Summary
Den genetiskt kanterbara nematoden Caenorhabditis elegans kan användas som en enkel och billig modell för läkemedelsupptäckt. Beskrivs här är ett protokoll för att identifiera cancer therapeutics som hämmar nedströms signalering av RAS och EGFR proteiner.
Abstract
Förändringarna i plasmamembranlokaliseringen av epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) och dess nedströms effektor RAS har varit inblandade i flera sjukdomar inklusive cancer. Den frilivade nematoden C. elegans har en evolutionär och funktionellt bevarad EGFR-RAS-ERK MAP-signalkaskad som är central för utvecklingen av vulva. Vinst av funktion mutationer i RAS homolog LET-60 och EGFR homolog LET-23 inducera generering av synliga nonfunctional ectopic pseudovulva längs ventrala kroppsväggen av dessa maskar. Tidigare har multivulval (Muv) fenotyp i dessa maskar visat sig hämmas av små kemiska molekyler. Här beskriver vi ett protokoll för att använda masken i en vätskebaserad analys för att identifiera hämmare som avskaffar verksamheten hos EGFR- och RAS-proteiner. Med hjälp av denna analys visar vi R-fendiline, en indirekt hämmare av K-RAS, undertrycker Muv fenotyp uttryckt i let-60 (n1046) och let-23 (sa62) mutantmaskar. Analysen är enkel, billig, är inte tidskrävande att ställa in, och kan användas som en första plattform för upptäckt av cancerterapier.
Introduction
De cellulära vägar som reglerar utvecklingshändelser inom organismer är mycket bevarade bland alla metazoaner. En sådan väg är EGFR-RAS-ERK mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPK) som signalerar kaskad som är en kritisk väg som styr cellproliferation, differentiering, migration och överlevnad1,2. Defekter i denna signalväg kan leda till patologiska eller sjukdomsstater som cancer. Epidermal tillväxtfaktorreceptorn (EGFR) har visat sig vara mycket uttryckt i mänskliga tumörer, inklusive 50% av oral skivepitelcancer, och bidrar till utvecklingen av maligna tumörer3,4,5. Mutationer i de tre RAS-isoformerna H-, K- och N-RAS är viktiga drivkrafter för malign omvandling i flera mänskliga cancerformer. Bland dessa tre RAS-isoformer är onkogena mutationer i K-RAS vanligast6,7,8. För att EGFR och RAS ska fungera måste de lokaliseras till plasmamembranet (PM). Att förhindra lokalisering av dessa molekyler till statsministern kan helt upphäva den biologiska aktiviteten hos denna signalväg9,10. Därför är hämningen av lokaliseringen av dessa proteiner till statsministern en terapeutisk strategi för att blockera nedströmssignalering och de resulterande negativa resultaten. Med hjälp av en screeninganalys med högt innehåll identifierades fendiline, en kalciumkanalblockerare av L-typ, som en hämmare av K-RAS-aktivitet11. Nanoklustering av K-RAS till den inre broschyren av PM reduceras avsevärt i närvaro av fendiline. Dessutom omfördelas K-RAS från plasmamembranet till det endoplasmatiska retikulumet (ER), Golgiapparaturen, endosomerna och cytosolen. Ännu viktigare är att spridningen av bukspottskörteln, tjocktarmen, lungan och endometriecancer cellinjer som uttrycker oncogenic mutant K-RAS blockeras av hämning av nedströms signalering av fendiline11. Dessa data tyder fendiline funktioner som en specifik K-RAS anticancer terapeutiska som orsakar fellokalisering av RAS proteinet till PM.
