Detta protokoll beskriver transillumination-assisted microdissection av segment av vuxna mus seminiferous tubules representerar specifika stadier av seminiferous epitelial cykel och cell typer däri, och efterföljande immunostaining av squash preparat och intakt tubule segment.
Spermatogenesis är en unik differentieringsprocess som i slutändan ger upphov till en av de mest distinkta celltyperna i kroppen, spermierna. Differentiering av könsceller sker i de cytoplasmiska fickorna i somatiska Sertoli-celler som är värd för 4 till 5 generationer av könsceller samtidigt och samordnar och synkroniserar deras utveckling. Därför är sammansättningen av könscellstyper inom ett tvärsnitt konstant, och dessa cellassociationer är också kända som stadier (I-XII) i den seminifera epitelcykeln. Viktigt är att steg också kan identifieras från intakta seminiferous tubules baserat på deras differentiella ljus absorption/scatter egenskaper som avslöjas av transillumination, och det faktum att stadierna följer varandra längs tubule i en numerisk ordning. Denna artikel beskriver en transillumination-assisted microdissection metod för isolering av seminiferous tubule segment som representerar specifika stadier av mus seminiferous epitelial cykel. Ljusabsorptionsmönstret för seminiferous tubules inspekteras först under ett dissekeringsmikroskop, och sedan skärs tubulesegment som representerar specifika steg och används för nedströmsapplikationer. Här beskriver vi immunostaining protokoll för stegspecifika squash preparat och för intakta tubule segment. Denna metod gör det möjligt för en forskare att fokusera på biologiska händelser som äger rum i specifika faser av spermatogenes, vilket ger ett unikt verktyg för utvecklingsmässiga, toxikologiska och cytologiska studier av spermatogenes och underliggande molekylära mekanismer.
Differentiering av manliga könsceller från diploid spermatogonia till mogna haploid spermatozoa, dvs,spermatogenesis, är en komplex process som äger rum i epitel av seminiferous tubules i testikel av en sexuellt mogen individ1. Mitotiska ättlingar till A1 spermatogonia delar först fem gånger för att expandera den differentieringsbefäst populationen och ange sedan meios som spermatocyter som i slutändan ger upphov till haploid spermatider. Differentiering av runda spermatider till spermatozoa, dvs.spermiogenesis, innebär komplexa förändringar i cellulär morfologi, inklusive nukleär komprimering och konstruktion av spermiespecifika strukturer som acrosome och flagellum. I musen tar hela processen med spermatogenes 35 dagar att slutföra2,3.
På en given plats är det seminiferous epitel värd upp till fem kohorter av differentierande könsceller plus könsstammen /stamcellerna och de somatiska Sertoli cellerna1. Differentierande könsceller bildar koncentriska lager vars sammansättning är förutsägbar, och haploida celler i ett givet utvecklingssteg associerar alltid med vissa typer av spermatocyter och spermatogonia4,5. Därför är alla tvärsnitt av en tubule värdkohorter av könsceller med en konstant komposition. Dessa specifika cellassociationer definieras som stadierna i det seminifera epitelet. Steg i sig presenterar inte stillastående kontrollpunktsliknande tillstånd utan utvecklas kontinuerligt när differentiering av bakteriecellkohorter fortskrider i synkron1,2,6. Hos möss finns det 12 steg (I-XII)2 som är ordnade på ett segmentalt sätt längs den längsgående axeln i den seminifera tubuleen, och de följer varandra i en logisk ordning och bildar därmed vågen av seminiferous epitel, eller spermatogenic wave7,8,9 ( Figur1). Slutförandet av spermatogenesis tar fyra cykler, och hierarkiska skikt eller kohorter av differentierande könsceller inom någon seminiferous tubule tvärsnitt är temporalt en seminiferous cykel bortsett från varandra. Cykelns längd är artberoende och i musen tar varje cykel 8,6 dagar10.
Stadierna kan identifieras på grundval av den cellulära sammansättningen och organisationen av det seminifera epitelet på histologiska testisavsnitt5 (figur 1 och figur 2). Histologisk analys är dock mödosam, tidskrävande och kräver fixering och färgning, och kan därför inte tillämpas på levande vävnad. Viktigt är att iscensättning också kan utföras på levande vävnad under ett dissekeringsmikroskop genom att dra nytta av distinkta ljusabsorptions-/spridningsmönster som uppvisas av olika stadier av cykeln (figur 2). Varje stegs förmåga att absorbera och sprida ljus är i förhållande till kromatinkondensen hos sena postmetiotiska spermatider som varje givet stadium är värd och förpackningen av dessa celler ibuntar 7,11. Spermatid differentiering, dvs.spermiogenesis, är ytterligare uppdelad i 16 utvecklingssteg, inklusive 8 steg av rund spermatid (steg 1-8) och 8 steg av långsträckt spermatid (steg 9-16) differentiering (Figur 1). Steg 9-11 långsträckta spermatider (steg IX-XI) visar endast en låg nivå av kromatinkondens som resulterar i att låg mängd ljus absorberas. Kromatinkondensation börjar i steg 11 spermatider (steg XI) och steg 15-16 långsträckta spermatider (steg IV-VIII) innehåller helt kondenserad kromatin och uppvisar därför maximal ljusabsorption (figur 3). Kromatin måste kondenseras för att tätt packas i spermiehuvudet. Ytterligare faktorer som bidrar till ljusabsorptionsmönstret är placeringen av långsträckta spermatider i epitel (basal kontra apical) och buntning av långsträckta spermatider (uttalade i steg II-V)11 (Figur 3). Buntar ses som fläckar i mitten av tubulerna och som ränder på kanterna under ett dissekeringsmikroskop och desto mer kondenserad kromatin, desto mörkare spot / rand11.
Denna artikel beskriver användningen av transillumination-assisted microdissection metod för isolering av seminiferous tubule segment som representerar specifika stadier av seminiferous epitelial cykeln. När de har isolerats kan iscensatta tubulesegment bli föremål för olika nedströmsanalyser, inklusive biokemiska RNA- ochproteinanalyser 12,13,14,15, flödescytometri16, ex vivo-tubulekultur 17 och immunostaining18. Här tillhandahåller vi också detaljerade nedströms protokoll för att förbereda squashed monolayers av iscensatta tubule segment för levande cell morfologisk analys och efterföljande immunostaining, liksom hela mount immunostainings av tubule segment. Arbetsflödet i ett nötskal som beskrivs i figur 4.
Den transilluminationsassisterade mikrodissektionsmetoden möjliggör noggrann identifiering och isolering av könsceller vid specifika differentieringssteg tack vare den synkroniserade cellulära sammansättningen av stadierna. Viktigt är också att det möjliggör studier av scenberoende händelser under spermatogenes på levande vävnad. Med tanke på bristen på skalbara in vitro-modeller för spermatogenes har denna metod också en unik fördel med att tillåta riktade kortsiktiga utvecklingsstudier och toxikologiska studier på scenspecifika tubulesegment ex vivo12,17. Medan vi beskriver metoden här för musen, kan samma förfarande tillämpas på alla däggdjursarter med längsgående och segmental arrangemang av seminifera epitelstadier, såsom råtta4,7,15,19,20.
Den transilluminationsassisterade mikrodissektionsmetoden som vi har beskrivit ovan möjliggör ett stegorienterat tillvägagångssätt för studier av spermatogenes. Spermatogenesis är en mycket synkroniserad process, och alla viktiga steg under spermatogenic differentiering regleras och utförs på ett stegberoende sätt, såsom differentiering engagemang (i steg VII-VIII), uppkomsten av meios (VII-VIII), meiotiska uppdelningar (XII), uppkomsten av spermatid förlängning (VIII) och spermiation (VIII)1,26,27. Den stegorienterade analysen ger ett kraftfullt verktyg för att studera dessa särskilda händelser som är begränsade till specifika steg av spermatogenes och därför endast finns i definierade stadier av den seminiferous epitelial cykeln. Att behärska metoden kräver viss övning och användning av ett dissekeringsmikroskop av god kvalitet och korrekta lysande förhållanden är nyckeln till framgång. Att implementera denna metod som en del av den dagliga verktygslådan har en förmåga att avsevärt förbättra forskningens inverkan och biologiska relevans på manliga reproduktiva funktioner genom att möjliggöra mer exakt dissekering av molekylära händelser under spermatogenes.
Alla WT-musstammar som vi har studerat visar ett liknande transillumination mönster och uppvisar bevarade cell associationer i stadier av seminiferous epitelial cykeln. Under förutsättning att spermiogen differentiering av könsceller inte skiljer sig grovt från WT-möss gäller detsamma för alla knockout-musmodeller som vi har studerat. Dessutom kan det appliceras på andra arter som uppvisar längsgående segmentarrangemang av stadier i den seminifera epitelcykeln7. Arter med icke-segmentala stadier (t.ex. mänskliga) kan dock inte användas. Med tanke på kromatinkondensens viktiga roll vid förlängning av spermatider vid definitionen av transilluminationsmönstret är det uppenbart att varje felreglering av denna process oundvikligen kommer att ingrep på genomförandet av denna metod. Hos unga möss och unga vuxna (5-6 veckor) har transilluminationsmönstret ännu inte fastställts fullt ut, och därför bör endast möss äldre än 8 veckor användas. Det är också viktigt att komma ihåg att klämma och dra tubules oundvikligen kommer att inkrossa på transillumination mönstret eftersom det förvränger cellulära arkitekturen inom seminiferous epitel.
De isolerade seminiferous tubule segmenten kan också odlas möjliggör ex vivo observation och manipulation av spermatogenesis-kopplade processer, inklusive meios. För att säkerställa vävnadens livskraft och förhindra RNA och proteinnedbrytning bör proverna samlas in och bearbetas senast 2 timmar efter att musen offrats. För ex vivo-kultur av seminiferous tubules bör tiden från offer till början av kulturen inte överstiga 1 timme. Tubulefragmentens integritet kan vanligtvis bibehållas upp till 72 timmar in vitro om de skördas korrekt.
Scenen i den seminiferous epitelial cykeln kan verifieras och ännu mer exakt definieras med hjälp av fas-kontrast mikroskopi av squash preparat16. Mikroskopi utförs på levande celler, vilket ger en ytterligare dimension i analysen och möjliggör observation av organell- eller cellrörelser i specifika stadier av spermatogenes28,29,30. Faskontrastmikroskopi ger exakt iscensättning för efterföljande immunostaining, vilket möjliggör mycket detaljerad analys av proteinuttryck och lokaliseringsdynamik under spermatogenes, inklusive stegspecifika förändringar.
Medan celler frigörs från epitelsammanhanget i squashpreparat, möjliggör helmonterade immunostainings av tubulesegment studier av spermatogena celler i deras fysiologiska miljö. Därför kan helmonterade preparat ge en bättre visualisering av seminiferous tubule arkitektur och dess intercellulära kontakter än immunostaining på tvärsnitt. Viktigt är att transilluminationsassisterad iscensättning av tubulesegmenten före immunostaining gör tillvägagångssättet ännu kraftfullare genom att inkludera information om det specifika stadiet i ett visst segment. Helmonterad färgning är ett särskilt användbart verktyg för studier av celler i periferin av seminiferous tubules, såsom peritubulära myoidceller, peritubulära makrofager och spermatogonia, men kan också öppna nya insikter i forskning om meiotiska och postmetiotiska könsceller.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Finlands Akademi [315948, 314387 till N.K.]; Sigrid Jusélius Stiftelse [till N.K., J.T.]; Emil Aaltonens stiftelse [till J.-A.M., T.L.]; Åbo forskarutbildning i molekylär medicin [S.C.-M., O.O.].
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
cover glass 20×20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |