Denne protokol beskriver transilluminationsassisteret mikrodissection af segmenter af voksne mus seminiferous tubules, der repræsenterer specifikke stadier af seminiferous epitelcyklus, og celletyper deri, og efterfølgende immunfarvning af squashpræparater og intakte tubule segmenter.
Spermatogenese er en unik differentieringsproces, der i sidste ende giver anledning til en af de mest forskellige celletyper i kroppen, sæden. Differentiering af kimceller finder sted i de cytoplasmiske lommer af somatiske Sertoli-celler, der er vært for 4 til 5 generationer af kimceller samtidigt og koordinerer og synkroniserer deres udvikling. Derfor er sammensætningen af kimcelletyper i et tværsnit konstant, og disse celleforeninger er også kendt som stadier (I-XII) af den seminiferøse epitelcyklus. Det er vigtigt, at stadier også kan identificeres fra intakte seminiferous tubules baseret på deres differentiale lysabsorption / scatter-egenskaber afsløret ved transillumination, og det faktum, at stadierne følger hinanden langs tubule i numerisk rækkefølge. I denne artikel beskrives en transilluminationsassisteret mikrodissectionmetode til isolering af seminiferøse tubulesegmenter, der repræsenterer specifikke stadier af musens seminiferøse epitelcyklus. Lysabsorptionsmønsteret for seminiferøse rør inspiceres først under et dissektionsmikroskop, og derefter skæres tubulesegmenter, der repræsenterer specifikke stadier, og anvendes til downstream-applikationer. Her beskriver vi immunostaining protokoller for fase-specifikke squash præparater og for intakt tubule segmenter. Denne metode gør det muligt for en forsker at fokusere på biologiske begivenheder, der finder sted i bestemte faser af spermatogenese, hvilket giver et unikt værktøj til udviklingsmæssige, toksikologiske og cytologiske undersøgelser af spermatogenese og underliggende molekylære mekanismer.
Differentiering af mandlige kønsceller fra diploid spermatogonia til moden haploid spermatozoa, dvs.spermatogenese, er en kompleks proces, der finder sted i epitelet af seminiferous tubules i testiklerne på et seksuelt modent individ1. Mitotiske efterkommere af A1 spermatogonia deler sig først fem gange for at udvide den differentierings-engagerede befolkning og derefter indtaste meiose som spermatocytter, der i sidste ende giver anledning til haploid spermatids. Differentiering af runde spermatids i spermatozoer, dvs.spermiogenese, indebærer komplekse ændringer i cellulær morfologi, herunder nuklear komprimering og konstruktion af sædspecifikke strukturer som acrosome og flagellum. I mus tager hele processen med spermatogenese 35 dage at gennemføre2,3.
Ved en given lokalitet er det seminiferøse epitel vært for op til fem kohorter af differentierende kimceller plus kønscellerne og de somatiske Sertoli-celler1. Differentiering af kimceller danner koncentriske lag, hvis sammensætning er forudsigelig, og haploide celler på et givet udviklingstrin forbinder altid med visse typer spermatocytter og spermatogonia4,5. Derfor er ethvert tværsnit af en tubule vært for kohorter af kimceller med en konstant sammensætning. Disse specifikke celleforeninger defineres som stadierne i det seminiferøse epitel. Faser i sig selv ikke præsenterer stagnerende check-point-lignende stater , men løbende udvikle sig som differentieringen af kimcelle kohorter skrider frem i synkronisering1,2,6. Hos mus er der 12 faser (I-XII)2, der er arrangeret på en segmental måde langs den seminiferøse tubules langs langsgående akse, og de følger hinanden i en logisk rækkefølge og danner således bølgen af seminiferous epitel eller spermatogenisk bølge7,8,9 ( Figur1). Færdiggørelsen af spermatogenese tager fire cyklusser, og hierarkiske lag eller kohorter af differentierende kimceller i enhver seminiferous tubule tværsnit er tidsmæssigt en seminiferous cyklus bortset fra hinanden. Længden af cyklussen er artsafhængig, og i musen tager hver cyklus 8,6 dage10.
Stadierne kan identificeres på grundlag af den cellulære sammensætning og tilrettelæggelse af det seminiferøse epitel på histologiske testis afsnit5 (Figur 1 og figur 2). Men histologiske analyser er besværlige, tidskrævende og kræver fastsættelse og farvning, og kan derfor ikke anvendes til levende væv. Det er vigtigt, at iscenesættelse også kan udføres på levende væv under et dissektionsmikroskop ved at drage fordel af tydelige lysabsorptions-/scattermønstre, der er udstillet af forskellige stadier af cyklussen (Figur 2). Hver fases evne til at absorbere og sprede lys er i forhold til niveauet for kromatinkondensation af sene postmeiotiske spermatids, som en given faseværter og pakningen af disse celler i bundter7,11. Spermatid differentiering, dvsspermiogenese, er yderligere opdelt i 16 udviklingsmæssige trin, herunder 8 trin af runde spermatid (trin 1-8) og 8 trin af aflange spermatid (trin 9-16) differentiering(Figur 1). Trin 9-11 aflange spermatids (fase IX-XI) viser kun et lavt niveau af kromatin kondens resulterer i lav mængde lys, der absorberes. Kromatinkondensation begynder i trin 11 spermatids (fase XI), og trin 15-16 aflange spermatids (fase IV-VIII) indeholder fuldt kondenseret kromatin og udviser derfor maksimal lysabsorption (Figur 3). Chromatin skal kondenseres for at være tæt pakket ind i sædhovedet. Yderligere faktorer, der bidrager til lysabsorptionsmønsteret, er placeringen af aflange spermatids i epitel (basal vs. apical) og bundling af aflange spermatids (udtales i fase II-V)11 (Figur 3). Bundter ses som pletter i midten af tubules og som striber på kanterne under en dissektion mikroskop og jo mere kondenseret kromatin, jo mørkere stedet / stribe11.
I denne artikel beskrives anvendelsen af transilluminationsassisteret mikrodissectionmetode til isolering af seminiferøse tubulesegmenter, der repræsenterer specifikke stadier af den seminiferøse epitelcyklus. Når segmenterne for faseinddelt tubule er isoleret , kan de underkastes forskellige downstream-analyser, herunder biokemiske RNA- og proteinanalyser12,13,14,15, flowcytometri16, ex vivo tubulekultur17 og immunostaining18. Her leverer vi også detaljerede downstream-protokoller til at forberede squashed monolayers af iscenesatte tubule segmenter for levende celle morfologiske analyse og efterfølgende immunostaining, samt hele montere immunostainings af tubule segmenter. Arbejdsprocessen i en nøddeskal, der er beskrevet i figur 4.
Den transillumination-assisteret microdissection metode giver mulighed for nøjagtig identifikation og isolering af kimceller på bestemte trin af differentiering takket være den synkroniserede cellulære sammensætning af faserne. Det er vigtigt, at det også gør det muligt at studere faseafhængige hændelser under spermatogenese på levende væv. I betragtning af manglen på skalerbare in vitro-modeller til spermatogenese har denne metode også en unik fordel ved at tillade målrettede kortsigtede udviklingsmæssige og toksikologiske undersøgelser af scenespecifikke tubulesegmenter ex vivo12,17. Mens vi beskriver metoden her for musen, kan den samme procedure anvendes på alle pattedyrarter med langsgående og segmentisk arrangement af seminiferøse epitelstadier, såsom rotten4,7,15,19,20.
Den transilluminationsassisterede mikrodissection-metode, som vi har beskrevet ovenfor, muliggør en faseorienteret tilgang til studiet af spermatogenese. Spermatogenese er en stærkt synkroniseret proces, og alle vigtige trin under spermatogen differentiering reguleres og udføres på en faseafhængig måde, såsom differentieringsforpligtelse (i fase VII-VIII), starten af meiose (VII-VIII), meiotiske divisioner (XII), debut af spermatid-forlængelse (VIII) og sædafledning (VIII)1,26,27. Den faseorienterede analyse giver et effektivt værktøj til at studere disse særlige begivenheder, der er begrænset til specifikke trin af spermatogenese og derfor kun findes på definerede stadier af den seminiferøse epitelcyklus. Mastering metoden tager nogle praksis og brug af en god kvalitet dissektion mikroskop og ordentlige lysende forhold er nøglen til succes. Implementering af denne metode som en del af den daglige værktøjskasse har en kapacitet til i høj grad at forbedre virkningen og den biologiske relevans af forskning i mandlige reproduktive funktioner ved at tillade mere præcis dissektion af molekylære hændelser under spermatogenese.