Nematoden Caenorhabditis elegans har studerats utförligt i samband med utvecklingen. Många av de signalvägar som styr utvecklingen i masken är evolutionära och funktionellt bevarade. Till exempel bevaras EGFR-medierad aktivering av RAS och efterföljande aktivering av ERK MAPK-signalkaskaden imasken 12. Kaskaden representeras av följande proteiner: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 är homologt till RAS, medan LET-23 är homologt för EGFR. I masken reglerar denna väg utvecklingen av vulva13. Vulva är en epitelapertur på maskens ventrala kroppsvägg som gör att befruktade ägg kan läggas. Bildandet av vulva i masken är beroende av exponeringen av vulval prekursorceller (VPC) till en övertoning av aktiveringen av EGFR-RAS-MAPK signal kaskad. Under den normala utvecklingen får de proximala VPN:erna starka signaler från gonadalankarcellerna för att differentiera sig till 1° och 2° cell öden som ger upphov till en funktionell vulva12. Medan distala VPN skiljer sig åt i 3 ° cell öden som smälter till hypodermal syncytium och inte bildar vulva på grund av utarmad signalering. I avsaknad av signalering skiljer sig alla VPN-tjänster till 3° cell öden vilket resulterar i bildandet av ingen vulva. Konstituerande signalering leder dock till bildandet en eller flera icke-funktionella vulva på grund av induktion av alla VPN att anta 1 ° och 2 ° cell öden.
Mutationer som orsakar defekt eller överdriven vulval induktion har identifierats för många av de gener som kodar för proteiner som representerar denna väg. Defekt vulval induktion resulterar i en vulvaless (Vul) fenotyp, medan överdriven vulval induktion resulterar i en multivulva (Muv) fenotyp som representeras av utvecklingen av många nonfunctional ectopic pseudovulvae i hela ventrala kroppsväggen. Muv fenotyp uttryckt av let-60 (n1046) stammen beror på en vinst av funktion mutation i RAS, medan i let-23 (sa62) stam det beror på en aktiverande mutation i EGFR14,15. Den starka Muv fenotyp i dessa mutanta stammar har visat sig vara störd av farmakologiska interventioner som framgår av behandling av let-60 (n1046) maskar med MEK-1-hämmaren U012616,17. Intressant nog har vi visat att R-fendilin och hämmare som påverkar sphingomyelin metabolism undertrycka Muv fenotyp imasken 18. För att demonstrera dessa hämmare blockera let-60 signalering på ras nivå, lin-1 null stam har använts17. Lin-1 är en Ets-liknande hämmande transkriptionsfaktor som fungerar som en förträngare i utvecklingen av vulva19. Stark återgång av Muv fenotyp i let-60 (n1046) maskar och ingen effekt på lin-1 null maskar tyder på att dessa hämningar uppstår på ras nivå.
I detta protokoll demonstrerar vi användningen av C. elegans som modell för att identifiera hämmare av RAS- och EGFR-proteiner. Med hjälp av en vätskebaserad analys visar vi de hämmande effekterna av R-fendilin genom att undertrycka Muv fenotyper i let-60 (n1046) och let-23 (sa62) mutanta stammar av C. elegans. Denna analys validerar användningen av C. elegans som ett verktyg i den inledande fasen av läkemedelsupptäckt för cancerterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nematod tillväxtmedel (NGM) platta förberedelse
- Tillsätt 2,5 g pepton och 3 g NaCl till 970 ml avjoniserat vatten i en 2 L Erlenmeyerkolv. Rör om innehållet med hjälp av en magnetisk omrörningsstång. Tillsätt därefter 20 g agar till kolven. Autoklavera kolvens innehåll vid 121 °C och ett tryck på 15 lb/in2 i 30 min. Efter sterilisering, placera kolven på en omrörning och låt mediet svalna tills temperaturen når 50 °C.
- För att förbereda NGM-plattorna tillsätt följande reagenser till det kylda mediet: 25 ml 1 M kaliumfosfatbuffert (pH = 6,0), 1 ml 1 M MgSO4,1 ml 1 M CaCl2,1 ml (5 mg/ml i 95% etanol) kolesterol, 1 ml (10% v/w i etanol) nystatin och 1 ml 25 mg/ml streptomycin.
- Häll det kylda mediet i 60 mm x 15 mm sterila petriskålar under ett laminärt flöde. Låt plattorna stelna i 2 timmar. Dessa plattor kan förvaras i 1 månad vid 4 °C.
2. Spridning av C. elegans
- Spot 100 μL över natten odlad E. coli OP50 på mitten av varje NGM-platta och låt plattorna torka i 24 timmar i en laminär huva. Därefter kan plattorna lagras i polystyrenbehållare.
