Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

زراعة بشرة بشرية ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها على نطاق واسع

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61802
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3,4, 1, 2
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg, 2Dow Silicones Belgium SRL, 3Department of Biomedical and Specialist Surgical Sciences, University of Ferrara, 4Department of Animal Sciences, Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة مباشرة لزراعة البشرة البشرية ثلاثية الأبعاد المعاد تشكيلها بطريقة قابلة للاستنساخ وقوية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يميز العلاقة بين هيكل وظيفة من نموذج حاجز البشرة. كما يتم تقديم الاستجابات البيولوجية للبشر المعاد تشكيلها على المحفزات النهمة.

Abstract

يتم تقديم نموذج البشرة البشري ثلاثي الأبعاد المعاد بناؤه من خلايا القرنية الأولية الوليدية. وفي هذا الهنا، وصف بروتوكول لعملية الزراعة وتوصيف النموذج. تزرع الخلايا الكيراتينية الأولية الوليدية مغمورة على إدراجات البولي نفاذية ورفعها إلى واجهة الهواء السائل بعد ثلاثة أيام من البذر. بعد أربعة عشر يوما من التحفيز مع عوامل النمو المحددة وحمض الأسكوربيك في المتوسطة ثقافة الكالسيوم عالية, يتم تمييز النموذج تماما. كشف التحليل النسيجي عن بشرة طبقية بالكامل ، تحاكي مورفولوجيا الجلد البشري الأصلي. لتوصيف النموذج ووظائف حاجزه، تم تقييم مستويات البروتين وتوطين محددة لتمايز الكيراتينوسيت في المراحل المبكرة (أي الكيراتين 10)، والتمايز في المراحل المتأخرة (أي الإنفولوكورين واللوريكرين والفيلاغرين) والالتصاق بالأنسجة (أي desmoglein 1)، عن طريق الفلورة المناعية. تم تقييم سلامة حاجز الأنسجة بشكل أكبر من خلال قياس المقاومة الكهربائية عبر الإبط. كان البشرةالبشرية المهيكلة بيئيا مستجيبا للمحفزات البروينفلامية (أي شحم الدهون وعنصر نخر الورم ألفا)، مما أدى إلى زيادة إطلاق السيتوكين (أي إنترلوكين 1 ألفا وإنترلوكين 8). يمثل هذا البروتوكول طريقة مباشرة وقابلة للاستنساخ في المختبر لزراعة البشرة البشرية المعاد بناؤها كأداة لتقييم الآثار البيئية ومجموعة واسعة من الدراسات المتعلقة بالبشرة.

Introduction

البشرة هي الطبقة الخارجية من الجلد ، في الواجهة المباشرة بين جسم الإنسان والبيئة الخارجية. وظائفها الرئيسية هي توفير الحماية والترطيب1. البشرة بمثابة حاجز مادي فعال ضد عوامل خارجية ويمنع فقدان المياه المفرط من الجسم. تعتمد وظائف الجلد هذه بشكل رئيسي على الترتيب الخلوي في الطبقات الخارجية من الجلد ، وتكوين وتنظيم الدهون بين الخلايا2. تتكون البشرة في المقام الأول من الخلايا القرنية التي تهاجر صعودا إلى الجانب الخارجي من الأنسجة وتخضع للتمايز. هناك 4-5 طبقات البشرة التي تتميز مرحلة التمايز. من الداخل إلى الخارج ، تبدأ طبقات البشرة من البشرة القابلة للحياة ، أي طبقة basale (SB) ، وطبقة سبينوسوم (SS) ، والجرانوبولوسوم الطبقي (SG) ، إلى الطبقة العليا غير القابلة للحياة ، أي الذرة الطبقية (SC)3. تتكون الطبقة القاعدية بشكل رئيسي من الكيراتينات المثرية بالكيراتين المنتشرة ، والتي تهاجر عبر SS عند التمايز4. أثناء نضوج الكيراتينوسيت، تحدث تغييرات مختلفة في التعبير عن البروتين وهيكله. الكريات الكيراتينية تلتزم من خلال تشكيل تقاطعات desmosomal5. في SG، يتم بدء جيل من الهيئات lamellar. وهي تتكون من السلائف الدهنية والإنزيمات التي تعتبر حاسمة لتشكيل وظيفة حاجز الجلد6. يتميز SG أيضا بوجود حبيبات كيراتوثيالين في السيتوبلازم في الخلايا الكيراتينية. في واجهة مع SC، يتم قذف محتوى الهيئات lamellar في المساحات بين الخلايا والدهون غير القطبية مثل سيراميد، والكوليسترول، والأحماض الدهنية الحرة تنظيم في الطبقات ثنائية الدهون الدهون لاميلار مكدسة لتشكيل مصفوفة الدهون خارج الخلية7. في SC، تفقد الخلايا جميع العضيات الخلوية بما في ذلك النواة، وذلك بسبب عمليات التدهور الأنزيمي واعتماد مورفولوجيا بالارض. وهي محاطة بمغلف قرني مصنوع من طبقات بروتينية متصلة ، ويشار إليها باسم الخلايا القرنية8،9. ترتبط مكونات Desmosomal عبر المغلف القرنية لتشكيل corneodesmosomes وربط الخلايا القرنية معا. يتم تجديد الظهارة الناتجة باستمرار من الخلايا الجذعية ، مع وقت دوران من حوالي 5-6 أسابيع10. عملية التفريق بين الخلايا القرنية ، والتي تؤدي إلى البشرة الطبقية بالكامل ، أمر بالغ الأهمية لتشكيل وظيفة الحاجز للبشرة11.

أثناء الجرح والالتهاب ، تحفز الخلايا القرنية تغييرات في جزيئات التصاق والمستقبلات السطحية وتحفز الاستجابات proinflammatory عن طريق إفراز السيتوكينات ، والكيموكينات ، والببتيدات المضادة للميكروبات12. الجلد ليس فقط حاجزا ماديا ضد المواد الخارجية. كما أنه يعمل كمستشعر مناعي عند التعرض لمسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه ينظم انتشار العديد من المواد عبر طبقاته ، مثل محتوى الماء لحماية جسم الإنسان من الجفاف. وتشارك أيضا في الجلد في تركيب فيتامين (د) ولها وظائف التمثيل الغذائي الأخرى المختلفة3,13,14.

لتقييم الآثار السلبية للمواد الخارجية، اعتمد علماء السموم لعقود على اختبار الحيوانات، ولكن في الوقت الحاضر ليس النهج المفضل. وإلى جانب محدودية القدرة التنبؤية للسمية البشرية، تنطوي النماذج الحيوانية على العديد من القضايا الأخلاقية. وقد أدى الحظر المفروض على التجارب على الحيوانات في صناعة مستحضرات التجميل والتوصية باتباع مبدأ 3R (أي الاستبدال والحد والصقل) في البحوث إلى تطوير طرق اختبار بديلة تستند إلى نهج المختبر15. وقد وصفت بالفعل أول نماذج خلايا الجلد في المختبر في 90، وتطور مثير للإعجاب من الثقافات الأحادية الكيراتينية البشرية البسيطة إلى البشرة المتمايزة تماما ونماذج سمك كامل تم تحقيقه16. في الوقت الحاضر، اكتسبت هندسة أنسجة الجلد أهمية في كل من المجالات الصيدلانية ومستحضرات التجميل الجلدية. في العقدين الماضيين، قامت العديد من الشركات بتسوية البشرة البشرية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) التي تمثل أدوات موحدة وقابلة للاستنساخ للدراسات المتعلقة بالبشرة. يتم قبول العديد من نماذج RhE التجارية لاختبار الجلد في المختبر للمواد الكيميائية وفقا للمبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي لاختبار تهيج الجلد17،18 (أي اختبار المبدأ التوجيهي 43919)وتآكل الجلد20 (أي اختبار المبدأ التوجيهي 43121). الاختبار في المختبر للتوعية بالبشرة22 (أي، SENS-IS المقايسة) هو حاليا في مسار الموافقة وتحت استعراض الأقران23. وهناك أيضا العديد من المقايسات الأخرى التي وضعت الاستفادة من نماذج RhE التجارية، لتقييم السمية الضوئية24،لاختبار تركيبات المخدرات25،تركيبات التجميل والمكونات النشطة26، لدراسةوظيفة حاجز الجلد27 واختبار الاستجابة البيولوجية للضغوط البيئية28،29،30،31.

بالإضافة إلى نماذج الجلد ثلاثية الأبعاد المتاحة تجاريا، طورت مجموعات بحثية متعددة موديلاتها البحثيةالخاصة بها 32و33و34و35و36و37. توفر RhEs الداخلية ميزة التحكم في ظروف الثقافة وفقا لغرض الدراسة. على وجه التحديد ، يمكن للباحثين اختيار نوع ومصدر الخلايا القرنية التي ستستخدم لإعادة تشكيل نموذج البشرة ثلاثي الأبعاد (أي الأولية مقابل الخالدة ، حديثي الولادة مقابل المسنين ، والمتبرعين العشوائيين الفرديين مقابل المتبرعين العشوائيين المجمعين ، والجنس ، والعرق ، والعادات المعيشية الفردية مثل التدخين ، وما إلى ذلك). لديهم إمكانية تغيير تكوين وسط الثقافة ودمج عوامل النمو والفيتامينات أو غيرها من المركبات التي يمكن أن تعدل التعبير عن البروتينات المستهدفة أو الدهون. مع RhEs في المنزل ، يمكن للباحثين أيضا التحقيق في الاستجابات البيولوجية والخصائص الميكانيكية الحيوية كدالة لحالة التمايز للنموذج ثلاثي الأبعاد. بالإضافة إلى تلك المعلمات بديهية، وهناك جهود مستمرة لزيادة تعقيد نماذج الجلد 3D وجعلها أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية، على سبيل المثال عن طريق إضافة أنواع أخرى من خلايا البشرة (مثل الخلايا الصباغية والخلايا المناعية)38،39، عن طريق زرع الخلايا القرنية فوق مصفوفة الكولاجين المأهولة بالخلايا الليفية40،41،42، وبإضافة مكونات شبكة الأوعية الدموية43،44،45.

