Summary
Genetik olarak çekilebilir nematod Caenorhabditis elegans, ilaç keşfi için basit ve ucuz bir model olarak kullanılabilir. Burada, RAS ve EGFR proteinlerinin aşağı akış sinyalini engelleyen antikanser terapötiklerini tanımlamak için bir protokol açıklanmıştır.
Abstract
Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve aşağı akış efektörü RAS'ın plazma membran lokalizasyonundaki değişiklikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara karışmıştır. Serbest yaşayan nematod C. elegans, vulvanın gelişimi için merkezi olan evrimsel ve işlevsel olarak korunmuş bir EGFR-RAS-ERK MAP sinyal kaskadına sahiptir. RAS homolog LET-60 ve EGFR homolog LET-23'te fonksiyon mutasyonlarının kazanılması, bu solucanların ventral vücut duvarı boyunca görünür işlevsiz ektopik psödoovulva üretimine neden olur. Daha önce, bu solucanlardaki multivulval (Muv) fenotipinin küçük kimyasal moleküller tarafından inhibe edildiği gösterilmiştir. Burada, EGFR ve RAS proteinlerinin faaliyetlerini kaldıran inhibitörleri tanımlamak için solucanı sıvı bazlı bir testte kullanma protokolünü açıklıyoruz. Bu tahlilleri kullanarak, K-RAS'ın dolaylı bir inhibitörü olan R-fendiline'in let-60(n1046) ve let-23(sa62) mutant solucanlarında ifade edilen Muv fenotipini baskıladığını gösteriyoruz. Test basit, ucuz, kurulum için zaman alıcı değildir ve antikanser terapötiklerin keşfi için bir başlangıç platformu olarak kullanılabilir.
Introduction
Organizmalar içindeki gelişimsel olayları düzenleyen hücresel yollar tüm metazoanlar arasında oldukça korunmuştır. Bu yollardan biri EGFR-RAS-ERK mitojen aktive protein kinaz (MAPK) hücre çoğalması, farklılaşma, göç ve sağkalım1,2yöneten kritik bir yol olan çağlayan sinyaldir. Bu sinyal yollarındaki kusurlar patolojik veya kanser gibi hastalık durumlarına yol açabilir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), oral skuamöz hücreli karsinomların % 50'si de dahil olmak üzere insan tümörlerinde yüksek oranda eksprese edildiğini ve malign tümörlerin gelişimine katkıda bulunduğunu göstermiştir3,4,5. Üç RAS izoformu H-, K ve N-RAS'daki mutasyonlar birden fazla insan kanserinde kötü huylu dönüşümün başlıca iticileridir. Bu üç RAS izoformu arasında, K-RAS'daki onkojenik mutasyonlar en yaygın6,7,8 'dir. EGFR ve RAS'ın çalışması için plazma membranını (PM) lokalize etmeleri gerekir. Bu moleküllerin PM'ye lokalizasyonunu önlemek, bu sinyal yolu9,10'unbiyolojik aktivitesini tamamen yok edebilir. Bu nedenle, bu proteinlerin PM'ye lokalizasyonunun inhibisyonu, aşağı akış sinyalini ve ortaya çıkan olumsuz sonuçları engellemek için terapötik bir stratejidir. Yüksek içerikli bir tarama tahlilleri kullanılarak, L tipi kalsiyum kanal bloker olan fendiline, K-RAS aktivitesinin inhibitörü olarak tanımlanmıştır11. K-RAS'ın PM'nin iç broşürüne nanokütlesi, fendilin varlığında önemli ölçüde azalır. Ayrıca, K-RAS plazma zarından endoplazmik retikülüse (ER), Golgi aparatına, endozomlara ve sitozollere yeniden dağıtılır. Daha da önemlisi, onkojenik mutant K-RAS'ı ifade eden pankreas, kolon, akciğer ve endometriyal kanser hücre hatlarının çoğalması, fendiline11ile aşağı akış sinyalinin inhibisyonu ile engellenir. Bu veriler, fendiline'in RAS proteininin PM'ye yanlış lokalizasyonuna neden olan belirli bir K-RAS antikanser terapötik olarak işlev gösterdiğini göstermektedir.
Nematod Caenorhabditis elegans gelişim bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Solucandaki gelişimi yöneten sinyal yollarının çoğu evrimsel ve işlevsel olarak korunmuş. Örneğin, RAS'ın EGFR aracılı aktivasyonu ve erk MAPK sinyal basamaklamanın daha sonra etkinleştirilmesi solucan12'de korunur. Basamak aşağıdaki proteinlerle temsil edilir: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 RAS için homolog, LET-23 ise EGFR için homologdur. Solucanda, bu yol vulva gelişimini düzenler13. Vulva, solucanın ventral vücut duvarında döllenmiş yumurtaların döşenmesini sağlayan epitel bir diyaframdır. Solucandaki vulva oluşumu, vulval öncül hücrelerin (VPC) EGFR-RAS-MAPK sinyal basamaklanmasının aktivasyonuna maruz kalmasına bağlıdır. Normal gelişim sırasında, proksimal VPC'ler, fonksiyonel birvulva12'ye yol açan 1° ve 2 ° hücre kaderlerine farklılaşmak için gonadal çapa hücrelerinden güçlü sinyaller alır. Distal VPC'ler hipodermal senkryuma kaynaşan ve tükenmiş sinyaller nedeniyle vulva oluşturmayan 3° hücre kaderlerine farklılık sağlar. Sinyalizasyonun yokluğunda, tüm VPC'ler 3 ° hücre kaderlerine farklılaşarak vulva oluşumuna neden olur. Bununla birlikte, konsitülatif sinyalleme, tüm VPC'lerin 1° ve 2° hücre kaderlerini üstlenme indüksiyonu nedeniyle bir veya daha fazla işlevsel olmayan vulva oluşumuna yol açar.
Bu yolu temsil eden proteinleri kodlayan genlerin birçoğu için kusurlu veya aşırı vulval indüksiyona neden olan mutasyonlar tanımlanmıştır. Kusurlu vulval indüksiyon vulvasız (Vul) bir fenotiple sonuçlanırken, aşırı vulval indüksiyon ventral vücut duvarı boyunca çok sayıda işlevsiz ektopik psödoovulvanın gelişmesiyle temsil edilen multivulva (Muv) fenotip ile sonuçlanır. Let-60(n1046) suşu tarafından ifade edilen Muv fenotipi RAS'daki fonksiyon mutasyonunun kazanıcılığından kaynaklanırken, let-23(sa62) suşunda EGFR14,15'te aktive edici bir mutasyondan kaynaklanmaktadır. Bu mutant suşlarındaki güçlü Muv fenotipinin, let-60(n1046) solucanlarının MEK-1 inhibitörü U0126 16 ,17ile tedavisinde gösterildiği gibi farmakolojik müdahalelerle pertüre olduğu gösterilmiştir. İlginçtir ki, sphingomyelin metabolizmasını etkileyen R-fendilin ve inhibitörlerin solucandaki Muv fenotipini baskıladığını gösterdik18. Bu inhibitörlerin RAS seviyesinde let-60 sinyalini engellediğini göstermek için lin-1 boş suşukullanılmıştır 17. Lin-1, vulva19'ungelişiminde bir baskılayıcı olarak işlev gösteren Ets benzeri bir inhibitör transkripsiyon faktörüdür. Let-60(n1046) solucanlarında Muv fenotipinin güçlü bir şekilde geri çevrilmesi ve lin-1 null solucanlar üzerinde hiçbir etkisi olmaması, bu inhibisyonların RAS düzeyinde gerçekleştiğini göstermektedir.