Alle WT-musestammer, som vi har studeret, viser et lignende transilluminationsmønster og udviser bevarede celleforeninger på stadier af den seminiferøse epitelcyklus. På betingelse af, at spermiogen differentiering af kimceller ikke er groft forskellig fra WT-mus, gælder det samme også for alle de knock-out musemodeller, som vi har studeret. Desuden kan det anvendes på andre arter, der udviser langsgående segmentarrangement af stadier af den seminiferøse epitelcyklus7. Arter med ikke-segmentale stadier (f.eks. mennesker) kan dog ikke anvendes. I betragtning af den væsentlige rolle, som kromatinkondensation spiller i aflange spermatids i definitionen af transilluminationsmønsteret, er det klart, at enhver forkert regulering af denne proces uundgåeligt vil påvirke gennemførelsen af denne metode. Hos unge mus og unge voksne (5-6 uger) er transilluminationsmønsteret endnu ikke fuldt etableret, og derfor bør der kun anvendes mus, der er ældre end 8 uger. Det er også vigtigt at huske på, at klemme og trække tubules uundgåeligt vil gribe ind i transillumination mønster, fordi det fordrejer den cellulære arkitektur inden for seminiferous epitel.
De isolerede seminiferous tubule segmenter kan også dyrkes muliggør ex vivo observation og manipulation af spermatogenesis-koblede processer, herunder meiose. For at sikre vævets levedygtighed og forhindre RNA- og proteinforringelse skal prøverne indsamles og behandles senest 2 timer efter, at musen er gået på kompromis. For ex vivo kultur af seminiferous tubules, bør tiden fra offer til debut af kultur ikke overstige 1 time. Integriteten af tubulefragmenter kan typisk opretholdes op til 72 timer in vitro, hvis de høstes korrekt.
Fasen af den seminiferøse epitelcyklus kan verificeres og defineres endnu mere præcist ved hjælp af fasekontrastmikroskopi af squashpræparater16. Mikroskopi udføres på levende celler, som giver en ekstra dimension i analysen og tillader observation af organelle eller cellebevægelser i specifikke stadier af spermatogenese28,29,30. Fasekontrastmikroskopi giver nøjagtig iscenesættelse til efterfølgende immunostaining, hvilket muliggør meget detaljeret analyse af proteinudtryk og lokaliseringsdynamik under spermatogenese, herunder fasespecifikke ændringer.
Mens celler frigives fra epitelkonteksten i squashpræparater, gør fuldmonteringsimfreimationer af tubulesegmenter det muligt at studere spermatogene celler i deres fysiologiske miljø. Derfor kan hele monteringspræparater give en bedre visualisering af seminiferous tubule arkitektur og dens intercellulære kontakter end immunostaining på tværsnit. Det er vigtigt, at transillumination-assisteret iscenesættelse af tubulesegmenterne forud for immunostaining gør tilgangen endnu mere kraftfuld ved at inkludere oplysninger om den specifikke fase af et givet segment. Helmonteringsfarvning er et særligt nyttigt værktøj til undersøgelse af celler i periferien af seminiferøse tubules, såsom peritubulære myoidceller, peritubulære makrofager og spermatogonia, men kan også åbne ny indsigt i forskning i meiotiske og postmeiotiske kimceller.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af stipendier fra Finlands Akademi [315948, 314387 til N.K.]; Sigrid Jusélius Fonden [til N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [til J.-A.M., T.L.]; Turku Ph.d.-program for molekylær medicin [S.C.-M., O.O.].
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
cover glass 20×20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |