Summary
该协议展示了对香烟烟雾（CS）的病理生理影响的研究，内部内建立了全身吸入（WBI）暴露系统（WBIS）。该系统可以在受控的可重复条件下使动物接触CS，用于研究CS介于肺气肿和血细胞瘤的影响。
Abstract
据报道，2018年美国有近14%的成年人吸烟。香烟烟雾（CS）对肺部和心血管疾病的影响已得到广泛研究，然而，CS对血液和骨髓等其他组织和器官的影响仍然未完全确定。找到适当的系统来研究CS对啮齿动物的影响可能过于昂贵，需要购买市售系统。因此，我们着手构建一个经济实惠、可靠且多功能的系统，以研究CS在小鼠中的病理影响。这种全身吸入暴露系统 （WBIS） 设置通过交替接触 CS 和清洁空气来模拟香烟的呼吸和吹气。在这里，我们表明，这种自己动手（DIY）系统在接触了4个月的香烟烟雾后，在小鼠身上诱发气道炎症和肺气肿。使用这种仪器，CS的全身吸入（WBI）对造血干细胞和骨髓中的祖细胞（HSPCs）的影响也显示出来。
Introduction
吸烟仍然是美国可预防疾病的主要原因之一，尽管在过去50-60年中吸烟的成年人数量持续下降。众所周知，吸烟与肺和血液的多种疾病有关，包括慢性阻塞性肺病（COPD），这是一组疾病，包括肺气肿和慢性支气管炎2、3、4。根据美国疾病控制中心（CDC）的数据，2014年，慢性阻塞性肺病是美国第三大死因，超过1500万美国人患有这种疾病。
CS最近也与患克隆造血症（CH）6、7的较高风险有关，在这种情况下，单个造血干细胞不成比例地产生一个人的外周血液的很大一部分。这一发现表明吸烟和骨髓功能之间有潜在的联系。鉴于CS对健康的广泛和非常重要的影响，鉴于穆林疾病模型是生物医学研究进步的基石，开发高效且经济实惠的系统来模拟小鼠的CS是有益的。
在这里，我们提供一个分步指南，建立一个负担得起的系统，用于治疗和研究CS对肺肺气肿和骨髓平衡的体内影响。此设备的组装不需要用户具有专业知识，因此允许 DIY 组装。
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Protocol
参与实验和开发这项技术的所有动物都根据我们的动物使用协议，由机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 和贝勒医学院和 MD 安德森机构批准，这些机构已获得实验室动物护理评估和认证协会 （AAALAC） 的认证。
1. 建造设备
- 用阀门系统组装空气压缩机。
- 使用 1 / 8 英寸螺纹男性适配器配件将流计（两个 15 L / min 带 Y 条和 2 个电源起飞）连接到微型压力调节器。请确保在所有螺纹端使用螺纹密封胶带。
- 使用以下方式将组装的压力调节器与流计连接到医用空气压缩机仪器：压缩机气口上的 1 / 8 英寸六角、 1 / 8 英寸螺纹耦合配件以及连接到压力调节器的 1 / 8 英寸螺纹男性适配器配件。
- 在每个 （4） 流表上安装氧气旋转带刺接头。
- 在空气压缩机的顶部空气出口上安装男性适配器（部分包含在医用空气压缩机仪器中）。
- 组装曝光室（制作4个单元）
- 将一根 3/4 英寸氯化聚氯乙烯 （CPVC） 管道切成 8 个 4 英寸段。
- 将每个段插入一个 3/4 英寸 90° 肘部 CPVC 配件，并将肘部的配件侧连接到直径为 3/4 英寸的 CPVC 男性适配器上。应有八个 CPVC 段，每个部分连接到一个 CPVC 肘部安装和一个 CPVC 男性适配器。
- 在距离对方最远的 8.5 L 密封容器（11.25 x 7.75 x 6 英寸）上钻两个孔（直径 1 1/4 英寸），盖子（见图 1 曝光室）。孔的定位是从上到下和从左到右。
- 将之前组装的 CPVC 男性适配器的螺纹侧插入容器中的每个孔中。
- 从容器内部，在另一侧（室内烟雾输入）上安装一个 3/4 英寸 CPVC 盖，在一侧附加 3/4 英寸 CPVC 滴灌女性适配器（室烟输出）。
- 在室内烟雾输出的 CPVC 盖顶部以昆昆克斯（淋浴头）模式钻出五个 3 毫米孔。这将使香烟烟雾以更高的速度进入房间，并确保它均匀地分布在室内的所有方向。
- 组装卷烟室（最多4个穆林暴露单位）