Bu protokolde, RAS ve EGFR proteinlerinin inhibitörlerini tanımlamak için C. elegans'ın bir model olarak kullanıldığını gösteriyoruz. Sıvı bazlı bir tahlil kullanarak, C. elegans'ın let-60(n1046) ve let-23(sa62) mutant suşlarındaki Muv fenotiplerini bastırarak R-fendilin inhibitör etkilerini gösteriyoruz. Bu test, antikanser terapötikler için ilaç keşfinin ilk aşamasında C. elegans'ın bir araç olarak kullanılmasını doğrulamaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nematod büyüme ortamı (NGM) plaka hazırlama
- 2 L Erlenmeyer şişesinde bulunan 970 mL deiyonize suya 2,5 g pepton ve 3 g NaCl ekleyin. İçeriği manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırın. Daha sonra, şişeye 20 g agar ekleyin. Şişenin içeriğini 121 °C'de ve 15 lb/in2 basınçta 30 dakika boyunca otoklavlayın. Sterilizasyondan sonra, şişeyi bir karıştırma plakasına yerleştirin ve sıcaklığın 50 ° C'ye ulaşana kadar ortamın soğumasını bekleyin.
- NGM plakalarını hazırlamak için soğutulmuş ortama aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 25 mL 1 M potasyum fosfat tamponu (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL (%95 etanolde 5 mg/mL) kolesterol, 1 mL (etanolde% 10 v / w) nystatin ve 1 mL 25 mg / mL streptomisin.
- Laminer bir akış altında, soğutulmuş ortamı 60 mm x 15 mm steril Petri kaplarına dökün. Plakaların 2 saat katılaşmasını bırakın. Bu plakalar 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
2. C. eleganların yayılması
- Her NGM plakasının ortasına 100 μL gece yetiştirilen E. coli OP50'yi tespit edin ve plakaların laminar bir başlıkta 24 saat kurumasını bekleyin. Daha sonra, plakalar polistiren kapta saklanabilir.
NOT: E. coli OP50 kültürü, plakaların tohumlanması öncesinde Luria-Bertani (LB) medyasında 37 °C media'da yetiştirilir. Kültür 1-2 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir ve plakaların periyodik tohumlama için kullanılabilir. - Steril bir solucan toplama kullanarak, daha önce yetiştirilen bir tabaktan 10-12 gravid yetişkin solucanı bir diseksiyon mikroskobu altında toplayın. Bu solucanları E. coli OP50 ile tohumlanmış taze bir NGM plakasına aktarın ve plakayı 20 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
- 24 saat sonra, steril bir solucan toplama kullanarak yetişkin solucanları plakalardan çıkarın. Plakaları ~ 3 gün boyunca 20 ° C'de kuluçkaya yatırın. Embriyolar gravid yetişkin solucanlara dönüşecek.
3. Senkron C. elegans kültürünün hazırlanması
- Gravid yetişkin solucanlarını M9W ile 2-4 tabak yıkayarak 15 mL konik bir tüpe toplayın.
- M9W'ın hazırlanması: 5 g NaCl, 6 g Na 2 HPO 4ve 3 g KH2PO4'ü iyonize suda 1 L'lik son hacme kadar çözün. Soğutulmuş çözeltiye 1 mL 1 M MgSO4 ekleyin.
- Tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj ederek solucanları peletin. Solucan peletini bozmadan süpernatantı dekant.
- %8,25 sodyum hipoklorit (ev tipi çamaşır suyu) ve 5 N NaOH'un 100 μL'sini birleştirerek solucan lizis çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi solucan peleti ekleyin ve tüpün içeriğini karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. Solucanların lizizini bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyerek tüpteki embriyoların aşırı etkilenmesini önleyin.
- Yetişkin solucanların% 70'i lize olduğunda lizis karışımını seyreltmek için konik tüpe 10 mL M9W ekleyin.
- Tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj edin. Süpernatant'ı 10 mL M9W ile değiştirin.
- 3,5 adımlarını iki kez yineleyin.
- Yıkama adımlarını tamamladıktan sonra, yumurta peletini yeniden çıkarmak için 3-5 mL M9W ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında (RT) bir tüp rotator üzerinde 18 rpm hızında gece boyunca döndürün.
- Gece kuluçkadan sonra, tüpü rotatordan çıkarın, tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj ederek L1 larvalarını peletin. M9W'ı tüpte 250 μL kalana kadar aspire edin.
