. El tratamiento de los gusanos let-60(n1046) y let-23(sa62) con R-fendilina y otros inhibidores de K-RAS reduce el porcentaje de gusanos que expresan el fenotipo Muv. Sin embargo, también se informa que algunos inhibidores de la vía EGFR-RAS-ERK MAPK pueden reducir el número de pseudovulvas por gusano solo o pueden afectar tanto la expresión como el número de pseudovulvas17. Por lo tanto, es importante contar el número de pseudovulvas en los gusanos Muv tanto en los gusanos farmacológicos como en los tratados con DMSO. El fenotipo Muv expresado en gusanos adultos let-60(n1046) y let-23(sa62) es claramente visible bajo un microscopio de disección. Sin embargo, la cepa lin-1 (nula) es relativamente poco saludable, deteriorada por el desarrollo y las protuberancias vulvales se distinguen mal en los gusanos adultos. Por lo tanto, en lugar de las protuberancias vulvalas ectópicas, en los gusanos lin-1 (nulos), las VPC que adoptan un destino celular adoptado de 1 ° o 2 ° en el lado ventral en la etapa L4, se pueden contar utilizando un microscopio DIC de alta resolución.

El ensayo es económico, fácil y no requiere mucho tiempo de configuración. Para mejorar aún más el tiempo de procesamiento, los gusanos pueden ser anestesiados a una concentración final de 2 mM de azida de sodio dentro de los pozos de la placa de cultivo de tejidos y fotografiados usando un microscopio de disección equipado con una cámara. Otra modificación del ensayo sería utilizar E. coli OP50 muerta por calor en lugar de bacterias vivas23. Se ha demostrado que las bacterias pueden metabolizar ciertas moléculas pequeñas que conducen a bioactividades reducidas24.

Estudios previos han demostrado que la inducción de la vulva en el gusano depende de ciertas señales ambientales. Los fenotipos sin vulva de lin-3(n378) y let-23(n1045) han demostrado ser parcialmente suprimidos por inanición y salida de la etapa dauer14. Además, un estudio realizado por Moghal et al., mostró que los mutantes sin vulva lin-3(n378), let-23(sy1) y let-60(sy95dn) cultivados en tampón M9 tenían un mayor número de VPC asumiendo destinos de células vulvales en comparación con los animales cultivados en placas NG estándar24. Los datos sugieren que los gusanos cultivados en un ambiente líquido influyen en la inducción vulval. Sin embargo, en nuestros estudios no observamos la supresión del fenotipo Muv en un ambiente líquido.

En este protocolo demostramos el uso de C. elegans para evaluar las propiedades anti-RAS de la fendilina. En un estudio anterior, hemos demostrado que múltiples inhibidores ácidos de la esfingomielinasa, incluidos los antidepresivos tricíclicos como la desipramina, la imipramina y la amitriptilina, inhiben el fenotipo Muv18. Además, los inhibidores de las vías biosintéticas de la esfingomielina y la ceramida suprimen el fenotipo Muv expresado en los gusanos let-60(n1046). Estos hallazgos utilizando el gusano fueron validados en líneas celulares de mamíferos.

En conclusión, demostramos el uso de C. elegans para identificar inhibidores de la actividad de EGFR y RAS en un ensayo a base de líquido. Además, el gusano proporciona otro sistema para identificar y caracterizar los mecanismos de acción de las terapias anti-RAS y EGFR.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) por proporcionar el let-60 (n1046). También agradecemos al Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology en Houston) por la cepa lin-1. Finalmente, agradecemos a la Dra. Danielle Garsin y su laboratorio (La Universidad de Texas, Escuela de Medicina McGovern) por proporcionar algunos de los reactivos. Algunas cepas de gusanos fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (CPRIT) subvención RP200047 a JF Hancock.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and chemicals
Agarose  Millipore Sigma  A9539-50G
Bacto Peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
Magnesium Sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
R-Fendiline Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide Millipore Sigma  S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite  Bleach
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride Millipore Sigma  L9756
UO126 (MEK inhibitor) Millipore Sigma  19-147
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 50-197-4804
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
MT2124   let-60(n1046) IV. CGC
MT7567 lin-1(sy254) IV. CGC
PS1839 let-23(sa62) II. CGC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Investigación del cáncer Número 164 Caenorhabditis elegans LET-60 LET-23 K-RAS EGFR GFP
Identificación de inhibidores de EGFR y RAS mediante <em>Caenorhabditis elegans</em>
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van der Hoeven, D., Truong, T. N.… More

van der Hoeven, D., Truong, T. N. L., Naji, A., Thapa, S., Hancock, J. F., van der Hoeven, R. Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (164), e61788, doi:10.3791/61788 (2020).

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