OBS: E. coli OP50-kulturen odlas i Luria-Bertani (LB) media vid 37 °C media före sådd av plattorna. Kulturen kan lagras vid 4 °C i 1–2 månader och användas för periodisk sådd av tallrikar. - Använd en steril maskplockning och samla 10–12 gravida vuxna maskar från en tidigare odlad tallrik under ett dissekerande mikroskop. Överför dessa maskar till en färsk NGM-platta sådd med E. coli OP50 och inkubera plattan i 24 timmar vid 20 °C.
- Efter 24 timmar, med hjälp av en steril maskplockning ta bort vuxna maskar från plattorna. Inkubera plattorna vid 20 °C i ~ 3 dagar. Embryon kommer att utvecklas till gravida vuxna maskar.
3. Förberedelse av en synkron C. elegans kultur
- Samla gravid vuxna maskar i ett 15 ml koniskt rör genom att tvätta 2-4 plattor med M9W.
- Beredning av M9W: Lös upp 5 g NaCl, 6 g Na2HPO4och 3 g KH2PO4 i avjoniserat vatten till en slutlig volym av 1 L. Autoklav lösningen vid 121 °C vid ett tryck av 15 lb/i2 i 30 min. Tillsätt 1 ml 1 M MgSO4 till den kylda lösningen.
- Pellet maskarna genom att centrifugera röret vid 450 x g i 1 min. Dekanta supernaten utan att störa maskpelleten.
- Förbered masklyslösningen genom att kombinera 400 μL 8,25 % natriumhypoklorit (hushållsblekmedel) och 100 μL 5 N NaOH. Tillsätt denna lösning till maskpelleten och snärta röret för att blanda innehållet i röret. Förhindra överblekning av embryona i röret genom att observera maskarnas lys under ett dissekerande mikroskop.
- Tillsätt 10 ml M9W till det koniska röret för att späda lysblandningen när 70% av de vuxna maskarna har lysat.
- Centrifugera röret vid 450 x g i 1 min. Byt ut supernaten mot 10 ml M9W.
- Upprepa steg 3.5 två gånger.
- Efter avslutad tvättning, tillsätt 3-5 ml M9W för att återanvända äggpelleten. Rotera röret över natten med en hastighet av 18 varv/min på en rörrotator vid rumstemperatur (RT).
- Efter inkubation över natten, ta bort röret från rotatorn, pelleta L1 larverna genom att centrifugera röret vid 450 x g i 1 min. Aspirera M9W tills 250 μL finns kvar i röret.
- Skaka röret för att återuppliva larverna. Tillsätt tre 5 μL droppar som innehåller larverna på ett petriskållock. Med hjälp av ett dissekerande mikroskop räknas antalet maskar i varje droppe och bestämma antalet maskar i 1 μL.
4. Beredning av läkemedelsanalyser
Obs: Stegen i denna analys visas i figur 1.
- Odla 30 ml E. coli OP50 i ett koniskt rör på 50 ml vid 37 °C över natten i en orbital shaker vid 150 varv/min.
- Snurra över natten odlad E. coli OP50-kultur på 4 000 x g i 10 minuter för att pelleta cellerna. Ta bort supernaten och återanvänd pelleten i 3 ml M9W för att koncentrera kulturen.
- Innan du förbereder arbetslösningarna för läkemedelsanalysen, tillsätt 0,1 ml (5 mg/ml i 95% etanol) kolesterol i 100 ml M9W.
- Förbered arbetslösningar för varje experimentellt läkemedel genom att späda ut varje läkemedel plus fordon (dimetylsulfoxid; DMSO) i 4,8 ml M9W kompletterat med kolesterol för att erhålla lämpliga koncentrationer. Lös DMSO i 4,8 ml M9W kompletterat med kolesterol för att förbereda fordonskontrollen.
- Tillsätt 200 μL koncentrerad E. coli OP50-kultur till varje rör som innehåller fordonets kontroll eller läkemedel och virvelrör för att säkerställa att de blandas.