- 采取一个单孔橡胶塞（制造商大小8.5），并在较宽的一侧插入一个1/4英寸的带刺Y连接器和一个直刺配件（8毫米开口）在较窄的一侧。香烟将在吸烟过程中（香烟基座）放置在这里。
- 将 12 英寸长医用级乙烯基管的一端连接到连接到橡胶塞的 Y 连接器上的一个带刺连接器，将另一端连接到 1/4 英寸的配件上，并将此配件的对面插入一个单孔橡胶塞子（制造商尺寸 1）。
- 在另一个橡胶塞子（制造商尺寸 8.5），插入一个 1/4 英寸直管连接器在塞子的较宽的一侧，并将配件的外端连接到 7 英尺医用级乙烯基管。
- 将之前组装的两个橡胶塞件结构（步骤 1.3.1–1.3.3）与实验室玻璃排水管中的 8 英寸 x 1.75 英寸玻璃缸连接起来。
- 阀门控制系统
- 该系统由有节奏的电磁阀打开和关闭控制，这些阀门模拟吸入（吹）香烟烟雾和清洁空气。控制电磁阀的系统是商业设计的（见 材料表）。
- 将所有组件组装在一起（见 图 1）
- 使用 1 英寸紧固件将四个电磁阀安装到阀门控制系统的两侧。
- 按照制造商的指示将电磁阀连接到阀门控制系统。
- 将 10+32 （M） 螺纹直接器连接到电磁阀上的排气 （"EXH"） 连接，以及同一电磁阀的"IN"和"OUT"连接上的螺纹端口适配器。
- 使用 7 英尺医用级乙烯基管通过"OUT"连接将连接到压缩机的流计连接到电磁阀。
- 将 7 英尺乙烯基管与第 1.3.3 步的橡胶塞连接起来。在电磁阀上的"IN"连接器上。
- 在烟室烟雾输入上插入卷烟室的小橡胶塞。
- 将电磁阀连接到香烟基座上按步骤 1.3.1 组装的带刺 Y 连接器的第二个连接。
图1：我们WBIS与CS接触的连接示意图。此图演示了所有组件的组装方式，以形成工作装置。该图仅显示机器能够操作的四个烟室中的一个组装吸烟室。 请单击此处查看此图的较大版本。
2. 香烟烟雾暴露
注意：避免二手和三手接触香烟烟雾。香烟和暴露室应在 II 类 B2 层流生物安全柜中使用。在进行烟雾暴露实验时应佩戴适当的PPE（即口罩、手套、发网、礼服）。
-
设置压力和气流
- 一旦所有部件都按照 图 1的显示进行组装，请打开空气压缩机，等待安全警报自行关闭。
- 通过打开压力调节器的旋钮，将空气压缩机的压力调整到 40–50 psi。
- 使用流量计将空气压缩机的气流调整到 5 升。
- 打开阀门控制器。
- 通过按下 SET/LOCK 键，同时按住计时器第一位数字的 UP 键，将阀门控制器上的数字定时器调整为 PULSE-C（显示屏上显示为"Pu-c"）操作模式。然后，按上键，直到达到 Pu-c 模式。按重置键将显示的操作模式（即 Pu-C）设置为工作模式。
- 按下 SET/LOCK 更改定时器 1（显示屏上显示为"T1"）。
- 按上或向下键设置 T1 到 20 s。
- 按下 SET/LOCK 更改定时器 2（显示屏上显示为"T2"）。
- 按上或向下键设置T2到3 s。
注：步骤 2.1.5 到 2.1.9 是定制用于特定定时器（参见 材料表）。有关本产品其他用途的进一步说明，请参阅其相应的用户手册。
-
香烟烟雾处理
注意：该系统允许同时使用1–4个穆林暴露室。- 打开空气压缩机，等待安全警报自行关闭。
- 打开阀门控制器。
- 将 5 只小鼠转移到四个暴露室中，每个暴露室配有气密可拆卸盖，体积为 8.5 L。 将四个暴露室与小鼠放在 II 类 B2 层层流生物安全柜内。
- 在层流生物安全柜内，点亮香烟，将香烟插入卷烟室内。使用市售香烟，其中含有15毫克/烟焦油和1.1毫克/西格尼古丁8相比，肯塔基州3RF4研究香烟（9.5毫克/西格焦油和0.73毫克/西格尼古丁）9。
- 打开与当前使用的机舱对应的阀门控制器上的阀门。暴露分为两个阶段：（T1）清洁空气被泵入暴露室20s和（T2）气流导致香烟燃烧，从烟室抽到暴露室的烟雾3s。让香烟完全烧坏，直到它到达过滤器。
- 调整定时器设置，在~4分钟的时间内平均执行约10次泡芙/香烟。请注意，定时器和系统很容易根据调查人员的研究需要定制，用于增强或降低CS给注方案。
- 取下香烟过滤器，将烟头放入玻璃烧杯中，用水灭火并抑制气味。