على الرغم من أنه من الممكن ضبط ظروف الثقافة وفقا لاحتياجات محددة، هناك معايير يجب احترامها لضمان جودة وأهمية ال RhE. لزراعة أنسجة RhE ، يتم بذر خلايا القرنية البشرة البشرية العادية (NHEKs) في إدراج ثقافة نفاذية محددة يفصل غشاءها الاصطناعي المسامية الآبار إلى مقصورتين ، أي المقصورة apical و basolateral. المسامية من الغشاء (أي حجم المسام من 0.4 ميكرومتر) هو من هذا القبيل أنه يسمح لتشكيل أحادي الطبقة الخلية في المقصورة apical مع عدم وجود هجرة الخلايا إلى الجانب إدراج القاعدية، وتغذية الخلايا القرنية مع المواد الغذائية الأساسية من وسط الثقافة الواردة في المقصورة القاعدية. في بداية عملية إعادة التشكيل ، يتم استزراع NHEKs في ظروف مغمورة لبضعة أيام للسماح بالالتصاق بها على الغشاء. يتم زيادة مستوى الكالسيوم في كلا المقصورتين مقارنة بتركيز الكالسيوم المستخدم في الثقافة 2D من NHEKs لإبطاء انتشار الخلايا وتعزيز بدلا من ذلكتمايزها 46. تدرج الكالسيوم البشرة ضروري لتنظيم تشكيل الحاجز و التوازن47،48. ارتفاع مستويات الكالسيوم (أي ما يصل إلى 1.5 مليون متر) تعزيز تشكيل تقاطعات بين الخلايا وتعديل تشكيل المغلف المحقن خلال التمايز محطة49. مرة واحدة الخلايا القرنية تشكل أحادية مستمرة وملتصقة بإحكام على الغشاء الداعم، تتم إزالة المتوسطة من المقصورة apical وتستمر عملية الثقافة في واجهة الهواء السائل (ALI) لتحفيز الطبقية وإنشاء حاجز البشرة50،51. شروط ثقافية محددة حاسمة للحصول على ظهارة طبقية بالكامل36. خلال عملية إعادة التشكيل في ALI ، يتم استكمال الوسط في المقصورة القاعدية بعامل نمو الكيراتينوسيت (KGF) والأنسولين والكالسيوم وحمض الأسكوربيك. حمض الأسكوربيك يلعب دورا رئيسيا في تشكيل حاجز الدهون SC المناسبة، تشبه إلى حد كبير أن من الجلد البشري الأصلي52. الخلايا الكيراتينية التي تزرع في الوسط المكمل بحمض الأسكوربيك تظهر النمط الظاهري المتمايز ، مع عدد معزز من حبيبات الكيراتوثيالين ، وكذلك lamellae الدهنية بين الخلايا المنظمة في فترة ما بين خلايا القرنية52. مثل هذا التكميل ضروري لتحسين وظيفة حاجز البشرة عن طريق زيادة محتوى المغلف المحقن وتجنب استنفاد مخازن مضادات الأكسدة الهيدروفيلية53،54. يستخدم KGF ، وهو وسيط الباراكورين مهم لانتشار البشرة والتمايز ، لتحفيز NHEKs55.

وتشمل الجوانب السلبية الرئيسية ل RhEs الداخلية فقدان التوحيد القياسي بين مؤسسات البحث وزيادة كثافة اليد العاملة واستهلاك الوقت (ما يصل إلى 3 أسابيع مقارنة بالنماذج التجارية الجاهزة للاستخدام). والهدف من هذه الورقة هو معالجة هذه العيوب، ووضع أساس للإنتاج على نطاق أوسع. وبالإضافة إلى المزايا المذكورة أعلاه للفوائد الداخلية للملوثات المضادة للانسان، يهدف البروتوكول الحالي إلى الحد من التباين داخل الأنسجة وفيما بينها، والحد من مخاطر التلوث، وتبسيط عملية الزراعة.

يصف البروتوكول الحالي طريقة قابلة للاستنساخ وقوية لزراعة الريس باستخدام NHEKs حديثي الولادة. وعلاوة على ذلك، فإنه يظهر نتائج تمثيلية لتوصيف مورفولوجيا ريس، سلامة الحاجز، والتعبير عن البروتينات التي هي محددة لتمايز البشرة. تم فحص بنية مورفولوجية RhEs باستخدام الهيماتوكسيلين والإيوسين (H &؛ E) تلطيخ ونقل المجهر الإلكتروني (TEM). لتقييم سلامة الحاجز، تم قياس المقاومة الكهربائية عبر الحدود (TEER) ووقت التعرض ل Triton X-100 لتقليل 50٪ من صلاحية الأنسجة (ET50). تم تحليل تشكيل تقاطعات desmosomal (أي desmoglein 1) عن طريق immunofluorescence (IF) لتقييم التصاق الكيراتينية. تم تقييم تكوين البروتينات الهيكلية البشرة (أي إنفولوكرين، لوريكورين، وفيلاغرين) والكشف مع IF. وتشارك هذه البروتينات في تشكيل مغلف البروتين عبر المرتبطة للغاية التي تحيط الخلايا القرنية SC ونتيجة لذلك هي علامات هامة للتمايز البشرة في مرحلة متأخرة56,57. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام IF لتحليل الكيراتين 10، وهو بروتين مستحث في الخلايا المتمايزة في المراحل المبكرة في SS58 ووجد داخل جميع الطبقات المتمايزة. وأخيرا، تم التحقيق في استجابة RhE للمحفزات proinflammatory (أي، شحم الدهون وعامل نخر الورم ألفا). تم قياس مستويات إنترلوكين 1 ألفا (IL-1α) وإنترلوكين 8 (IL-8) في وسائل الإعلام ثقافة الخلية، وذلك باستخدام المقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA).

Protocol

مراجعة ومراعاة الاعتبارات والشروط الأخلاقية الوطنية والدولية المتعلقة باستخدام الأنسجة أو الخلايا البشرية قبل تخطيط وتنفيذ أي نشاط بحثي يتضمن هذا البروتوكول.
ملاحظة: يجب تنفيذ كافة خطوات هذا البروتوكول في ظروف مطهرة. ممارسات السلامة البيولوجية المستوى 2 هي الحد الأدنى من المتطلبات لزراعة RhEs. يجب اتخاذ جميع احتياطات السلامة اللازمة عند التعامل مع المواد الكيميائية / الكواشف الموصوفة في هذا البروتوكول.

1. إعداد وسائل الإعلام ثقافة الخلية

ملاحظة: هناك ثلاثة أنواع مختلفة من وسائط الثقافة الخالية من المصل المستخدمة لزراعة الريس (الجدول 1): '1' الوسط القاعدي ذو مستوى الكالسيوم المنخفض (60 ميكرومترا في الكالسيوم Ca 2+) المستخدم في الثقافة ثنائية الأبعاد للكناك؛ '2' الأنواع الأساسية ذات المستوى المنخفض من الكالسيوم (60 ميكرومتر Ca2+)المستخدمة في الثقافة ثنائية الأبعاد للكناك؛ '2' الأنواع الأساسية من الخلايا الكهروسية (2000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 '2' الوسط المغمور بمستوى عال من الكالسيوم (1.5 مليون متر Ca2+) المستخدم لزرع ال NHEKs في نظام إدراج زراعة الخلايا؛ و (3) واجهة الهواء السائل (ALI) المتوسطة مع ارتفاع مستوى الكالسيوم (1.5 mM Ca2+)، وحمض الأسكوربيك، وعامل نمو الكيراتينوسيت (KGF).

متوسط معلومات متوسطة الكمية المطلوبة
متوسطة القاعدية متوسط نمو الكيراتينية 36 مل/24 بئر
+ 1 ٪ [v/v] HKGS
+ 1 ٪ [v/v] 100x مضاد حيوي مضاد لليميكوتيك
وسط مغمور متوسط نمو الكيراتينية 36 مل/24 بئر
+ 1 ٪ [v/v] HKGS
+ 1 ٪ [v/v] 100x مضاد حيوي مضاد لليميكوتيك
+ 1.5 متر Ca2+
وسيط واجهة الهواء السائل متوسط نمو الكيراتينية 216 مل/24 بئر
+ 1 ٪ [v/v] HKGS
+ 1 ٪ [v/v] 100x مضاد حيوي مضاد لليميكوتيك
+ 1.5 متر Ca2+
+ 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك
+ 10 نانوغرام / مل عامل نمو الكيراتينوسيت

الجدول 1 - الجداول جدول موجز لوسائل الإعلام الثقافية المختلفة المستخدمة لزراعة RhEs. قائمة وسائل الإعلام ثقافة مختلفة مع ملاحق.

  1. إعداد الوسط القاعدي.
    1. تكملة زجاجة من 500 مل من الكيراتينوسيت متوسط النمو(جدول المواد)مع 5 مل من مكملات نمو الكيراتينية البشرية (HKGS) من أجل الوصول إلى تركيزات النهائية من 0.2٪ [v/v] حفرة البقر مستخلص الغدة النخامية (BPE)، 0.2 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة المؤتلف البشري (EGF)، 0.18 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون، 5 ميكروغرام/مل من الأبقار المنقولة، و0.01 ميكروغرام/مل من عامل النمو البشري المؤتلف الشبيه بالإنسولين-I (IGF-I).
    2. إضافة 5 مل من محلول مضاد للذهان 100x يحتوي على 10000 وحدة / مل من البنسلين ، 10000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل من أمفوتريسين B.
  2. إعداد المتوسط المغمورة.
    1. تكملة زجاجة من 500 مل من الخلايا الكيراتينية المتوسطة النمو (جدول المواد) مع 5 مل من HKGS من أجل الوصول إلى تركيزات النهائية من 0.2٪ [v/v] BPE، 0.2 نانوغرام/مل الإنسان المؤتلف EGF، 0.18 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون، 5 ميكروغرام/مل نقل البقر، و0.01 ميكروغرام/مل من IGF-I المؤتلف البشري.
    2. إضافة 5 مل من محلول مضاد للمضادات الحيوية المضادة للذهان 100x.
    3. إضافة 5 مل من محلول مخزون 0.144 M CaCl2 (كلوريد الكالسيوم) للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1.5 mM Ca2+.
      ملاحظة: يتم زيادة تركيز الكالسيوم بالفعل خلال المرحلة المغمورة لتحفيز تمايز الخلايا القرنية وبدء عملية التقسيم الطبقي49.
  3. إعداد واجهة الهواء السائل (ALI) المتوسطة.
    1. تكملة زجاجة واحدة من 500 مل من الكيراتينوسيت متوسط النمو(جدول المواد)مع 5 مل من HKGS من أجل الوصول إلى تركيزات النهائي من 0.2٪ [v/v] BPE، 0.2 نانوغرام/مل الإنسان المؤتلف EGF، 0.18 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون، 5 ميكروغرام/مل نقل البقر، و0.01 ميكروغرام/مل من IGF-I المؤتلف البشري.
    2. إضافة 5 مل من محلول مضاد للمضادات الحيوية المضادة للذهان 100x.
    3. إضافة 5 مل من محلول الأسهم 0.144 M CaCl2 للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1.5 mM Ca2+.
    4. إضافة 1 مل من محلول حمض الأسكوربيك 25 ملغم/مل للوصول إلى تركيز نهائي من حمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/مل.
    5. إضافة 50 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل KGF في 1٪ [ث / v] ألبوم مصل البقر في محلول الأسهم المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) للوصول إلى تركيز نهائي من 10 نانوغرام / مل KGF.
      ملاحظة: منذ حمض الأسكوربيك حساسة للأكسدة، فمن المستحسن استخدام مستقرة حمض الأسكوربيك مشتق، مثل المغنيسيوم L-أسكوربيل-2-فوسفات59 أو L-حمض الأسكوربيك 2-فوسفات sesquimagnesium60. إذا تم استخدام حمض الأسكوربيك، فمن المستحسن لتكملة حديثا المتوسطة ALI مع حمض الأسكوربيك قبل كل تحديث.

2. ثقافة NHEKs

ملاحظة: منذ الخلايا القرنية البشرية الأولية لا تزال منتشرة على مرور الرابع أو الخامس61, وتستخدم NHEKs في مرور الثالث لزراعة ريس. وينبغي التعامل مع الخلايا الكيراتينية الأولية بعناية فائقة نظرا لحساسية عالية. دقيق وبطيئة من تعليق الخلية في أي وقت مهم جدا، لعدم الإخلال بحالة الخلايا.

  1. تذوب قارورة مع 1 ×10 6 NHEKs cryopreserved في حمام مائي في 37 درجة مئوية، عن طريق غمر جزء من القارورة في الماء. احتضان القارورة لمدة 1-2 دقيقة في حمام الماء، حتى فقط قطعة صغيرة من الجليد مرئية.
    تنبيه: لا تغمر القارورة بأكملها في حمام الماء لتجنب التلوث. لا تذوب الخلايا أكثر من دقيقتين; وهذا يمكن أن يقلل من صلاحية الخلية. مسح القارورة مع محلول الإيثانول 70٪ قبل نقل الأنبوب في غطاء غطاء محرك السيارة صفح.
  2. Resuspend الخلايا بعناية فائقة، عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 2-3 مرات. نقل تعليق الخلية إلى قارورتين T75 تحتوي على ما مجموعه 15 مل من المتوسطة ذوبان قبل الحارة، مما أدى إلى كثافة البذر من 6.7 × 104 خلايا / سم2.
    ملاحظة: بالنسبة للمقاطعتين الأوليين وذوبان الخلايا المبردة NHEKs ، يتم استخدام وسيط ثقافة الخلية وفقا لتوصيات المورد.
  3. ضع القوارير في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، و5٪ CO2،و95٪ رطوبة نسبية (RH).)
  4. بعد حوالي 24 ساعة، استبدل الوسط الذائب بالوسط القاعدي لإزالة كبريتسيد ثنائي ميثيل (DMSO) من محلول تجميد الكيراتينوسيت.
  5. تحديث الوسط القاعدي كل يومين.
  6. بعد 4-6 أيام من الزراعة ، يجب أن تكون الخلايا حوالي التقاء 80 ٪ وجاهزة للبذر في إدراج لزراعة RhEs.
    ملاحظة: يجب أن تزرع الكريات الكيراتينية إلى أقصى 80٪ التقاء للحفاظ على قدرتها التكاثرية62. يجب أن يأخذ عدد الخلايا التي سيتم إذابتها في الاعتبار العديد من المعلمات ، مثل رقم مرور الخلية ، وقابلية الخلية عند ذوبان الجليد ، وكفاءة البذر وكذلك وقت مضاعفة.

3. البذر من NHEKs

ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول للاستخدام ضمن تنسيق لوحة الناقل 24 جيدا. إذا كانت هناك حاجة إلى تنسيقات لوحات أخرى (على سبيل المثال، تنسيق 12 جيدا أو 6-well)، ينبغي النظر في التحسينات في كثافة البذر والحجم المتوسط. يلخص الشكل 1 جدولا زمنيا مقترحا لزراعة ال RhE ويبين ظروف الزراعة.

Figure 1
الشكل 1: المخطط الزمني لبروتوكول إعادة التشكيل. عرض إعداد نموذج RhE، وعملية الزراعة، والتطبيق (التعرض للمادة الكيميائية). يتضمن النظام أنواع وسائط ثقافة الخلية المناسبة لكل خطوة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قبل ملء لوحات 24 جيدا مع 1.5 مل من المتوسط المغمورة، وذلك من الناحية المثالية باستخدام ماصة موزع.
  2. إزالة الوسط القاعدي من قوارير T75 المستخدمة لثقافة NHEKs.
  3. شطف الخلايا بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني قبل الحارة إلى كل قارورة T75.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني من القوارير.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة، حيث أن الوسط يحتوي على البروتينات والكالسيوم التي من شأنها أن تمنع نشاط التريبسين.
  5. إضافة 2-3 مل من 0.05٪ [v/v] تريبسين/إيثيلين ديامين رباعي حمض الخليك (EDTA) إلى كل قارورة T75. تأكد من أن يتم توزيع حل التريبسين بالتساوي على منطقة ثقافة الخلية من القارورة.
    تنبيه: يستند حجم 2 مل على التقاء 80٪ المذكورة أعلاه. استخدام 3 مل للقوارير مع التقاء أعلى.
  6. ضع القوارير لمدة 4 دقائق في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،و 95٪ RH). تحقق مما إذا كانت الخلايا تنفصل باستخدام المجهر عند تكبير 10x. الراب قارورة ضد كف اليد لمساعدة الخلايا الافراج عن سطح القارورة. يمكن ملاحظة الخلايا المنفصلة كخلايا مستديرة عائمة في محلول التريبسين.
    تنبيه: لا تحتضن الخلايا في التريبسين لأكثر من 6 دقائق. الإفراط في المحاولة يمكن أن تلحق الضرر بالخلايا وتقليل التزامها63.
  7. بمجرد فصل جميع الخلايا، أضف حجما متساويا (أي 2-3 مل) من مثبط التريبسين الذي تم تسخينه مسبقا إلى كل قارورة T75.
  8. نقل تعليق الخلية من قوارير إلى أنبوب الطرد المركزي.
  9. شطف قوارير مع 5 مل من برنامج تلفزيوني قبل الحارة ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على تعليق الخلية.
    ملاحظة: تأكد من أن معظم الخلايا يتم جمعها عن طريق التحقق من عدد الخلايا المتبقية في قوارير تحت المجهر. يجب أن يكون سطح القارورة فارغا بنسبة 95٪. إذا لم يكن هذا هو الحال فمن الممكن تكرار خطوة المحاولة (3.3-3.9). لاحظ أنه يجب تجنب إعادة المحاولة.
  10. الطرد المركزي الخلايا المحصودة في 400 × ز لمدة 5 دقائق.
  11. تجاهل بعناية معظم supernatant، وترك ما يقرب من 100-200 ميكرولتر في الأنبوب.
    تنبيه: لا تبهر بيليه خلال هذا الإجراء. 
  12. إعادة إنفاق بيليه الخلايا بلطف في حجم منخفض من المتوسط المغمورة، ماصة صعودا وهبوطا 5-10 مرات لضمان تعليق خلية موحدة. ابدأ بحجم منخفض (أي 500 ميكرولتر) لتجنب تكوين مجاميع الخلايا وإضافة ما يصل إلى 1 مل من المتوسط المغمور في المجموع لكل قارورة T75 أولية.
    ملاحظة: نفض الغبار بلطف أنبوب مع الأصابع لإذابة بعناية جزء من بيليه الخلية في supernatant.
  13. عد الخلايا في التعليق باستخدام طريقة استبعاد الأزرق تريبان.
    1. تمييع 0.4٪ [v/v] بقعة زرقاء تريبان وتعليق الخلية في نسبة 1:1، عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 0.4٪ [v/v] بقعة زرقاء تريبان إلى 10 ميكروغرام من تعليق الخلية. أضف 10 ميكرولتر من الحل إلى شريحة العد. قياس عدد الخلايا مباشرة بعد خلط تعليق الخلية مع تريبان الأزرق، منذ بداية الأزرق تريبان لتقليل صلاحية الخلية بعد التعرض لفترة أطول من 1 دقيقة65.
      تنبيه: تبين أن تريبان الأزرق هو مغفل محتمل ومسرطن ومسخ64. التعامل مع الصبغة بعناية والتخلص من النفايات بأمان وفقا للوائح المختبرات المحلية.
      ملاحظة: نهج بديل لاستخدام تريبان الأزرق هو صبغة غير خطرة Erythrosin B66.
  14. تمييع تعليق الخلية مع وسيطة مغمورة إضافية للوصول إلى تركيز 3.525 × 105 خلايا / مل في المتوسط المغمور بإضافة الحجم V2 كما هو موضح في المعادلة 1:
    Equation 1
    C1 = تركيز الخلية محسوبة في تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في 3.12 (خلايا / مل)
    V1 = حجم يستخدم لإعادة إنفاق بيليه الخلايا في 3.12 (مل)
    C2 = تركيز الخلايا المستهدفة في التعليق (أي 3.525 × 105 خلايا / مل)
    V2 = الحجم الذي سيتم إضافته للوصول إلى تركيز الخلية المستهدفة (مل)
    ملاحظة: المساحة السطحية لإدراج الثقافة الموصى بها هي 0.47 سم2; لذلك، فإن كثافة البذر المقابلة هي 3.75 × 105 خلايا / سم2.
  15. إجراء عدد الخلايا الثانية (C3)من الحل المخفف التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.14. استخدم المعادلة 2 لحساب حجم تعليق الخلية (V4)ليتم زرعها في إدراج الثقافة:
    Equation 2
    C3 = تركيز الخلايا المستهدفة في التعليق (أي 3.525 × 105 خلايا / مل)
    V3 = الحجم المستهدف لتعليق الخلية الذي سيتم زرعه في إدراج الثقافة (أي 0.5 مل)
    C4 = تركيز الخلية المحصى في التعليق المخفف الذي تم الحصول عليه في 3.14 (الخلايا / مل)
    V4 = الحجم الفعلي لتعليق الخلية التي سيتم بذرها في إدراج الثقافة (مل)
  16. قم بتعليق إدراج 24 خلية في أعلى موضع من لوحة الحامل الموصى بها ونقل لوحة الحامل إلى لوحة 24 بئرا مملوءة مسبقا بوسط مغمور (cf. 3.1).
    تنبيه: عند نقل لوحة الحامل إلى لوحة متعددة الآبار، تأكد من عدم وجود فقاعات هوائية محصورة بين غشاء الإدراج والوسط المغمور من المقصورة القاعدية، لأن هذا سيؤثر على تغذية الخلايا وسيضر في نهاية المطاف بصلاحية RhE ومورفولوجيا.
  17. أضف وحدة التخزين المحددة V4 (من المعادلة 2) لتعليق الخلية إلى كل إدراج.
    ملاحظة: من المستحسن استخدام تقنية الأنابيب العكسية لتوزيع تعليق الخلية بدقة إلى إدراج الثقافة.
    تنبيه: تأكد من عدم تلف الغشاء عند الاستغناء عن تعليق الخلية في إدراج الثقافة. والاحتياطات هي الاستغناء عن تعليق الخلية على طول جدار نظام الإدراج دون لمس سطح الغشاء.
  18. بعد البذر، واحتضان لوحات 24 بئرا لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، للتغلب على تأثير حافة (أي، توزيع درجة الحرارة غير موحدة بين جميعالآبار 67). لا تحرك اللوحات خلال هذا الوقت.
  19. نقل لوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،و 95٪ RH). يتم الحفاظ على الخلايا في ظروف مغمورة لمدة ثلاثة أيام.
    ملاحظة: لتجنب تقلب الأنسجة، لا تتكدس اللوحات في الحاضنة بعد البذر للتأكد من أن كل إدراج يتلقى نفس الكمية من الحرارة. بعد ثلاثة أيام (أي أثناء زراعة ALI) ، يمكن تكديس الصفائح.