- För att utföra experimentet, tillsätt 2 ml av varje fungerande läkemedelslösning eller fordonskontroll till varje brunn i en 12-brunns vävnadskulturplatta. Testa varje läkemedelskoncentration och fordonskontroll i två exemplar.
- Tillsätt ~100 L1 larver per brunn (se synkrona C. elegans kultursteg) med hjälp av en steril mikropipett. Begränsa volymen av maskar till 10 μL.
- Inkubera plattorna vid 20 °C.
- Komplettera brunnar med 50 μL 10x koncentrerad E. coli OP50 på dag 3 av analysen vid behov.
5. Agarose pad förberedelse för mikroskopi
- Förbered en 2% w/v lösning av agarose genom att lösa upp 0,1 g agarose i 5 ml avjoniserat vatten. Värm innehållet i en mikrovågsugn för att lösa upp agarosen. 20 diabilder kan beredas från 5 ml agaroslösning.
- Placera remsor av labbtejp längs två glasrutschbanor. Tejpen fungerar som distanser som begränsar tjockleken på agarosekuddarna. Placera därefter en tredje ren glasrutschbana mellan de tejpade bilderna.
- För att göra en agarose pad, spot 100 μL smält agarose på mitten av den rena bilden. Placera en annan ren glasrutschbana över och ovanpå agarosen och tryck försiktigt ner för att bilda en kudde. Ta bort den övre bilden när dynan har stelnat.
6. Observation av Muv fenotyp i stammarna let-60, let-23 och lin-1
OBS: Endast läkemedelskandidater som undertrycker Muv-fenotyperna i let-23- och let-60-stammar kommer att analyseras med lin-1-stammen för att avgöra om hämningen sker på RAS- eller EGFR-nivå.
- När lämpligt steg i livscykeln uppnås (3 dagar för stammarna let-60 och let-23, 5 dagar för lin-1-stammen), ta bort plattorna från inkubatorn. och samla maskarna i 15 ml koniska rör med en pipett.
- Centrifugera rören vid 450 x g i 1 min. Ta bort M9W utan att störa maskpelleten och tillsätt 5 ml färsk M9W.
- Upprepa steg 6.2 två gånger.
- Utan att störa maskpelleten, ta bort alla återstående M9W genom aspiration. Tillsätt därefter 500 μL natriumazid med 2 mM natriumazid eller 2 mM tetramisolehydroklorid. Låt rören inkubera vid RT i 15 min. 2 mM natriumazid eller 2 mM tetramisolhydroklorid kommer att bedöva maskarna för avbildning.
VARNING: Se till att bära personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering av natriumazid. Lösningen måste beredas under en kemisk huva. - Tillsätt 10 μL av den sövd maskupphängningen i mitten av en agarosplatta. Placera en #1,5 täckslip försiktigt över maskupphängningen. Om det behövs, fixa täcket med lite nagellack för att förhindra torkning.
- Använd ett DIC-mikroskop för att observera stammarna let-60(n1046), let-23(sa62) och lin-1(sy254). Avbilda maskarna vid förstoringarna på 10x och 20x.
- För let-60(n1046) och let-23(sa62), poäng de vuxna maskarna baserat på förekomsten eller frånvaron av Muv fenotyp. Medan för lin-1-stammen, räkna antalet VPN-datorer som antog 1 ° eller 2 ° cell öden på ventrala sidan av L4 larver med hjälp av ett högupplöst DIC-mikroskop.
- Efter att ha fått mikrograferna för varje stam och läkemedelsbehandling, utför Studentens t-test för att bestämma de statistiska skillnaderna mellan behandlingarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi visar först att R-fendiline kan undertrycka Muv fenotyp i let-60 (n1046) mutant stam jämfört med DMSO behandlade maskar. Våra data visar att R-fendilin kan blockera Muv fenotyp i let-60(n1046) på ett dosberoende sätt (Figur 2A, B). Icke-återföring av fenotypen Muv observerades dock i lin-1 null mutant stam som svar på ökande koncentrationer av R-fendiline (Figur 2B). Uppgifterna tyder på att R-fendiline blockerar aktiverad let-60-signalering på RAS-nivå i C. elegans. På samma sätt observerade vi Muv fenotyp minskades avsevärt i let-23 (sa62) stam som svar på 3, 10 och 30 μM R-fendiline behandling i förhållande till DMSO behandlade maskar (Figur 2C, D). I alla experiment användes Students t-testför att bestämma den statistiska signifikansen.
Figur 1: Flödesschema som representerar de steg som är involverade i att förbereda läkemedelsanalyserna med let-60(n1046), let-23(sa62) och lin-1(sy254) stammar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: R-fendilin ändrar let-60 och let-23 funktion i C. elegans på ett dosberoende sätt. a)Representativa bilder av maskar med let-60(n1046) i närvaro av fordon (DMSO) eller 30 μM R-fendilin. B)Kvantifiering av fenotyp av Muv i maskar med let-60(n1046) som behandlats i närvaro av DMSO, 3, 10 och 30 μM R-fendilin, eller 30 μM U0126. C)Representativa bilder av maskar med let-23(sa62) i närvaro av fordon (DMSO) eller 30 μM R-fendilin. D)Kvantifiering av fenotyp av Muv i maskar med let-23(sa62) som behandlats i närvaro av DMSO, 3, 10 och 30 μM R- fendilin, eller 30 μM U0126. I alla bilder är pseudovulva indikeras av vita pilar och normala vulva av vita asterisker. Totalt 60 maskar avbildades för varje behandling. Experimentet upprepades 3 gånger. (*** P<0.001 och ** P<0.01 ansågs betydande) Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De analyser vi beskriver med masken är enkla och billiga för att identifiera hämmare av EGFR och RAS funktion. C. elegans är en attraktiv modell för läkemedelsupptäckt eftersom det är lätt att växa i labbet på grund av den korta livscykeln (3 dagar vid 20 °C) och förmågan att generera ett stort antal larver. Ännu viktigare är att EGFR-RAS-ERK MAPK-vägen är evolutionärt och funktionellt bevarad med däggdjur som tillhandahåller ett genetiskt tractable system för att analysera effekterna av EGFR- och RAS-hämmare. Vidare gör maskarnas transparenta natur det möjligt för en prövare att visualisera distinkta strukturer och lokaliseringen av grönt fluorescerande protein (GFP) eller annan fluorofor som smälts till proteiner av intresse av DIC och fluorescerande mikroskopi.
De protokoll vi använde för att sprida och underhålla de olika C. elegans som används i denna studie var tidigare etablerade20,21. Men vid beredning av NG-plattor införlivade vi streptomycin och nystatin för att förhindra bakteriell och svampförorening. Tillsats av dessa antimikrobiella medel hindrade inte utvecklingen av maskarna och induktion av Muv fenotyp.
Det finns flera fördelar med att få L1 larver genom masksynkroniseringsprotokollet. Många larver kan erhållas från 2 eller fler plattor som innehåller gravida vuxna och larverna som samlas in är alla ålderssynkronerade. Detta säkerställer att utvecklingen av maskarna är konsekvent inom befolkningen. Vissa mutanta stammar som visar Muv fenotyp är dåliga ägg lager vilket resulterar i låga utbyten av larver som ses i null mutationen som finns i Ets familjen transkription faktor lin-119. Blekning behandling av lin-1 gravid vuxna kommer avsevärt att öka antalet larver som krävs för analysen.
Det är viktigt att observera maskarnas lys under beredningen av en synkron C. elegans-kultur. Det tjocka äggskalet skyddar delvis embryona från verkan av blekmedelsnatriumhydroxidblandningen även när larvernas och vuxnas nagelband löses upp. Långvarig exponering för lyslösningen kommer dock att tränga in i detta skyddande hölje som leder till embryonas död. Därför är det viktigt att stoppa verkan av blekmedelsnatriumhydroxidblandningen när 70% av de vuxna maskarna har lysat. Detta uppnås genom att späda lyslösningen med M9W. Underhållet av de arresterade L1-larverna är ytterligare ett steg att tänka på i det synkrona C. elegans kulturprotokollet. Långvarig inkubation av L1 arresterade larver i M9W kan orsaka dem att omvandlas till dauer scenen på grund av ackumulering av dauer feromon. För att undvika bildandet av dauerstadiet föreslås att använda L1 arresterade larver inom 1-2 dagar efter insamling av embryona.
Den basala Muv fenotyp är 60%-90% och 90% för let-60 (n1046) respektive let-23 (sa62) maskar. Detta tyder på att let-60 (n1046) maskar är föremål för fenotypisk drift och därför är det viktigt att rapportera de basala nivåerna av uttryck av Muv fenotyp. Behandling av let-60(n1046) och let-23(sa62) maskar med R-fendiline och andra K-RAS-hämmare minskar andelen maskar som uttrycker fenotyp Muv. Det rapporteras dock också att vissa hämmare av EGFR-RAS-ERK MAPK-vägen kan minska antalet pseudovulvae per mask ensam eller kan påverka både uttrycket och antalet pseudovulvae17. Därför är det viktigt att räkna antalet pseudovulvae i Muv-maskarna i både drog- och DMSO-behandlade maskar. Muv fenotyp uttryckt i let-60(n1046) och let-23 (sa62) vuxna maskar är tydligt synliga under ett dissekerande mikroskop. Lin-1 (null) stammen är dock relativt ohälsosam, utvecklingsmässigt nedsatt och vulval utskjutande är dåligt framstående i de vuxna maskarna. Därför, i stället för ectopic vulval utskjutningar, i lin-1 (null) maskar, VPN som antar en adopterad 1 ° eller 2 ° cell öden på ventrala sidan i L4 scenen, kan räknas med hjälp av en högupplöst DIC mikroskop.
Analysen är billig, enkel och inte tidskrävande att ställa in. För att ytterligare förbättra bearbetningstiden kan maskarna bedövas till en slutlig koncentration av 2 mM natriumazid i brunnarna på vävnadskulturplattan och avbildas med hjälp av ett dissekerande mikroskop utrustat med en kamera. En annan modifiering av analysen skulle vara att använda värme dödade E. coli OP50 istället för levande bakterier23. Det har visat sig att bakterier kan metabolisera vissa små molekyler som leder till minskad bioaktivitet24.
Tidigare studier har visat att induktion av vulva i masken är beroende av vissa miljösignaler. De vulvaless fenotyperna av lin-3(n378) och let-23(n1045) har visat sig delvis undertryckas av svält och lämnar dauer steg14. Dessutom visade en studie av Moghal et al., att vulvaless lin-3(n378), let-23(sy1) och let-60(sy95dn) mutanter odlade i M9-buffert hade ett högre antal VPN-tjänster som antog vulvalcellens öden jämfört med djur som odlades på vanliga NG-plattor24. Data tyder på maskar odlas i en flytande miljö påverkar vulval induktion. Men i våra studier observerade vi inte undertryckandet av Muv fenotyp i en flytande miljö.
I detta protokoll visar vi användningen av C. elegans för att utvärdera anti-RAS egenskaper fendiline. I en tidigare studie har vi visat att flera sura sphingomyelinase inhibitorer, inklusive trecykliska antidepressiva såsom desipramine, imipramine och amitriptylin hämma Muv fenotyp18. Dessutom undertrycker hämmare av sphingomyelin och ceramid biosyntetiska vägar Muv fenotyp uttryckt i let-60 (n1046) maskar. Dessa resultat med hjälp av masken validerades i däggdjur cellinjer.
Sammanfattningsvis visar vi användningen av C. elegans för att identifiera hämmare av EGFR och RAS verksamhet i en vätskebaserad analys. Dessutom ger masken ett annat system för att identifiera och karakterisera verkningsmekanismerna för anti-RAS och EGFR-terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) för att tillhandahålla let-60 (n1046). Vi tackar också Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology i Houston) för lin-1-stammen. Slutligen tackar vi Dr Danielle Garsin och hennes labb (University of Texas, McGovern Medical School) för att de tillhandahåller några av reagenserna. Vissa maskstammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Denna forskning stöddes av Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) anslag RP200047 till JF Hancock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
References
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