- 确保烟室再次关闭，无需香烟。让机器泵清洁空气10分钟。保持对接触CS的脊椎动物的持续监测至关重要。这种暴露方案针对每个暴露室中9周以上的5只雌性小鼠进行了优化。
- 重复步骤 2.3.4 到 2.3.7 三次，每天总共 4 支香烟。只要研究人员需要进行实验，这个程序每周重复5天。
- 将小鼠从暴露室中取出，带回相应的笼子里。
- 关闭阀门控制器和空气压缩机。
- 取出暴露和烟室，用水和肥皂清洗，以去除焦油残留物。
- 让房间完全干燥，然后再使用它们。
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Representative Results
CS 暴露的主要特征之一是肺气肿，其特征是肺部气囊 （肺囊） 的损伤和破坏。因此，最初的实验侧重于DIY系统在反复接触CS后引起雌性小鼠肺部的肺部变化的能力。CS配药方案是根据我们先前的出版物选择的，我们利用此处描述的DIY系统用CS治疗小鼠，并研究肺气肿10、11、12、13、14、15、16的分子病理生理学。具体来说，老鼠每天接触四支带有过滤器的商业香烟的烟雾，每支香烟之间无烟间隔为10分钟，每周5天，持续4个月，持续4个月，10、11、12、13、14、15、16。
血氧林和黄素（H&E）染色的肺组织学显示，与空气处理小鼠（图2A）相比，暴露在CS的小鼠体内的肺泡受到破坏。与空气控制（图2B）相比，以致盲方式对肺部部分的测定分析表明，暴露在CS下的小鼠的平均线性截断（MLI）显著高于空气控制（图2B）。不出所料，WBIS到CS会引发体重下降（图2C）。与上述观察结果一致，CS暴露的小鼠还显示出免疫细胞的气道渗透增强，以及矩阵金属蛋白酶9和12（Mmp9和Mmp12）基因表达的诱导，这些基因表达是组织损伤（图2D，E）17。可替宁是尼古丁的代谢物，也是CS暴露的生物标志物，在接触4个月CS的小鼠血清中被检测出显著升高，但在暴露在空气中的小鼠中检测不到（图2F）。
人们越来越认识到CS暴露对人体细胞和组织的多方面影响。先前的研究表明，WBI将小鼠暴露在CS中，其疗程为6小时/天，每周5天，使用3R4F香烟9个月，导致造血干细胞利基18发生改变。因此，我们测试了这个DIY系统的能力，改变骨髓平衡使用我们预先建立的CS服剂方案10，11，12，13，14，15，16。接触后，我们使用流动细胞测量（图3A）分析BM种群。根据预期，在这个DIY系统上使用CS的小鼠的治疗导致骨髓（BM）种群的改变。具体来说，流量细胞学分析显示，与空气控制（图3B）相比，在4个月的CS暴露后，造血干细胞和祖细胞（HSPC）种群显著增加。扩展这些观测结果后，利用市售系统（见材料表）对小鼠CS的全身暴露也显示出HSPC种群（图3C）的变化。商业系统中使用的CS暴露的施用方案和持续时间，以及先前在CS和造血18上出版的药物，与这个DIY系统大不相同，表明骨髓平衡对广泛的CS给药和治疗方案（图3C）非常敏感。总的来说，这些数据突出表明，这个DIY系统是一个负担得起的选择，可用于在受控条件下使小鼠接触CS，以可靠地研究其在一系列细胞和组织中的影响。
图2：CS介导诱导小鼠气道炎症和肺气肿变化。（A） WT C57BL/6 小鼠的H&E染色肺部位暴露在空气或CS中4个月。4倍放大：插集20倍放大倍数。比例杆 200 μM。（B） 平均线性截击 （MLI） 作为测量间分隔壁距离的指标，使用空气或 CS 治疗的小鼠的无偏见成形术测量。（D） 从支气管韦拉夫拉（BAL）控制液（空气）与CS治疗小鼠的总和差分细胞计数。白细胞总数（总）、巨噬细胞（Mac）、嗜中性粒细胞（神经）和淋巴细胞（莱姆）。（E ） Mmp9和 （F） Mmp12 mRNA 的相对表达由空气或 CS 的 BAL 液体实时 PCR 量化，并正常化为Gapdh表达。n = 4+5 小鼠/组。（G） 在上次CS治疗后，ELISA 24 h测量了暴露于空气或CS的小鼠的血清水平：n = 7×8 小鼠/组。统计比较使用（B，C，D，E）未修复的 t 测试和（F）韦尔奇的t测试进行。数据显示，平均±SEM.**p <0.01，**p <0.001，***p <0.0001。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：符合预期，这个DIY系统可用于研究CS介质对小鼠骨髓的影响。（A） 通过流动细胞学识别 HSPC 和 HSC 的加丁策略。血统标记包括：Gr1、Mac1、B220、CD4、CD8和Ter119。（B） 使用这种DIY系统使用相同的4个月疗制，在CS暴露后，整个骨髓中的HSPC和HSC百分比。（C） 使用以下暴露程序的市售系统接触后，整个骨髓中的 HSPC 和 HSC 百分比：每天 24 支 3RF4 研究香烟，12 支泡芙/香烟，每周 5 天，持续 4.5 周。（B–C）曼-惠特尼测试;n = 5 只鼠标/组。数据显示为平均± SEM. *p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们提供构建小鼠WBIS到CS的仪器所需的信息。系统安装后，调查人员根据动物中尼古丁或可替宁的交付剂量校准系统至关重要。该仪器包含一个定时器和压力计，可用于调节香烟泡芙量、泡芙频率、合并烟雾暴露期以及动物在每支香烟之间获得的休息间隔。此外，每天服用的香烟的实际数量可能因焦油和尼古丁含量而异。最后，必须定期清洁接触香烟烟雾的任何成分，以确保动物的烟雾循环正常和持续的烟雾暴露。
至少有六种商业系统和协议可用于治疗患有CS和空气毒性剂的小鼠。然而，用于此目的的大多数设备需要商业供应商或深入了解电子和/或电气工程以进行组装。其中一些系统采用WBI方案，而另一些系统则采用只使用鼻子的治疗方法，但这些系统的成本可能高达10万美元，因此对大多数实验室来说，成本高得令人望而却步。
这种DIY系统的优点是制造固有的简单性、低成本（约6，000美元）和多功能性。此外，商业零售商和供应链也随时提供建造这种DIY设备所需的组件。我们承认暴露协议和设备的限制是缺乏测量输送到老鼠暴露室的香烟烟雾成分的量度设备。然而，该系统的设计工作在一个可控的方式，我们表明，血清可替宁的水平，在这个选择的吸烟方案是可比的其他穆林模型CS引起的肺气肿20，21。此外，该方法已被证明具有超越监测CS在肺部和BM的影响的应用。我们的小组利用这个系统来研究香烟烟雾如何影响肠道组织15。我们最近亦已调整这个系统，以研究接触电子香烟对肺部的有害影响。
总之，这种装置代表着一个负担得起的、易于构建的暴露系统，用来研究吸烟的有害影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
AR、XH和PE得到了NIH赠款R01HL140398和吉尔森·朗根博基金会赠款的支持。DEMM 和 KK 得到了 NIH 赠款 R01HL136333 和 R01HL134880 （KYK） 以及赫利斯医学研究基金会的赠款的支持。DEMM还得到霍华德·休斯医学研究所（HHMI）吉利亚姆高级研究奖学金的支持。PE 还得到精密环境卫生科学培训 NIEHS T32 ES027801 研究金计划的支持。JC 和 MF 由表观遗传学和分子致癌学系的烟草研究基金以及 MD Anderson 的表观遗传学中心（学者奖 MF）提供支持。FK 和 YZ 由 NIH 赠款 R01 ES029442-01 和 R01 AI135803-01 以及 VA 功绩赠款 CX000104 提供支持。该项目得到了贝勒医学院细胞测量和细胞分类核心的支持，并得到了CPRIT核心设施支持奖（CPRIT-RP180672）、NIH（CA125123和RR024574）和乔尔·塞德斯特伦的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 in fastener | Lowes | 756990 | |
| 1/4 in Barbed Y connector | VWR | 89093-282 | |
| 1/4 in straight tubing connector | VWR | 62866-378 | |
| 1/8 hex nipple | Lowes | 877221 | |
| 1/8 in threaded coupling fitting | Lowes | 877208 | |
| 1/8 in threaded male adapter nipple fitting | Lowes | 877243 | |
| 10/32 (M) threaded straight connector | Bimba | EB60 | |
| 3/4 in 90-degree elbow CPVC fitting | Lowes | 22643 | |
| 3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipe | Lowes | 23814 | |
| 3/4 in CPVC cap | Lowes | 23773 | |
| 3/4 in CPVC Drip irrigation female adapter | Lowes | 194629 | |
| 3/4 in diameter CPVC male adapter | Lowes | 23766 | |
| 8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in) | Komax | N/A | Listed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container" |
| Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length) | KIMAX | 6500 | |
| Isonic Solenoid Valves | Bimba | V2A02-AW1 | |
| Marlboro Red 100's | Marlboro | N/A | |
| Oxygen swivel barbed connector | Global Medical Solutions | RES002 | |
| Panasonic Timer LT4H-W | Panasonic | LT4HW | Item was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates |
| Pressure regulator | Allied Electronics and Automation | 70600552 | Also listed as "Norgren R07-100-RGKA" |
| Rubber stopper # 1 (one hole) | VWR | 59581-163 | |
| Rubber stopper # 8.5 (one hole) | VWR | 59581-389 | |
| Scireq inExpose system | Scireq and Emka Technologies | N/A | Commercial system used for comparison with our DIY WBIS |
| Straight barbed fitting (8mm opening) | VWR | 10028-872 | |
| Thread Sealant tape | Lowes | 1184243 | |
| Threaded port adaptor | Bimba | P1SA1 | |
| Timeter Aridyne 2000 Medical Air Compressor | MFI Medical | AHC-TE20 | |
| Timeter flowmeter | Allied Healthcare Products | 15006-03YP2 | Also listed as "Puritan Air Meter" |
| Valve Control system | Shepherd Controls and Associates | N/A | Company custom designed the valve control system for this model. |
| Vinyl pipes | Vitality Medical | RES3007 |
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