- Larvaları yeniden çıkarmak için tüpü sallayın. Bir Petri kabı kapağına larvaları içeren üç 5 μL damla ekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her damladaki solucan sayısını sayın ve 1 μL'deki solucan sayısını belirleyin.
4. İlaç testlerinin hazırlanması
NOT: Bu testteki adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir.
- 150 rpm'de bir yörünge çalkalayıcıda bir gecede 37 °C'de 50 mL konik tüpte 30 mL E. coli OP50 yetiştirin.
- Hücreleri peletmek için 10 dakika boyunca 4.000 x g'da bir gecede yetiştirilen E. coli OP50 kültürünü döndürün. Süpernatant çıkarın ve kültürü konsantre etmek için peletin 3 mL M9W'ta yeniden süzülür.
- İlaç tahlil için çalışma çözümlerini hazırlamadan önce, 100 mL ML M9W'a 0,1 mL (%95 etanolde 5 mg/mL) kolesterol ekleyin.
- Her ilaç artı aracı seyrelterek her deneysel ilacın çalışma çözümlerini hazırlayın (dimetil süloksit; DMSO) 4.8 mL M9W uygun konsantrasyonları elde etmek için kolesterol ile desteklenmiştir. Araç kontrolünü hazırlamak için DMSO'yu kolesterolle desteklenmiş 4,8 mL M9W'da çözün.
- Karıştırıldıklarından emin olmak için araç kontrolünü veya uyuşturucu ve girdap tüplerini içeren her tüpe 200 μL konsantre E. coli OP50 kültürü ekleyin.
- Deneyi gerçekleştirmek için, her kuyuya 12 kuyu doku kültürü plakasında her bir ilaç çözeltisinin veya araç kontrolünün 2 mL'sini ekleyin. Her uyuşturucu konsantrasyonu ve araç kontrolünü kopya olarak test edin.
- Steril bir mikropipette kullanarak kuyu başına ~100 L1 larva ekleyin (bkz. senkron C. elegans kültür adımları). Solucanların hacmini 10 μL ile sınırlandırın.
- Plakaları 20 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Gerekirse tahlilin 3. gününde 50 μL 10x konsantre E. coli OP50 ile takviye kuyuları.
5. Mikroskopi için agarose ped hazırlığı
- 5 mL deiyonize suda 0,1 g agarose eriterek% 2 w / v agarose çözeltisi hazırlayın. Agarose'un çözünmesi için içindekileri mikrodalga fırında ısıtın. 5 mL agarose çözeltisinden 20 slayt hazırlanabilir.
- laboratuvar bandı şeritlerini iki cam slayt boyunca yerleştirin. Bant, agarose pedlerinin kalınlığını sınırlayan aralayıcılar olarak hareket edecektir. Daha sonra, bantlanmış slaytların arasına üçüncü bir temiz cam slayt yerleştirin.
- Bir agarose ped yapmak için, temiz slaytın ortasına 100 μL erimiş agarose bulun. Agarose boyunca ve üstüne başka bir temiz cam slayt yerleştirin ve bir ped oluşturmak için hafifçe bastırın. Ped katılaştırıldığında üst slaydı çıkarın.
6. Muv fenotipinin let-60, let-23 ve lin-1 suşlarında gözlemlenmesi
NOT: Sadece let-23 ve let-60 suşlarındaki Muv fenotiplerini baskılayan aday ilaçlar, inhibisyonun RAS veya EGFR düzeyinde gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için lin-1 suşu kullanılarak test edilecektir.
- Yaşam döngüsünün uygun aşamasına ulaşıldığında (let-60 ve let-23 suşları için 3 gün, lin-1 suşu için 5 gün), plakaları inkübatörden çıkarın. ve solucanları bir pipet kullanarak 15 mL konik tüplerde toplayın.
- Tüpleri 450 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- 6.2 adımlarını iki kez yineleyin.
- Solucan peletini bozmadan, kalan tüm M9W'yi aspirasyonla çıkarın. Daha sonra, 500 μL 2 mM sodyum azit veya 2 mM tetramisol hidroklorür ekleyin. Tüplerin RT'de 15 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin, 2 mM sodyum azit veya 2 mM tetramisol hidroklorür görüntüleme için solucanları uyuşturacaktır.
DİkKAT: Sodyum azid kullanırken kişisel koruyucu ekipman (KKD) giydiğinden emin olun. Çözelti kimyasal bir başlık altında hazırlanmalıdır. - Bir agarose pedinin ortasına 10 μL anestezi solucan süspansiyonu ekleyin. Solucan süspansiyonu üzerine hafifçe #1,5 kapak zarı yerleştirin. Gerekirse, kurumasını önlemek için kapak kapağını biraz oje ile sabitleyin.
- Let-60(n1046), let-23(sa62) ve lin-1(sy254) suşlarını gözlemlemek için bir DIC mikroskobu kullanın. Solucanları 10x ve 20x büyütmelerde görüntüleyin.
- Let-60(n1046) ve let-23(sa62) için, Muv fenotipinin varlığına veya yokluğuna göre yetişkin solucanları puanlama. Lin-1 suşu için, yüksek çözünürlüklü bir DIC mikroskobu kullanarak L4 larvalarının ventral tarafında 1° veya 2 ° hücre kaderlerini benimseyen VPC sayısını sayın.
- Her suş ve ilaç tedavisi için mikro grafikleri puanlama yaptıktan sonra, tedaviler arasındaki istatistiksel farklılıkları belirlemek için Öğrenci t-testini gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk olarak R-fendiline'in let-60(n1046) mutant suşundaki Muv fenotipini DMSO tarafından tedavi edilen solucanlara kıyasla bastırabildiğini gösteriyoruz. Verilerimiz, R-fendiline'in let-60(n1046) 'daki Muv fenotipini doza bağımlı bir şekilde engelleyebildiğini göstermektedir (Şekil 2A,B). Bununla birlikte, artan R-fendiline konsantrasyonlarına yanıt olarak lin-1 boş mutant suşunda Muv fenotipinin tersine çevrilmemesi gözlenmiştir (Şekil 2B). Veriler, R-fendiline bloklarının C. elegans'takiRAS seviyesinde etkinleştirilmiş let-60 sinyalini engellediğini göstermektedir. Benzer şekilde, DMSO tedavi solucanlarına göre 3, 10 ve 30 μM R-fendiline tedavisine yanıt olarak let-23(sa62) suşunda Muv fenotipinin önemli ölçüde azaldığını gözlemledik (Şekil 2C,D). Tüm deneylerde, istatistiksel önemi belirlemek için Öğrenciler t-testi kullanılmıştır.
Şekil 1: Let-60(n1046) , let-23(sa62)ve lin-1(sy254) suşlarını kullanarak ilaç testlerinin hazırlanmasında yer alan adımları temsil eden akış çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: R-fendiline, C. elegans'ta let-60 ve let-23 fonksiyonlarını doza bağımlı bir şekilde değiştirir. (A) Let-60(n1046) solucanlarının araç (DMSO) veya 30 μM R-fendiline varlığında temsili görüntüleri. (B) DMSO, 3, 10 ve 30 μM R-fendiline veya 30 μM U0126 varlığında tedavi edilen let-60(n1046) solucanlarında Muv fenotipinin nicelemesi. (C) Let-23(sa62) solucanlarının araç (DMSO) veya 30 μM R-fendiline varlığında temsili görüntüleri. (D) DMSO, 3, 10 ve 30 μM R-fendiline veya 30 μM U0126 varlığında tedavi edilen let-23(sa62) solucanlarında Muv fenotipinin nicelemesi. Tüm görüntülerde psödoovulva beyaz oklarla ve normal vulva beyaz yıldızlarla gösterilir. Her tedavi için toplam 60 solucan görüntülendi. Deney 3 kez tekrarlandı. (*** P<0.001 ve ** P<0.01 önemli kabul edildi) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Solucanı kullanarak tarif ettiğimiz tahliller, EGFR ve RAS fonksiyonunun inhibitörlerini tanımlamak için basit ve ucuzdur. C. elegans ilaç keşfi için çekici bir modeldir, çünkü kısa yaşam döngüsü (20 ° C'de 3 gün) ve çok sayıda larva üretme yeteneği nedeniyle laboratuvarda büyümek kolaydır. Daha da önemlisi, EGFR-RAS-ERK MAPK yolu, EGFR ve RAS inhibitörlerinin etkilerini analiz etmek için genetik olarak çekişli bir sistem sağlayan memeliler ile evrimsel ve işlevsel olarak korunur. Ayrıca, solucanların şeffaf doğası, bir araştırmacının farklı yapıları ve DIC ve floresan mikroskopi ile ilgi çekici proteinlerle kaynaşmış Yeşil floresan Protein (GFP) veya diğer floroforların lokalizasyonunu görselleştirmesini sağlar.
Bu çalışmada kullanılan çeşitli C. eleganların yayılması ve sürdürülmesi için kullandığımız protokoller daha önce20,21. Bununla birlikte, NG plakalarının hazırlanmasında bakteriyel ve mantar kontaminasyonlarını önlemek için streptomisinin ve nezlenin bir araya geldik. Bu antimikrobiyal ajanların eklenmesi solucanların gelişimini ve Muv fenotipinin indüksiyonunu engellemedi.
Solucan senkronizasyon protokolü ile L1 larvaları elde etmenin çeşitli avantajları vardır. Birçok larva, gravid yetişkinleri içeren 2 veya daha fazla plakadan elde edilebilir ve toplanan larvaların hepsi yaş senkronize edilir. Bu, solucanların gelişiminin popülasyon içinde tutarlı olmasını sağlar. Muv fenotipini gösteren bazı mutant suşları, Ets ailesi transkripsiyon faktörü lin-119'dabulunan boş mutasyonda görüldüğü gibi düşük larva verimine neden olan zayıf yumurta katmanlarıdır. Lin-1 gravid yetişkinlerinin çamaşır suyu tedavisi, test için gerekli larva sayısını önemli ölçüde artıracaktır.
Senkron bir C. elegans kültürünün hazırlanması sırasında solucanların lizizini gözlemlemek hayati önem taşır. Kalın yumurta kabuğu, larvaların ve yetişkinlerin kütikülleri çözünse bile embriyoları çamaşır suyu sodyum hidroksit karışımının etkisinden kısmen korur. Bununla birlikte, lizis çözeltisine uzun süre maruz kalmak embriyoların ölümüne yol açan bu koruyucu kasaya nüfuz edecektir. Bu nedenle, yetişkin solucanların% 70'i döktüsünde çamaşır suyu sodyum hidroksit karışımının eylemini durdurmak önemlidir. Bu, liziz çözeltisinin M9W ile seyreltilerek elde edilir. Tutuklanan L1 larvalarının bakımı, senkron C. elegans kültür protokolünde dikkate alınması gereken başka bir adımdır. M9W'da L1 tutuklanan larvaların uzun süre inkübasyonu, dauer feromonunun birikmesi nedeniyle lahana aşamasına dönüşmelerine neden olabilir. Lahana aşamasının oluşumunu önlemek için, embriyoları topladıktan sonraki 1-2 gün içinde L1 tutuklanan larvaların kullanılması önerilir.
Bazal Muv fenotipi, let-60(n1046) ve let-23(sa62) solucanları için sırasıyla% 60-% 90 ve% 90'dır. Bu, let-60(n1046) solucanlarının fenotipsel sürüklenmeye maruz kaldığını ve bu nedenle Muv fenotipinin bazal ifade seviyelerinin raporlandırılmasının önemli olduğunu göstermektedir. Let-60(n1046) ve let-23(sa62) solucanlarının R-fendiline ve diğer K-RAS inhibitörleri ile tedavisi, Muv fenotipini ifade eden solucanların yüzdesini azaltır. Bununla birlikte, EGFR-RAS-ERK MAPK yolunun bazı inhibitörlerinin sadece solucan başına psödovulva sayısını azaltabileceği veya hem ifadeyi hem de psödovulvae sayısını etkileyebileceği bildiriliyor17. Bu nedenle, hem ilaç hem de DMSO tarafından tedavi edilen solucanlarda Muv solucanlarındaki psödovulvae sayısını saymak önemlidir. Let-60(n1046) ve let-23(sa62) yetişkin solucanlarında ifade edilen Muv fenotipi, diseksiyon mikroskobu altında açıkça görülebilir. Bununla birlikte, lin-1 (null) suşu nispeten sağlıksızdır, gelişimsel olarak bozulur ve vulval çıkıntılar yetişkin solucanlarda zayıf bir şekilde ayırt edilir. Bu nedenle, ektopik vulval çıkıntılar yerine, lin-1 (null) solucanlarda, L4 aşamasında ventral tarafta benimsenmiş 1° veya 2 ° hücre kaderlerini benimseyen VPC'ler, yüksek çözünürlüklü bir DIC mikroskobu kullanılarak sayılabilir.
Test ucuz, kolay ve kurulum için zaman alıcı değil. İşlem süresini daha da iyileştirmek için solucanlar, doku kültürü plakası kuyuları içinde 2 mM sodyum azit son konsantrasyonuna uyuşturulabilir ve bir kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Testte başka bir değişiklik, canlı bakteriler yerine ısıdan öldürülmüş E. coli OP50 kullanmak olacaktır23. Bakterilerin biyoaktivitelerin azalmasına yol açan bazı küçük molekülleri metabolize edebileceği gösterilmiştir24.
Önceki çalışmalar, solucandaki vulvanın indüksiyonunun belirli çevresel ipuçlarına bağlı olduğunu göstermiştir. Lin-3(n378) ve let-23(n1045) vulvaless fenotiplerinin açlıktan kısmen bastırıldığı ve dauerevresi 14.'dençıktığı gösterilmiştir. Ayrıca, Moghal ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma, M9 tamponunda yetişen vulvaless lin-3(n378), let-23(sy1) ve let-60 (sy95dn) mutantlarının standart NG plakalarında yetişen hayvanlara kıyasla vulval hücre kaderlerini varsayarak daha fazla sayıda VPC'ye sahip olduğunu göstermiştir24. Veriler, sıvı bir ortamda yetişen solucanların vulval indüksiyonu etkilediğini göstermektedir. Ancak çalışmalarımızda Muv fenotipinin sıvı ortamda baskılanması gözlemlemedik.
Bu protokolde, fendilin anti-RAS özelliklerini değerlendirmek için C. elegans'ın kullanımını gösteriyoruz. Daha önceki bir çalışmada, desipramin, imipramin ve amitriptilin gibi trisiklik antidepresanlar da dahil olmak üzere birden fazla asit sphingomyelinaz inhibitörünün Muv fenotipini inhibe ettiğini göstermiştik18. Ayrıca, sphingomyelin ve seramid biyokintetik yolların inhibitörleri let-60(n1046) solucanlarında ifade edilen Muv fenotipini bastırır. Solucanı kullanan bu bulgular memeli hücre hatlarında doğrulandı.
Sonuç olarak, sıvı bazlı bir testte EGFR ve RAS aktivitesinin inhibitörlerini tanımlamak için C. elegans'ın kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca, solucan anti-RAS ve EGFR terapötiklerinin etki mekanizmalarını tanımlamak ve karakterize etmek için başka bir sistem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Dr. Swathi Arur'a (MD Anderson Kanser Merkezi) let-60(n1046)sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. David Reiner'a (Houston'daki Texas A&M Sağlık Bilimleri Merkezi Biyobilimler ve Teknoloji Enstitüsü) lin-1 suşu için teşekkür ederiz. Son olarak, Dr. Danielle Garsin'e ve laboratuvarına (Teksas Üniversitesi, McGovern Tıp Fakültesi) bazı reaktifleri sağladıkları için teşekkür ederiz. Bazı solucan suşları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Bu Araştırma, Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü (CPRIT) tarafından JF Hancock'a RP200047 hibesi ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
References
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