4. زراعة في الهواء السائل واجهة

  1. بعد حضانة لمدة ثلاثة أيام في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2، و 95 ٪ RH) ، تعرض الخلايا التي التزمت بسطح الغشاء إلى ALI عن طريق إزالة الوسط المغمور من المقصورة apical ويفضل استخدام نظام الطموح وماصة باستور زجاجية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إزالة الوسط المغمور من المقصورة apical مع ميكروبايت يدوي.
  2. ملء لوحات جديدة 24 جيدا مع 1.5 مل من الطازجة قبل الدافئة ALI المتوسطة ونقل لوحات الناقل مع إدراج الثقافة إلى لوحات جديدة متعددة الآبار.
  3. نقل لوحات متعددة الآبار مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،و 95٪ RH).
  4. تحديث المتوسطة ALI كل 2-3 أيام لمدة 14 يوما.
  5. قم بإجراء التحديث في خطوتين: 1) قم بإعداد لوحة جديدة تحتوي على 1.5 مل / بئر من متوسط ALI الطازج قبل الإحماء و 2) نقل لوحة الناقل إلى اللوحة الجديدة.
    تنبيه: خلال عملية إعادة التشكيل بأكملها، من الأفضل عدم إزالة الغطاء الذي يغطي لوحة الحامل للحفاظ على حماية RhEs من التلوث المحتمل.
    ملاحظة: خطوة ALI أمر بالغ الأهمية لتطوير نموذج البشرة الطبقية لأنها تسمح التمايز النهائي من keratinocytes68. بعد الذهاب إلى ALI ، يلزم التحكم البصري في الإدراجات ، للتحقق مما إذا كانت هناك "أنسجة متسربة": قطرات متوسطة على سطح الأنسجة قادمة من المقصورة القاعدية. إذا حدث التسرب في اليوم الثالث من ALI، فقم بإزالة الوسط برفق من إدراج الثقافة دون لمس سطح الأنسجة. إذا استمر التسرب ، فمن المستحسن التخلص من الأنسجة المتسربة لأنها مؤشر على عدم وجود تشكيل حاجز صحيح في نموذج RhE.
  6. في نهاية عملية إعادة التشكيل ، يمكن أن تتعرض الأنسجة لضغوطات مختلفة للحث على سبيل المثال الإجهاد التأكسدي أو الالتهاب. بالتوازي مع ذلك ، يمكن علاجها بمركبات كيميائية أو مكونات تجميلية. ملاحظة: أثناء التعرض/العلاج، عادة ما يتم الحفاظ على الأنسجة في وسط مغمور بدءا من ALI D14. عندما يتوقع أن تتعرض الأنسجة / علاجها لفترة طويلة من الزمن (أي 48-72 ساعة) ، يوصى ب (1) بدء التعرض / العلاج في وقت سابق من عملية زراعة ALI ، مثل D7-D9 ، لتجنب ترقق الطبقات القابلة للحياة وسماكة SC ، و (2) لاحتضان الأنسجة في المتوسط ALI ، للحفاظ على تحفيز انتشار الخلايا.
  7. لحصاد RhE، جمع الأنسجة وخلايا الزرع المتوسطة في timepoint من الفائدة للتحليل النسيجي، المقايسات الجدوى، استخراج البروتين / الحمض النووي الريبي، والمقاايسات المناعية المرتبطة الانزيم (ELISAs).

Representative Results

NHEKs المستزرعة في 2D عرض مورفولوجيا التقليدية مع شكل مضلع متسقة(الشكل 2A). كما هو موضح أعلاه، يتم زرع NHEKs في إدراج الثقافة بعد الوصول إلى التقاء ما يقرب من 80٪. تم تحليل مورفولوجيا RhEs باستخدام تلطيخ H &؛ E وTEM. بعد 15 يوما في ALI ، يتم الحصول على نسيج طبقي بالكامل كما هو مبين في طبقات البشرة الرئيسية الأربع: SB ، وSS ، وSG ، وSC (الشكل 2B). في طبقة SB، يكون للخلايا شكل عمودي. من الطبقة الثانية باتجاه الطبقات العليا من RhE ، تميز NHEKs كما لوحظ من خلال التغيرات في مورفولوجيا الخلية (من شكل عمودي في طبقة SB ، نحو شكل مغزلي في طبقة SS). في طبقة SG ، يكون للخلايا شكل أكثر تسطيحا وتعرض حبيبات كيراتوالين (KG) التي يتم تمثيلها كنقاط أرجوانية في السيتوبلازم. يتم تمييز شكلها المستدير النجمي المميز بواسطة الأسهم البيضاء على صورة H &؛ E(الشكل 2C). الخلايا في SC، هي متمايزة بشكل نهائي وسويت تماما وتفتقر إلى نواة الخلية. و RhEs الطبقية لديها سمك إجمالي 84.3 ± 2.4 ميكرومتر وسمك SC لها من 19.6 ± 3.2 ميكرومتر (الشكل 2D). وهذه القيم مماثلة لتلك المبلغ عنها للبشرة البشرية الأصلية، أي 60-120 ميكرومتر و10-20 ميكرومتر، على التوالي69. عدد الطبقات القابلة للحياة هو 6-7 ، وهو أقل مقارنة ببشرة الإنسان الأصلية ، حيث يبلغ حوالي 7-1470. التحليل Ultrastructural من RhEs في نقاط زمنية مختلفة في بروتوكول إعادة تشكيل (أي 7 و 10 و 13 و 15 يوما) يكشف عن عملية تطويع الريس مع زيادة عدد طبقات الخلايا القرنية مع مرور الوقت(الشكل 2E). بعد 15 يوما في ALI ، يتكون SC من أنسجة RhE من حوالي 15-25 طبقة ، وهو ما يماثل القيمة المبلغ عنها للبشرة البشرية الأصلية (أي 15-20 طبقة)69.

Figure 2
الشكل 2: الخلايا القرنية الأولية والبشرة البشرية المعاد بناؤها. (A) صورة المجهر على النقيض من المرحلة من الخلايا القرنية الأولية قبل البذر على إدراج. شريط مقياس هو 50 ميكرومتر(B-C) H &؛ E صورة المجهر حقل مشرق من RhE. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر (ب) و 25 ميكرومتر (C). (د)تحديد كمية سمك RHE وSC (متوسط ± SEM، n = 3). (E) صور المجهر الإلكتروني انتقال المقاطع العرضية RhE بعد 7, 10, 13, و 15 أيام في ALI. مقياس الشريط هو 4 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وفقا لمرحلة التمايز ، تظهر NHEKs المتنامية في 3D ملامح تعبير البروتين المختلفة وفقا لمرحلة التفريق. تم تحديد التعبير عن البروتينات المحددة لتمايز الكيراتينوسي في المراحل المبكرة (أي الكيراتين 10) ، وتمايز الكيراتينوسي في مرحلة متأخرة (أي involucrin و loricrin و filaggrin) ، والالتصاق بالخلايا القرنية (أي desmoglein 1) في RhEs باستخدام IF تلطيخ. يظهر تعبير Involucrin أكثر في الغالب في طبقة SG منذ أن بدأ تعبيره في وقت سابق خلال عملية التمايز(الشكل 3D)، في حين يتم التعبير عن الفيلاغرين واللوريكرين في الطبقات العليا (الشكل 3B- C). تم العثور على تعبير الكيراتين 10 في جميع الطبقات القابلة للحياة ، باستثناء طبقة SB(الشكل 3E). عرض RhEs تقاطعات desmosomal وظيفية، كما هو مبين في التعبير عن desmoglein 1 في الفضاء بين الخلايا من طبقات البشرة قابلة للحياة (الشكل 3F). وختاما، يتم التعبير عن جميع العلامات الخمسة وتقع في طبقات البشرة المناسبة وتترجم إلى عملية تمايز البشرة الصحية.

Figure 3
الشكل 3:تمايز البشرة، التصاق الأنسجة، وسلامة الأنسجة من البشرة البشرية المعاد بناؤها. (A) H &؛ E صورة المجهر حقل مشرق من RhE. صور المجهر الفلوري Confocal من (ب) filaggrin (FLG) ،(C)لوريكورين (لور) ،(د)involucrin (INV) ،(ه) الكيراتين 10 (K10) ، و (F) desmoglein 1 (DSG-1) ممثلة في أرجواني. يتم تمثيل تلطيخ النوى (DAPI) باللون الأزرق. مقياس الشريط هو 25 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم التحقيق في خصائص الحاجز لنموذج RhE من خلال تقييم كل من صلاحية الأنسجة وسلامتها. تم تحديد سلامة الأنسجة بعد 15 يوما عن طريق قياس TEER باستخدام مقياس فولتوهمتر. 2567 ± 415 Ω.cm2 القيم المسجلة لRhEs ترجمة تشكيل حاجز مستمر(الشكل 4A). هذه القيم هي في نطاق مع تلك التي ذكرت لنماذج RhE71،72،73،74. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد وقت التعرض المطلوب للمواد الكيميائية المرجعية السامة للخلايا (أي تريتون X-100) للحد من صلاحية الأنسجة بنسبة 50٪ (ET50)مع فحص بروميد رباعي الزيوم الأزرق الثيازوليل (MTT). وكانت قيمة ET50 التي تم قياسها ل RhE 2.1 ساعة. تقع هذه القيمة ضمن نطاق القبول لنماذج البشرة ثلاثية الأبعاد الأخرى المؤهلة للتنبؤ الموثوق بتصنيف التهيج (المبدأ التوجيهي لمنظمة التعاون الاقتصادي والتنمية 439)19.

Figure 4
الشكل 4:خصائص الحاجز للبشرة البشرية المعاد بناؤها. (أ) سلامة الأنسجة مقاسة بمقاومة كهربائية عبر الإبط (متوسط ± SEM، n=6). (ب)ET50 يحدده قياس صلاحية الأنسجة (أي، MTT المقايسة) عند التعرض الموضعي ل78.3 ميكرولتر من 1٪ تريتون X-100 (متوسط ± SEM، ن = 3).

تم التحقيق في استجابة RhEs بناء على محفزات proinflammatory المعروفة. وعولجت الريس بشكل منهجي، أي إضافة المحفزات في وسط المقصورة القاعدية، باستخدام 100 ميكروغرام/مل إيشريشيا كولاي ليبوبوليسيساكاريد (LPS) و40 نانوغرام/مل عامل نخر الورم ألفا (TNF-α). بعد 24 ساعة من المحفزات، تم جمع وسيط ثقافة الخلية. تم قياس السمية الخلوية باستخدام مقايسة ديهيدروجيناز اللاكتات (LDH) وبالمقارنة مع قيم معرقل الغشاء المعروف ، المنظفات Triton X-100(الشكل 5). زيادة كبيرة (ص < 0.05، ANOVA في اتجاه واحد، اختبار مقارنة متعددة دونيت) وقد تبين في نشاط LDH في RhEs تعامل مع تريتون X-100. أظهرت كل من LPS وعلاجات TNF-α عدم السمية الخلوية.

Figure 5
الشكل 5:السمية الخلوية التي تقاس عن طريق فحص ديهيدروجيناز اللاكتات (LDH). وتقدم البيانات كقيم نسبية للسيطرة، والأنسجة غير المعالجة (CTRL)؛ متوسط ± SEM، n=9 (Triton X-100)، n=8 (LPS)، n=3 (TNF-α). تم اختبار الأهمية مع ANOVA في اتجاه واحد ، اختبار مقارنة دونيت المتعدد. النجمة يدل على اختلاف مهم إحصائيا بالمقارنة مع CTRL، ****p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تحديد كمية إطلاق إنترلوكين 1 ألفا (IL-1α) وإنترلوكين 8 (IL-8) في وسط RhE باستخدام ELISAs. ويبين الشكل 6 كلا من إطلاق ال RHEs لل IL-1α وIL-8 المحددين والنسبيين عند التحدي باستخدام LPS و TNF-α. أدى علاج LPS إلى إطلاق سراح مستحث من IL-8 (9.6 ± زيادة 1.0 أضعاف) وIL-1α (زيادة 2.7 ± 1.3 مرة) ذات دلالة إحصائية (p < 0.05، اختبار T للطالب غير المدفوع). لم يحدث α TNF إطلاق IL-8 بشكل كبير ، على الرغم من ملاحظة ميل لزيادة مستويات IL-8 (زيادة 2.3 ± 0.8 أضعاف). ومع ذلك ، لم TNF - α بشكل كبير (ص < 0.05 ، غير مدفوعة الأجر الطالب تي اختبار) الزناد IL - 1α الافراج (1.8 ± 0.5 أضعاف الزيادة).

Figure 6
الشكل 6: استجابات Proinflammatory في البشرة البشرية التي أعيد بناؤها. تركيزات IL-8 الإفراج عن طريق RhE على التحدي 24 ساعة مع LPS (أ) و TNF-α (ب). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM، n = 8 (LPS)، n = 3 (TNF-α). (ج)يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط القيمة النسبية مقارنة بالتحكم، والأنسجة غير المعالجة (CTRL) ± SEM، n=8 (LPS)، n=3 (TNF-α). تركيز IL-1α الإفراج عن RhE على التحدي 24 ساعة مع LPS (D) و TNF-α (E). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM، n = 8 (LPS)، n = 3 (TNF-α). (F)يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط القيمة النسبية مقارنة ب CTRL ± SEM، n = 4 (LPS)، n = 3 (TNF-α). تم اختبار الأهمية من خلال اختبار T للطالب غير المدفوع الأجر. النجمة يدل على اختلافات ذات دلالة إحصائية بالمقارنة مع CTRL، * ص < 0.05، ****p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وتستخدم على نطاق واسع ريس كأدوات الفحص في المجالات الصيدلانية ومستحضرات التجميل dermato36،75،76،77،78. وعلى الرغم من أن عدة شركات أتاحت هذه النباتات غير الزراعية تجاريا، فإنها تظل مكلفة وتحد من إمكانية تغيير بارامترات الزراعة حسب الاقتضاء لمعالجة مسائل البحث الجديدة. تصف هذه الورقة إجراءات إنتاج ال RhEs الداخلية بطريقة قوية وموثوقة وتقدم وصفا مفصلا للأنسجة التي تم الحصول عليها لتأكيد أهمية النموذج كنهج بديل لاختبار الحيوانات.

بعض الخطوات في البروتوكول حاسمة لضمان التمايز keratinocyte السليم وRhE استنساخ. ويمكن تنفيذ ذلك باستخدام الخلايا المثلى، والنوع (الأنواع) المتوسطة، وظروف الزراعة. وفي نموذج RhE المقترح، تم اختيار NHEKs حديثي الولادة لعدم تعرضهم لمضادات المنشأ، مقارنة بالنهايات NHEKs البالغة. وعلاوة على ذلك، اقتصرت الكريات الكيراتينية على العرق القوقازي لتجنب التباين بين الأنواع. وعادة ما تستخدم الخلايا الكيراتينية الأولية لقدرتها على التفريق والتقسيم الطبقي79. ويمكن الحصول عليها تجاريا أو عن طريق العزلة الداخلية من الجلد الكبار80. وقد أظهرت زراعة خط الخلية (أي HaCaT) على غشاء البولي، أن تفشل التمايز وأظهرت ضعف القدرة على توليف الدهون التي هي ضرورية لتشكيل الحاجز81. ومع ذلك ، فإن إدراج المصفوفات الثقافية المختلفة ، مثل الهيدروجيل والكولاجين والفيبرين وثقافات كرويدات ، أدى إلى التطور الناجح لنماذج الجلد ثلاثية الأبعاد78,82,83,84,85,86. خطوط الخلية الخالدة، N/TERT، وقد ثبت أن تكون مناسبة لتطوير RhEs35. تظل الخلايا الكيراتينية الأولية منتشرة عند مرورها الرابع أو الخامس61، وبالتالي فإن البروتوكول الحالي يتضمن استخدام الخلايا الكيراتينية في مرورها الثالث. وقد أثبت دي فويست وآخرون أن كثافة بذر الخلايا ذات أهمية ويجب أن تكون كافية (أي ≥ 2.5x105 خلايا/سم2) لضمان عدم انتشار الوسط من المقصورة القاعدية إلى المقصورة apical. كثافة بذر غير كافية (أي، < 2.5x105 خلايا/سم2) يمكن أن يؤدي إلى عدم القدرة على تشكيل حاجز مناسب، والذي يشار إليه من خلال نشر المتوسطة من القاعدية إلى المقصورة apical، مما أدى إلى المغمورة بدلا من ظروف الثقافة ALI62. مصل خالية من الكيراتينوسيت نمو المتوسطة (انظر جدول المواد) كان يفضل لأغراض استنساخ، لأنه يوفر ميزة العمل مع وسيط محدد كيميائيا ويقلل من خطر التلوث. هذا الوسط يحتوي على تركيز أقل من الكالسيوم (أي 60 ميكرومتر) وبالتالي يحفز انتشار الخلايا الكيراتينية87. زيادة تركيز الكالسيوم (أي 1.5 mM) من الخطوة الأولى من زراعة RhE، تفضل التمايز الكيراتينية وتشكيل حاجز الجلد وهوسط49. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استكمال المتوسط ALI مع حمض الأسكوربيك ، والتي أظهرت أن تكون حاسمة لتشكيل الدهون SC وتعزيز التمايز52,53,54. يحتوي المتوسط ALI أيضا KGF، وهو عامل نمو تفرزها الخلايا الليفية التي يمكن أن ترتبط مستقبلات الخلايا الكيراتينية transmembrane وعند التنشيط له دور مزدوج في التمايز وإصلاح الجروح55,88. من المهم تحديث المتوسط ALI في فترات زمنية محددة، لتوفير إمدادات مستمرة من المواد الغذائية الطازجة إلى RhEs. استخدام نظام لوحة الناقل أمر بالغ الأهمية لزراعة ال RhE على نطاق أوسع (أي 24 إدراج / لوحة). فهو يوفر ميزة توفير الوقت، والحد من خطر التلوث، ويترك مجالا أقل لإدخال الأخطاء البشرية. كما يوفر إمكانية زراعة RhEs في حجم كبير من الوسائط (أي 1.5 مل) ، مما يقلل من العدد المطلوب من التحديث المتوسط ALI. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر إمكانية نقل لوحة كاملة من إدراج إلى لوحة مع المتوسطة الطازجة، وتجنب الاتصال مع إدراج بشكل فردي أو الكشف عن غطاء لوحة.

هناك العديد من القيود على نموذج RhE التي تجدر الإشارة إليها. في الجلد البشري الأصلي هناك توازن بين انتشار الخلايا الكيراتينية في الطبقة القاعدية وانفصال الخلايا القرنية في SC (أي الديسكواميشن)89. ومع ذلك ، في المختبر ، لا يحدث التكون. لذلك ، تظل الخلايا القرنية مرتبطة ب RhE وتشكل SC سميكة أقل أهمية من الناحية الفسيولوجية. ومن ثم، هناك فترة زمنية محدودة للزراعة من RhEs. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النموذج RhE بسيط ومباشر، لأنه يتكون من نوع الخلية المفرد، أي الكيراتينوسي، وهو نوع الخلية الأكثر وفرة من البشرة. ومع ذلك، هناك أنواع أخرى من الخلايا المقيمة في البشرة، مثل الخلايا الصباغية، والخلايا التشعبية (أي خلايا لانغرهان)، والخلايا التائية (على سبيل المثال، CD8+ الخلايا)، وخلايا ميركل13. لتعزيز الأهمية الفسيولوجية لنموذج الجلد، جعل الباحثون نماذج الجلد أكثر تعقيدا عن طريق إضافة الخلايا الصباغية38 , خلايا مناعية39، أو الخلايا المشتقة من المريض90. يجب على المرء أن نضع في اعتبارنا أن خصائص حاجز من نماذج الجلد البشري مختلفة بالمقارنة مع الجلد البشري الأصلي، ويرجع ذلك إلى تكوين الدهون SC مختلفة و نفاذية حاجز أعلى 91,92,93,94,95. ومع ذلك، فقد أبلغت العديد من الدراسات عن تغييرات في خصائص الحاجز لنماذج الجلد البشري من خلال زراعة تحت نقص الأكxia96 أو انخفاض الرطوبة النسبية97، وتعديل مصفوفة الجلد مع الشيتوزان98، والتغيير في الأحماض الدهنية الحرة في وسط الثقافة99. وعلاوة على ذلك ، في كل من RhEs بسيطة وأكثر تعقيدا ، يمكن تعديل الظروف الثقافية والتركيب المتوسط لمحاكاة الميزات المرضية. من خلال تحدي النموذج مع السيتوكينات ، ومورفولوجيا غير طبيعية100 ويمكن إثبات التغيرات في مستويات التعبير الجيني والبروتين التي لوحظت عادة في اضطرابات الجلد الشائعة، مثل التهاب الجلد التأتبي والصدفية35,101,102,103,104,105. إسكات جينات محددة في الخلايا القرنية قبل البدء في عملية إعادة تشكيل النموذج ثلاثي الأبعاد هو نهج آخر يستخدم لمحاكاة ميزات اضطرابات الجلد والتحقيق في الحلول العلاجية الجديدة106,107. إلى جانب نمذجة طبقة البشرة فقط ، يمكن تضمين مقصورة جلدية في النموذج (أي معادلات الجلد البشري المسماة أو نماذج سمك كامل) عن طريق تضمين الخلايا الليفية في مصفوفة الكولاجين قبل إعادة تشكيل RhE ، مما يجعلها أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية ومناسبة للدراسات المتعلقة بالشيخوخة وشفاء الجروح108,109,110. بالإضافة إلى ذلك، تمت إضافة كرويات الورم إلى مكافئات الجلد البشري لدراسة تطور الورم الميلانيني111,112. أحدث التطورات في مجال نماذج البشرة هي الطباعة الحيوية والجلد على رقاقة. نجحت مجموعات بحثية متعددة مؤخرا في تطوير مكافئات الجلد المطبوعة بيولوجيا (القابلة للتشويش)45,113,114. ويستفيد البروتوكول المقترح من شكل 24 بئرا ولوحة حاملة، مع تجنب إدراجها لمعالجتها على حدة. ومع ذلك، لا يزال مقياس الدراسة محدودا جدا ويفتقر إلى التشغيل الآلي. من خلال تنفيذ استخدام الطباعة الحيوية أو الجلد على رقاقة، يمكن استخدام نماذج أصغر الجلد مع عمليات أكثر الآلي وعلى نطاق أوسع.

وRhE وصفها في هذا البروتوكول لديه أوجه تشابه متعددة لنماذج البشرة التجارية المتقدمة بالفعل وتتميز بشكل جيد. وقد أثبت التحليل المورفولوجي أنه على الرغم من أن عدد الطبقات القابلة للتطبيق في نموذج RhE المقترح أقل مقارنة بجلد الإنسان الأصلي (أي 6-7 مقارنة ب 7-14) ، إلا أنه مماثل لنموذج EpiDerm RhE (أي 8-12)70. وبالمثل لنماذج EpiDerm و EpiSkin و SkinEthic ، تظهر طبقة RhE العليا نمطا نسج السلة من طبقات القرنية المعبأة بكثافة28. وعلاوة على ذلك، كشف تحليل TEM أن عدد طبقات SC في نموذج RhE المقترح (أي 15-25) مماثل لعدد EpiDerm (أي 16-25)70. وعموما، فإن نموذج RhE المقترح يوضح بنية مماثلة لهيكل نماذج البشرة التجارية الأخرى، التي تحاكي البشرة البشرية الأصلية. سلامة الأنسجة كما تقاس TEER في نطاق مع نماذج RhE التجارية (أي بين 3000-5600 Ω.cm2)71،72،73 وغيرها من RhEs في المنزل (أي ما يقرب من 5000 Ω.cm2)74،115. ويبين نموذج ال RhE المقترح أنه متمايز بشكل جيد، كما هو مبين في وجود علامات التمايز والتصاق الأنسجة وتصحيحها. وعلاوة على ذلك، فإن نموذج ال RhE المقترح يظهر أنه يستجيب للمحفزات proinflammatory (أي LPS و TNF-α).

وختاما، يبين البروتوكول الحالي كيفية إنتاج الاستراتيجيات والاستراتيجيات على نحو موثوق وعلى نطاق واسع نسبيا لتلبية احتياجات الباحثين في المؤسسات الأكاديمية والخاصة على حد سواء. ويبين نموذج RhE المقترح أن له مورفولوجيا مماثلة، وتمايز البشرة، والاستجابة البيولوجية للنماذج التجارية القائمة الأخرى. ويوفر أداة بديلة لكل من المجال الصيدلاني ومستحضرات التجميل الجلدية عندما يكون الوصول إلى نموذج الجلد ذات الصلة مطلوب.

Disclosures

مارك إيمان وبينيديتا بيتراكا موظفان في داو سيليكون بلجيكا. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد مول هذا العمل برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 في إطار منحة ماري سكلودوسكا كوري مع اتفاق المنحة رقم 765602. جميع المؤلفين الاعتراف بدعم من مؤسسة أدولف ميركل وجامعة فيرارا ونعترف بامتنان داو سيليكونس بلجيكا. ومن المسلم به الدكتور ميغيل سبوك كالفار لإعداد الصور الرسومية لعملية زراعة RhE. يشكر المؤلفون الدكتورة باربرا دراسلر، والدكتور فرانكو سيرفيلاتي، والدكتورة أنييس تيسييه على دعمهم التقني ومناقشاتهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich A6283 Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.
Antibiotic-antimycotic (100x) Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15240062
Aqueous Eosin Y solution Sigma Aldrich HT110280 Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich or Merck C8106 or 1.02378.0500 Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C.  It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.
DAPI Roche 10236276001 Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL.
Entellan mounting medium Merck 1.07960.0500 Mounting medium for H&E staining.
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) Thermo Fisher Scientific (Gibco) MEPI500CA Contains 0.06 mM of Ca2+.
Ethanol absolute Any supplier N/A
Formalin 10% Leica Biosystems 3800770
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) Thermo Fisher Scientific (Gibco) S0015 To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.
Isopropanol Biosolve B.V. 0016264102BS
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free Merck 1.08635.0100 Mounting medium for IF staining.
Keratinocyte growth factor (KGF) R&D Systems 251-KG-050 Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. 
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit Roche 4744926001
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate  Sigma-Aldrich A8960 Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 Sigma-Aldrich L4524 Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. 
Mayer’s Haematoxylin Sigma-Aldrich MHS80
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) Lonza 00192906 Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.
Phosphate-buffered saline Thermo Fisher Scientific (Gibco) 10010056 or 10010-015 Reference numbers can vary between countries.
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) ImmunoTools 11344483 Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL
Sterile ultrapure water Any supplier N/A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93426
Trypan blue (0.4% [v/v]) Any supplier N/A
Trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific (Gibco) R007100
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) Thermo Fisher Scientific (Gibco) 25300054
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam Ab150113
Tri-sodium citrate dihydrate Merck 1.06448.0500 For antigen retrieval buffer for IF staining. 
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) Agrisera AS09 633
Filaggrin Mouse antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-53243
Involucrin Rabbit antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-33742
Keratin 10 Mouse antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-32962
Desmoglein-1 Mouse antibody  BioTechne (Novus Biologicals) MAB944
Loricrin Rabbit antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP1-33610

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Antioxidants & Redox Signaling. , (2002).
  2. Pouillot, A., Dayan, N., Polla, A. S., Polla, L. L., Polla, B. S. The stratum corneum: a double paradox. Journal of Cosmetic Dermatology. 7 (2), 143-148 (2008).
  3. Moore, K. L., Dalley, A. F. Clinically Orientated Anatomy. , (2010).
  4. Barthel, R., Aberdam, D. Epidermal stem cells. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 19 (4), 405-413 (2005).
  5. Green, K. J., Simpson, C. L. Desmosomes: new perspectives on a classic. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2499-2515 (2007).
  6. Feingold, K. R. Lamellar bodies: the key to cutaneous barrier function. Journal of Investigative Dermatology. 132 (8), 1951-1953 (2012).
  7. Elias, M. P., Feingold, K. R., Fartasch, M. The epidermal lamellar body as a multifunctional secretory organelle. Skin Barrier. , 261-272 (2006).
  8. Tobin, D. J. Biochemistry of human skin-our brain on the outside. Chemical society reviews. 35 (1), 52-67 (2006).
  9. Bouwstra, J. A., Ponec, M. The skin barrier in healthy and diseased state. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1758 (12), 2080-2095 (2006).
  10. Weinstein, G. D., McCullough, J. L., Ross, P. Cell proliferation in normal epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 623-628 (1984).
  11. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'être" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  12. Suter, M. M., et al. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Veterinary Dermatology. 20 (5-6), 515-532 (2009).
  13. McLafferty, E., Hendry, C. The integumentary system: anatomy, physiology and function of skin. Nursing Standard. 27 (7), 35-43 (2012).
  14. Monteiro-Riviere, N. A. Toxicology of the skin. , (2010).
  15. Dellambra, E., Odorisio, T., D'Arcangelo, D., Failla, C. M., Facchiano, A. Non-animal models in dermatological research. ALTEX. 36 (2), 177-202 (2019).
  16. Gordon, S., et al. Non-animal models of epithelial barriers (skin, intestine and lung) in research, industrial applications and regulatory toxicology. Altex. 32 (4), 327-378 (2015).
  17. Kandárová, H., et al. The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests - An assessment of the performance of the optimised test. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 33 (4), 351-367 (2005).
  18. Kandárová, H., et al. Assessment of the skin irritation potential of chemicals by using the SkinEthic reconstructed human epidermal model and the common skin irritation protocol evaluated in the ECVAM skin irritation validation study. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 34 (4), 393-406 (2006).
  19. OECD. Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. , (2019).
  20. Alépée, N., Grandidier, M. H., Cotovio, J. Sub-categorisation of skin corrosive chemicals by the EpiSkinTM reconstructed human epidermis skin corrosion test method according to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicology in Vitro. 28 (2), 131-145 (2014).
  21. OECD. Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. , (2019).
  22. Mehling, A., et al. In vitro RHE skin sensitisation assays: applicability to challenging substances. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 108, 104473 (2019).
  23. SENS-IS | EURL ECVAM - TSAR. , Available from: https://tsar.jrc.ec.europa.eu/test-method/tm2011-11 (2020).
  24. Lelièvre, D., et al. The episkin phototoxicity assay (EPA): development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency. Toxicology in Vitro. 21 (6), 977-995 (2007).
  25. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  26. Pellevoisin, C., Bouez, C., Cotovio, J. Cosmetic industry requirements regarding skin models for cosmetic testing. Skin Tissue Models. , 3-37 (2018).
  27. Niehues, H., et al. 3D skin models for 3R research: the potential of 3D reconstructed skin models to study skin barrier function. Experimental Dermatology. 27 (5), 501-511 (2018).
  28. Netzlaff, F., Lehr, C. -M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin®, SkinEthic® and EpiDerm®: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 167-178 (2005).
  29. Prieux, R., Eeman, M., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G. Mimicking cigarette smoke exposure to assess cutaneous toxicity. Toxicology in Vitro. 62, 104664 (2020).
  30. Petracca, B., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G., Eeman, M. Bench approaches to study the detrimental cutaneous impact of troposperic ozone. Journal of Exposure Science and Environmental Epidemiology. 31, 137-148 (2021).
  31. Dijkhoff, I. M., et al. Impact of airborne particulate matter on skin: a systematic review from epidemiology to in vitro studies. Particle and fibre toxicology. 17 (1), 35 (2020).
  32. El Ghalbzouri, A., Siamari, R., Willemze, R., Ponec, M. Leiden reconstructed human epidermal model as a tool for the evaluation of the skin corrosion and irritation potential according to the ECVAM guidelines. Toxicology in Vitro. 22 (5), 1311-1320 (2008).
  33. Chacón, M., et al. Development of an in-house reconstructed human epidermis model as an alternative method in skin corrosion assessment. Toxicology in Vitro. 65, 104779 (2020).
  34. Pedrosa, T. doN., et al. A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicology in Vitro. 42, 31-37 (2017).
  35. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838 (2017).
  36. Poumay, Y., Coquette, A. Modelling the human epidermis in vitro: tools for basic and applied research. Archives of dermatological research. 298 (8), 361-369 (2007).
  37. Rikken, G., Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Organotypic 3D skin models: human epidermal equivalent cultures from primary keratinocytes and immortalized keratinocyte cell lines. Methods in Molecular Biology. 2154, 45-61 (2020).
  38. Duval, C., et al. Human skin model containing melanocytes: essential role of keratinocyte growth factor for constitutive pigmentation-functional response to α-melanocyte stimulating hormone and forskolin. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (12), 947-957 (2012).
  39. Hutter, V., Kirton, S. B., Chau, D. Y. S. Immunocompetent human in vitro skin models. Skin Tissue Models. , 353-373 (2018).
  40. Kinsner, A., Lesiak-Cyganowska, E., Śladowski, D. In vitro reconstruction of full thickness human skin on a composite collagen material. Cell and Tissue Banking. 2 (3), 165-171 (2001).
  41. Black, A. F., Bouez, C., Perrier, E., Schlotmann, K., Chapuis, F., Damour, O. Optimization and characterization of an engineered human skin equivalent. Tissue Engineering. 11 (5-6), 723-733 (2005).
  42. Reijnders, C. M. A., et al. Development of a full-thickness human skin equivalent in vitro model derived from TERT-immortalized keratinocytes and fibroblasts. Tissue Engineering. Part A. 21 (17-18), 2448-2459 (2015).
  43. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 352-366 (2011).
  44. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  45. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. 3D cell printing of perfusable vascularized human skin equivalent composed of epidermis, dermis, and hypodermis for better structural recapitulation of native skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019 (2019).
  46. Pittelkow, M. R., Scott, R. E. New techniques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and perspectives on their use for grafting of patients with extensive burns. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 771-777 (1986).
  47. Elias, P. M., Ahn, S. K., Brown, B. E., Crumrine, D., Feingold, K. R. Origin of the epidermal calcium gradient: regulation by barrier status and role of active vs passive mechanisms. Journal of Investigative Dermatology. 119 (6), 1269-1274 (2002).
  48. Elias, P. M., et al. Modulations in epidermal calcium regulate the expression of differentiation-specific markers. Journal of Investigative Dermatology. 119 (5), 1128-1136 (2002).
  49. Lee, S. E., Lee, S. H. Skin barrier and calcium. Annals of Dermatology. 30 (3), 265-275 (2018).
  50. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  51. Poumay, Y., et al. A simple reconstructed human epidermis: preparation of the culture model and utilization in in vitro studies. Archives of Dermatological Research. 296 (5), 203-211 (2004).
  52. Ponec, M., et al. The formation of competent barrier lipids in reconstructed human epidermis requires the presence of vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  53. Savini, I., et al. Characterization of keratinocyte differentiation induced by ascorbic acid: Protein kinase C involvement and vitamin C homeostasis. Journal of Investigative Dermatology. 118 (2), 372-379 (2002).
  54. Pasonen-Seppänen, S., et al. Vitamin C enhances differentiation of a continuous keratinocyte cell line (REK) into epidermis with normal stratum corneum ultrastructure and functional permeability barrier. Histochemistry and Cell Biology. 116 (4), 287-297 (2001).
  55. Beer, H. D., et al. Expression and function of keratinocyte growth factor and activin in skin morphogenesis and cutaneous wound repair. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 34-39 (2000).
  56. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of structural biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  57. Rice, R. H., Thacher, S. M. Involucrin: a constituent of cross-linked envelopes and marker of squamous maturation. Biology of the Integument. , 752-761 (1986).
  58. Elias, P. M., Barrier Feingold, K. R. Skin Barrier. , (2011).
  59. Marionnet, C., et al. Morphogenesis of dermal-epidermal junction in a model of reconstructed skin: beneficial effects of vitamin C. Experimental Dermatology. 15 (8), 625-633 (2006).
  60. Frikke-Schmidt, H., Lykkesfeldt, J. Keeping the intracellular vitamin C at a physiologically relevant level in endothelial cell culture. Analytical Biochemistry. 397 (1), 135-137 (2010).
  61. Castro-Muñozledo, F., Hernández-Quintero, M., Marsch-Moreno, M., Kuri-Harcuch, W. Cultivation, serial transfer, and differentiation of epidermal keratinocytes in serum-free medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 236 (1), 167-172 (1997).
  62. De Vuyst, E., et al. Reconstruction of normal and pathological human epidermis on polycarbonate filter. Epidermal Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 191-201 (2013).
  63. Chen, R. H., Zhu, J., Zhang, R. Z., Wang, S. Y., Li, Y. The tolerance of human epidermal cells to trypsinization in vitro. Cell and Tissue Banking. 21 (2), 257-264 (2020).
  64. Pohanish, R. P. Sittig's Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and Carcinogens. 2, (2012).
  65. Tsaousis, K. T., et al. Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clinical and Experimental Ophthalmology. 41 (5), 484-490 (2013).
  66. Kim, S. I., et al. Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters. Analytical Biochemistry. 492, 8-12 (2016).
  67. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  68. Fartasch, M., Ponec, M. Improved barrier structure formation in air-exposed human keratinocyte culture systems. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 366-374 (1994).
  69. Bouwstra, J. A., Honeywell-Nguyen, P. L., Gooris, G. S., Ponec, M. Structure of the skin barrier and its modulation by vesicular formulations. Progress in Lipid Research. 42 (1), 1-36 (2003).
  70. Ponec, M., Boelsma, E., Gibbs, S., Mommaas, M. Characterization of reconstructed skin models. Skin Pharmacology and Physiology. 15 (1), 4-17 (2002).
  71. Hubaux, R., Wauters, A., Chrétien, A., Poumay, Y., Salmon, M. Reconstructed human epidermis response to urban particulate matter activates multiple stress-related pathways and impacts the skin barrier function. 23th IFSCC Conference. , 125-134 (2017).
  72. Lin, Y. -C., et al. Testing method development and validation for in vitro skin irritation testing (SIT) by using reconstructed human epidermis (RhE) skin equivalent - EPiTRI®. Alternatives to Animal Testing. , 8-19 (2019).
  73. Alexander, F. A., Eggert, S., Wiest, J. Skin-on-a-chip: Transepithelial electrical resistance and extracellular acidification measurements through an automated air-liquid interface. Genes. 9 (2), 114 (2018).
  74. van den Bogaard, E., et al. Perspective and consensus opinion: good practices for using organotypic skin and epidermal equivalents in experimental dermatology research. Journal of Investigative Dermatology. 141 (1), 203-205 (2021).
  75. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An in vitro skin irritation test (SIT) using the EpiDerm reconstructed human epidermal (RHE) model. Journal of Visualized Experiments. (29), e1366 (2009).
  76. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical pharmacology advances and applications. 8, 163-176 (2016).
  77. De Wever, B., Kurdykowski, S., Descargues, P. Human skin models for research applications in pharmacology and toxicology: introducing nativeSkin, the "missing link" bridging cell culture and/or reconstructed skin models and human clinical testing. Applied In Vitro Toxicology. 1 (1), 26-32 (2015).
  78. Klicks, J., von Molitor, E., Ertongur-Fauth, T., Rudolf, R., Hafner, M. In vitro skin three-dimensional models and their applications. Journal of Cellular Biotechnology. 3 (1), 21-39 (2017).
  79. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 22 (12), 695-705 (1986).
  80. Johansen, C. Generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Journal of Visualized Experiments. (130), e56863 (2017).
  81. Boelsma, E., Verhoeven, M. C. H., Ponec, M. Reconstruction of a human skin equivalent using a spontaneously transformed keratinocyte cell line (HaCaT). Journal of Investigative Dermatology. 112 (4), 489-498 (1999).
  82. Zhao, X., et al. Photocrosslinkable gelatin hydrogel for epidermal tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (1), 108-118 (2016).
  83. Peura, M., et al. Paracrine factors from fibroblast aggregates in a fibrin-matrix carrier enhance keratinocyte viability and migration. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (2), 658-664 (2010).
  84. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCat keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology. 112 (3), 343-353 (1999).
  85. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue engineering. Part C, Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  86. Alameda, J. P., et al. IKKα regulates the stratification and differentiation of the epidermis: Implications for skin cancer development. Oncotarget. 7 (47), 76779-76792 (2016).
  87. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology and Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  88. Staiano-Coico, L., et al. Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing. Journal of Experimental Medicine. 178 (3), 865-878 (1993).
  89. Egelrud, T. Desquamation in the stratum corneum. Acta Dermato-Venereologica. 80, Supp 208 44-45 (2000).
  90. Jean, J., Lapointe, M., Soucy, J., Pouliot, R. Development of an in vitro psoriatic skin model by tissue engineering. Journal of Dermatological Science. 53 (1), 19-25 (2009).
  91. Lotte, C., Patouillet, C., Zanini, M., Messager, A., Roguet, R. Permeation and skin absorption: reproducibility of various industrial reconstructed human skin models. Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 15, Suppl 1 18-30 (2002).
  92. Ponec, M., Weerheim, A., Lankhorst, P., Wertz, P. New acylceramide in native and reconstructed epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 581-588 (2003).
  93. Thakoersing, V. S., et al. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  94. Thakoersing, V. S., et al. presence of monounsaturated fatty acids in the stratum corneum of human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  95. Van Smeden, J., et al. Combined LC/MS-platform for analysis of all major stratum corneum lipids, and the profiling of skin substitutes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (1), 70-79 (2014).
  96. Mieremet, A., et al. Human skin equivalents cultured under hypoxia display enhanced epidermal morphogenesis and lipid barrier formation. Scientific Reports. 9 (1), 7811 (2019).
  97. Mieremet, A., et al. Unravelling effects of relative humidity on lipid barrier formation in human skin equivalents. Archives of Dermatological Research. 311 (9), 679-689 (2019).
  98. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., Van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by Chitosan modulated dermal matrices. PLoS ONE. 12 (3), 0174478 (2017).
  99. Mieremet, A., et al. Contribution of palmitic acid to epidermal morphogenesis and lipid barrier formation in human skin equivalents. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6069 (2019).
  100. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal fifferentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  101. De Vuyst, E., Salmon, M., Evrard, C., Lambert de Rouvroit, C., Poumay, Y. Atopic dermatitis studies through in vitro models. Frontiers in Medicine. 4, 119 (2017).
  102. Danso, M. O., et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 134 (7), 1941-1950 (2014).
  103. Soboleva, A. G., Mezentsev, A., Zolotorenko, A., Bruskin, S., Pirusian, E. Three-dimensional skin models of psoriasis. Cells Tissues Organs. 199 (5-6), 301-310 (2014).
  104. Desmet, E., Ramadhas, A., Lambert, J., Gele, M. Van In vitro psoriasis models with focus on reconstructed skin models as promising tools in psoriasis research. Experimental Biology and Medicine. 242 (11), 1158-1169 (2017).
  105. Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Past, present and future of in vitro 3D reconstructed inflammatory skin models to study psoriasis. Experimental Dermatology. 27 (5), 512-519 (2018).
  106. Pendaries, V., et al. Knockdown of filaggrin in a three-dimensional reconstructed human epidermis impairs keratinocyte differentiation. Journal of Investigative Dermatology. 134 (12), 2938-2946 (2014).
  107. Niehues, H., et al. Epidermal equivalents of filaggrin null keratinocytes do not show impaired skin barrier function. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (6), 1979-1981 (2017).
  108. Reuter, C., Walles, H., Groeber, F. Preparation of a three-dimensional full thickness skin equivalent. Methods in Molecular Biology. 1612, 191-198 (2017).
  109. Bataillon, M., et al. Characterization of a new reconstructed full thickness skin model, t-skinTM, and its application for investigations of anti-aging compounds. International Journal of Molecular Sciences. 20 (9), 2240 (2019).
  110. Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding. Journal of Visualized Experiments. (96), e52576 (2015).
  111. Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. Journal of Visualized Experiments. (54), e2937 (2011).
  112. Müller, I., Kulms, D. A 3D organotypic melanoma spheroid skin model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57500 (2018).
  113. Wei, Z., et al. Two-dimensional cellular and three-dimensional bio-printed skin models to screen topical-use compounds for irritation potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 109 (2020).
  114. Derr, K., et al. Fully three-dimensional bioprinted skin equivalent constructs with validated morphology and barrier function. Tissue Engineering - Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  115. Frankart, A., et al. Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface. Experimental Dermatology. 21 (11), 871-875 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 171، البشرة البشرية المعاد تشكيلها، مكافئات البشرة البشرية، خلايا القرنية الأولية، البشرة، في الدراسات المختبرية.
زراعة بشرة بشرية ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها على نطاق واسع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dijkhoff, I. M., Petracca, B.,… More

Dijkhoff, I. M., Petracca, B., Prieux, R., Valacchi, G., Rothen-Rutishauser, B., Eeman, M. Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale. J. Vis. Exp. (171), e61802, doi:10.3791/61802 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter