Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61802
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3,4, 1, 2
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg, 2Dow Silicones Belgium SRL, 3Department of Biomedical and Specialist Surgical Sciences, University of Ferrara, 4Department of Animal Sciences, Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

Summary

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om driedimensionale gereconstitueerde menselijke epidermis op een reproduceerbare en robuuste manier te cultiveren. Bovendien kenmerkt het de structuur-functierelatie van het epidermale barrièremodel. De biologische reacties van de gereconstitueerde menselijke epidermis op pro-inflammatoire stimuli worden ook gepresenteerd.

Abstract

Een driedimensionaal menselijk epidermismodel gereconstrueerd uit neonatale primaire keratinocyten wordt gepresenteerd. Hierin wordt een protocol beschreven voor het teeltproces en de karakterisering van het model. Neonatale primaire keratinocyten worden ondergedompeld op doorlatende polycarbonaatinzetstukken gekweekt en drie dagen na het zaaien naar de lucht-vloeistofinterface gebracht. Na veertien dagen stimulatie met gedefinieerde groeifactoren en ascorbinezuur in een hoog calciumkweekmedium, is het model volledig gedifferentieerd. Histologische analyse onthulde een volledig gestratificeerd epidermis, die de morfologie van de inheemse menselijke huid nabootste. Om het model en zijn barrièrefuncties te karakteriseren, werden eiwitniveaus en lokalisatie specifiek voor keratinocytdifferentiatie in een vroeg stadium (d.w.z. keratine 10), differentiatie in een laat stadium (d.w.z. involucrine, loricrine en filaggrin) en weefseladhesie (d.w.z. desmogleine 1) beoordeeld door immunofluorescentie. De integriteit van de weefselbarrière werd verder geëvalueerd door transepitheliale elektrische weerstand te meten. Reconstructed menselijke epidermis reageerde op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. lipopolysaccharide en tumornecrosefactor alfa), wat leidde tot een verhoogde afgifte van cytokine (d.w.z. interleukine 1 alfa en interleukine 8). Dit protocol vertegenwoordigt een eenvoudige en reproduceerbare in vitro methode om gereconstrueerde menselijke epidermis te cultiveren als een instrument om milieueffecten en een breed scala aan huidgerelateerde studies te beoordelen.

Introduction

De epidermis is de buitenste laag van de huid, op de directe interface tussen het menselijk lichaam en de externe omgeving. De belangrijkste functies zijn bescherming en hydratatie1. De opperhuid fungeert als een effectieve fysieke barrière tegen externe middelen en voorkomt overmatig waterverlies uit het lichaam. Deze huidfuncties zijn voornamelijk afhankelijk van de cellulaire opstelling in de buitenste lagen van de huid, de samenstelling en organisatie van intercellulaire lipiden2. De epidermis bestaat voornamelijk uit keratinocyten die naar boven migreren naar de buitenkant van het weefsel en differentiatie ondergaan. Er zijn 4-5 epidermale lagen die worden gekenmerkt door hun differentiatiestadium. Van binnen naar buiten beginnen de epidermale lagen van de levensvatbare epidermis, d.w.z. het stratum basale (SB), het stratum spinosum (SS) en het stratum granulosum (SG), tot de niet-levensvatbare bovenste laag, d.w.z. het stratum corneum (SC)3. De basale laag bestaat voornamelijk uit proliferatie van keratineverrijkte keratinocyten, die bij differentiatie door het SS migreren4. Tijdens de rijping van keratinocyt treden verschillende veranderingen in eiwitexpressie en structuur op. Keratinocyten hechten zich door de vorming van desmosomale verbindingen5. In de SG wordt de generatie van lamellaire lichamen geïnitieerd. Ze bestaan uit lipidenprecursoren en enzymen die cruciaal zijn voor de vorming van de huidbarrièrefunctie6. De SG wordt ook gekenmerkt door de aanwezigheid van keratohyalinekorrels in het cytoplasma van de keratinocyten. Op het raakvlak met de SC wordt het gehalte van de lamellaire lichamen geëxtrudeerd in de intercellulaire ruimtes en de niet-polaire lipiden zoals ceramiden, cholesterol en vrije vetzuren organiseren zich in gestapelde lamellaire lipide tweelagen om de extracellulaire lipidenmatrix te vormen7. In de SC verliezen cellen alle cellulaire organellen, inclusief de kern, als gevolg van enzymatische afbraakprocessen en nemen ze een afgeplatte morfologie aan. Ze zijn omgeven door een gelikte envelop van onderling verbonden eiwitlagen en worden corneocyten8,9genoemd . Desmosomale componenten zijn gekruist aan de cornified envelop om corneodesmosomen te vormen en de corneocyten aan elkaar te binden. Het resulterende epitheel wordt voortdurend vernieuwd uit stamcellen, met een omlooptijd van ongeveer 5-6 weken10. Het differentiatieproces van de keratinocyten, wat resulteert in een volledig gestratificeerd epidermis, is cruciaal voor de vorming van de barrièrefunctie van de huid11.

Tijdens wondvorming en ontsteking induceren keratinocyten veranderingen in adhesiemoleculen en oppervlaktereceptoren en veroorzaken pro-inflammatoire reacties via afscheiding van cytokinen, chemokinen en antimicrobiële peptiden12. De huid is niet alleen een fysieke barrière tegen exogene stoffen; het fungeert ook als een immuunsensor bij blootstelling aan ziekteverwekkers. Bovendien reguleert het de verspreiding van verschillende stoffen over de lagen, zoals het watergehalte om het menselijk lichaam te beschermen tegen uitdroging. De huid is ook betrokken bij de synthese van vitamine D en heeft verschillende andere metabolische functies3,13,14.

Om de nadelige effecten van exogene stoffen te beoordelen, vertrouwen toxicologen al tientallen jaren op dierproeven, maar tegenwoordig is het niet de voorkeursbenadering. Naast het beperkte voorspellend vermogen voor menselijke toxiciteit, brengen diermodellen tal van ethische kwesties met zich mee. Het verbod op dierproeven in de cosmetische industrie en de aanbeveling om het 3R-beginsel (d.w.z. vervanging, vermindering en verfijning) in onderzoek te volgen, hebben geleid tot de ontwikkeling van alternatieve testmethoden op basis van in vitro benaderingen15. De eerste in vitro huidcelmodellen zijn al beschreven in de jaren 90, en een indrukwekkende ontwikkeling van eenvoudige menselijke keratinocyt monoculturen tot volledig gedifferentieerde epidermis- en volledige diktemodellen is bereikt16. Tegenwoordig is huidweefseltechnologie belangrijk geworden op zowel farmaceutisch als dermato-cosmetisch gebied. In de afgelopen twee decennia hebben verschillende bedrijven driedimensionale (3D) gereconstrueerde menselijke epidermis (RhE) gecommercialiseerd die gestandaardiseerde en reproduceerbare hulpmiddelen voor huidgerelateerde studies vertegenwoordigen. Verschillende commerciële RhE-modellen worden geaccepteerd voor in vitro huidtesten van chemische stoffen volgens oeso-richtlijnen voor het testen van huidirritatie17,18 (d.w.z. testrichtlijn 43919) en huidcorrosie20 (d.w.z. testrichtlijn 43121). De in-vitrotest voor huidsensibilisatie22 (d.w.z. SENS-IS-test) bevindt zich momenteel in het goedkeuringstraject en wordt door collega's beoordeeld23. Er zijn ook tal van andere tests ontwikkeld die commerciële RhE-modellen gebruiken, om fototoxiciteit24te evalueren, om medicijnformuleringen25,cosmetische formuleringen en actieve ingrediënten te testen26, om de huidbarrièrefunctie27 te bestuderen en om de biologische reactie op omgevingsstressoren28,29,30,31te testen .

Naast commercieel verkrijgde 3D-huidmodellen hebben meerdere onderzoeksgroepen hun eigen RhEs32,33,34,35,36,37ontwikkeld . In-house RhEs bieden het voordeel voor het beheersen van de cultuuromstandigheden volgens het doel van de studie. In het bijzonder kunnen onderzoekers het type en de bron van de keratinocyten selecteren die moeten worden gebruikt voor de reconstitutie van hun 3D-epidermale model (d.w.z. primair versus vereeuwigd, neonatale versus leeftijd, enkele versus gepoolde willekeurige donoren, geslacht, etniciteit, individuele leefgewoonten zoals roken, enz.). Ze hebben de mogelijkheid om de samenstelling van het kweekmedium te variëren en groeifactoren, vitamines of andere verbindingen op te nemen die de expressie van doeleiwitten of lipiden kunnen moduleren. Met in-house RhEs kunnen onderzoekers ook biologische reacties en biomechanische eigenschappen onderzoeken als functie van de differentiatietoestand van het 3D-model. Naast deze intuïtieve parameters zijn er voortdurende inspanningen om de complexiteit van 3D-huidmodellen te vergroten en fysiologisch relevanter te maken, bijvoorbeeld door andere epidermale celtypen toe te voegen (bijv. melanocyten en immuuncellen)38,39, door de keratinocyten bovenop een fibroblast-bevolkte collageenmatrix40 , 41,42te cultiveren en door componenten van het vasculaire netwerk43,44,45op te nemen .

Hoewel het mogelijk is om de cultuuromstandigheden af te stemmen op specifieke behoeften, zijn er parameters die moeten worden gerespecteerd om zowel de kwaliteit als de relevantie van een RhE te garanderen. Om RhE-weefsels te kweken, worden normale menselijke epidermale keratinocyten (NHEKs) gezaaid in specifieke permeabele kweekinzetstukken waarvan het poreuze synthetische membraan de putten in twee compartimenten scheidt, d.w.z. het apicale en basolaterale compartiment. De porositeit van het membraan (d.w.z. een poriegrootte van 0,4 μm) is zodanig dat het de vorming van een celmonolaag in het apicale compartiment mogelijk maakt zonder migratie van cellen naar de basale insertzijde, en het voeden van de keratinocyten met essentiële voedingsstoffen uit het kweekmedium in het basolaterale compartiment. Aan het begin van het reconstitutieproces worden NHEK's een paar dagen onder water gekweekt om hun hechting op het membraan mogelijk te maken. Het calciumgehalte in beide compartimenten is verhoogd in vergelijking met de calciumconcentratie die wordt gebruikt voor de 2D-cultuur van NHEKs om de proliferatie van cellen te vertragen en in plaats daarvan hun differentiatie te bevorderen46. Een epidermale calciumgradiënt is essentieel om de barrièrevorming en homeostase te reguleren47,48. Hoge calciumspiegels (d.w.z. tot 1,5 mM) bevorderen de vorming van intercellulaire verbindingen en moduleren de vorming van de cornified envelop tijdens terminale differentiatie49. Zodra keratinocyten een continue en nauw hechtende monolaag op het ondersteunende membraan vormen, wordt het medium uit het apicale compartiment verwijderd en gaat het kweekproces verder op de lucht-vloeistofinterface (ALI) om stratificatie te stimuleren en een epidermale barrière vast te stellen50,51. Specifieke kweekomstandigheden zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van een volledig gelaagd epitheel36. Tijdens het reconstitutieproces bij ALI wordt het medium in het basolaterale compartiment aangevuld met keratinocytgroeifactor (KGF), insuline, calcium en ascorbinezuur. Ascorbinezuur speelt een belangrijke rol bij de vorming van een geschikte SC-lipidebarrière, die sterk lijkt op die van de inheemse menselijke huid52. Keratinocyten gekweekt in ascorbinezuur-aangevuld medium tonen een gedifferentieerd fenotype, met een verhoogd aantal keratohyalinekorrels, evenals georganiseerde intercellulaire lipide lamellen in de interstices van de corneocyten52. Een dergelijke suppletie is essentieel om de epidermale barrièrefunctie te verbeteren door het gehalte aan cornified envelope te verhogen en uitputting van hydrofiele antioxidantvoorraden53,54te voorkomen . KGF, een belangrijke paracrinemediator van epidermale proliferatie en differentiatie, wordt gebruikt om de NHEKs55te stimuleren.

De belangrijkste nadelen van interne RhEs zijn het verlies van standaardisatie tussen onderzoeksinstellingen en verhoogde arbeidsintensiteit en tijdsconsumptie (tot 3 weken in vergelijking met de kant-en-klare commerciële modellen). Het doel van dit document is om deze nadelen aan te pakken en de basis voor de productie op grotere schaal te leggen. Naast de bovengenoemde voordelen van interne RhEs, is het huidige protocol gericht op het verminderen van de intra- en intervariabiliteit tussen weefsels, het verminderen van besmettingsrisico's en het stroomlijnen van het teeltproces.

Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en robuuste methode om RhEs te kweken met neonatale NHEKs. Bovendien toont het representatieve resultaten van de karakterisering van de RhEs-morfologie, barrière-integriteit en expressie van eiwitten die specifiek zijn voor epidermale differentiatie. RhEs morfologische structuur werd onderzocht met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Om de barrière-integriteit te evalueren, werden de transepidermaal elektrische weerstand (TEER) en de blootstellingstijd aan Triton X-100 gemeten om 50% van de levensvatbaarheid van het weefsel (ET50) te verminderen. De vorming van desmosomale verbindingen (d.w.z. desmogleine 1) werd geanalyseerd door immunofluorescentie (IF) om de hechting van keratinocyt te evalueren. De vorming van epidermale structurele eiwitten (d.w.z. involucrine, loricrine en filaggrin) werd geëvalueerd en gedetecteerd met IF. Deze eiwitten zijn betrokken bij de vorming van de sterk gekruiste eiwitschil die SC-corneocyten omringt en zijn als gevolg daarvan belangrijke markers voor epidermale differentiatie in een laat stadium56,57. Bovendien werd IF gebruikt om keratine 10 te analyseren, een eiwit dat werd geïnduceerd in gedifferentieerde cellen in het vroege stadium in SS58 en werd gevonden in alle gedifferentieerde lagen. Ten slotte werd de reactie van de RhE op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. lipopolysaccharide en tumornecrosefactor alfa) onderzocht. De niveaus van interleukine 1 alfa (IL-1α) en interleukine 8 (IL-8) werden gemeten in de celkweekmedia, met behulp van enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISA).

Protocol

Nationale en internationale ethische overwegingen en voorwaarden met betrekking tot het gebruik van menselijke weefsels of cellen beoordelen en naleven voordat u onderzoeksactiviteiten met betrekking tot dit protocol plant en uitvoert.
OPMERKING: Alle stappen van dit protocol moeten worden uitgevoerd in aseptische omstandigheden. Bioveiligheid Niveau 2 praktijken zijn de minimale vereiste voor de teelt van RhEs. Bij het hanteren van de in dit protocol beschreven chemicaliën/reagentia moeten alle nodige veiligheidsmaatregelen worden genomen.

1. Voorbereiding van celkweekmedia

OPMERKING: Er zijn drie verschillende soorten serumvrije kweekmedia die worden gebruikt voor de teelt van RHE's (tabel 1): i) het basale medium met een laag calciumgehalte (60 μM Ca2+) dat wordt gebruikt voor de 2D-cultuur van NHEKs; ii) het ondergedompelde medium met een hoog calciumgehalte (1,5 mM Ca2+) dat wordt gebruikt voor het zaaien van NHEK's in het celkweekinzetsysteem; en (iii) het lucht-vloeistof interface (ALI) medium met een hoog calciumgehalte (1,5 mM Ca2+),ascorbinezuur en keratinocyt groeifactor (KGF).

Gemiddeld Middelgrote informatie Vereiste hoeveelheid
Basaal medium Keratinocyt groeimedium 36 ml/24 putten
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antibioticum-antimycoticum
Ondergedompeld medium Keratinocyt groeimedium 36 ml/24 putten
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antibioticum-antimycoticum
+ 1,5 mM Ca2+
Lucht-vloeistof interface medium Keratinocyt groeimedium 216 ml/24 putten
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antibioticum-antimycoticum
+ 1,5 mM Ca2+
+ 50 μg/ml ascorbinezuur
+ 10 ng/ml keratinocyt groeifactor

Tabel 1. Overzichtstabel van de verschillende cultuurmedia die worden gebruikt om RhEs te cultiveren. Lijst van verschillende cultuurmedia met supplementen.

  1. Bereid het basale medium voor.
    1. Vul de fles van 500 ml keratinocytgroeimedium (tabel metmaterialen)aan met 5 ml menselijke keratinocytgroeisupplementen (HKGS) om de eindconcentraties van 0,2% [v/v] runderfysuitextract (BPE), 0,2 ng/ml humane recombinante epidermale groeifactor (EFG), 0,18 μg/ml hydrocortison te bereiken 5 μg/ml rundertransferrine en 0,01 μg/ml recombinante humane insuline-achtige groeifactor-I (IGF-I).
    2. Voeg 5 ml 100x antibiotica-antimycotische oplossing toe met 10.000 eenheden/ml penicilline, 10.000 μg/ml streptomycine en 25 μg/ml amfotericine B.
  2. Bereid het ondergedompelde medium voor.
    1. Vul de fles van 500 ml keratinocytgroeimedium (tabel metmaterialen)aan met 5 ml HKGS om de eindconcentraties van 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humaan recombinant EFG, 0,18 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml rundertransferrine en 0,01 μg/ml humaan recombinant EGF, 0,18 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml rundertransferrine en 0,01 μg/ml μg rundertransferrine te bereiken.
    2. Voeg 5 ml 100x antibioticum-antimycotische oplossing toe.
    3. Voeg 5 ml van een cacl2 (calciumchloride) 0,144 m toe om een eindconcentratie van 1,5 mM Ca2+te bereiken.
      OPMERKING: De calciumconcentratie is al verhoogd tijdens de ondergedompelde fase om de differentiatie van de keratinocyten te stimuleren en het stratificatieproces te starten49.
  3. Bereid het lucht-vloeistof interface (ALI) medium voor.
    1. Vul één fles van 500 ml keratinocytgroeimedium (tabel metmaterialen)aan met 5 ml HKGS om de eindconcentraties van 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humaan recombinant EFG, 0,18 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml rundertransferrine en 0,01 μg/ml humaan recombinant EGF te bereiken.
    2. Voeg 5 ml 100x antibioticum-antimycotische oplossing toe.
    3. Voeg 5 ml van een 0,144 M CaCl2 stamoplossing toe om een eindconcentratie van 1,5 mM Ca2+te bereiken .
    4. Voeg 1 ml ascorbinezuuroplossing van 25 mg/ml toe om een eindconcentratie van 50 μg/ml ascorbinezuur te bereiken.
    5. Voeg 50 μL van een 100 μg/ml KGF toe aan 1% [w/v] runderserumalbumine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 10 ng/ml KGF te bereiken.
      OPMERKING: Aangezien ascorbinezuur gevoelig is voor oxidatie, wordt aanbevolen om een stabiel ascorbinezuurderivaat te gebruiken, zoals magnesium l-ascorbyl-2-fosfaat59 of L-ascorbinezuur 2-fosfaat sesquimagnesium60. Als ascorbinezuur wordt gebruikt, wordt aanbevolen om het ALI-medium vers aan te vullen met ascorbinezuur voor elke vernieuwing.

2. Cultuur van NHEKs

OPMERKING: Aangezien primaire menselijke keratinocyten proliferatieve blijven bij hun vierde of vijfde passage61,worden NHEKs in hun derde passage gebruikt voor de teelt van RhEs. Primaire keratinocyten moeten zeer zorgvuldig worden behandeld vanwege hun hoge gevoeligheid. Zorgvuldig en langzaam pipetten van celsuspensingen op elk moment is erg belangrijk, om de toestand van de cellen niet te verstoren.

  1. Ontdooi een flacon met 1 x 106 cryopreserved NHEKs in een waterbad bij 37 °C, door een deel van de flacon in het water onder te dompelen. Incubeer de flacon gedurende 1-2 minuten in het waterbad, totdat slechts een klein stukje ijs zichtbaar is.
    LET OP: Dompel de hele flacon niet onder in het waterbad om verontreinigingen te voorkomen. Ontdooi de cellen niet langer dan 2 minuten; dit kan de levensvatbaarheid van de cel verminderen. Veeg de flacon af met een 70% ethanoloplossing voordat u de buis in de laminaire kap brengt.
  2. Resuspend de cellen zeer zorgvuldig, door pipetting op en neer 2-3 keer. Breng de celsuspensie over in twee T75-kolven met in totaal 15 ml voorverwarmd ontdooimedium, wat resulteert in een zaaidichtheid van 6,7 x 104 cellen/cm2.
    OPMERKING: Voor de eerste twee passages en het ontdooien van cryopreserved NHEKs wordt celkweekmedium gebruikt volgens de aanbevelingen van de leverancier.
  3. Plaats de kolven in de celkweek-incubator (37 °C, 5% CO2en 95% relatieve vochtigheid (RH)).
  4. Vervang na ongeveer 24 uur het ontdooimedium door het basale medium om dimethylsulfoxide (DMSO) uit de keratinocytvriesoplossing te verwijderen.
  5. Ververs het basale medium om de twee dagen.
  6. Na 4-6 dagen teelt moeten de cellen ongeveer 80% samenvloeien en klaar zijn om in inserts te zaaien voor de teelt van RhEs.
    OPMERKING: Keratinocyten moeten worden gekweekt tot maximaal 80% samenvloeiing om hun proliferatieve capaciteit te behouden62. Bij het aantal te ontdooien cellen moet rekening worden gehouden met verschillende parameters, zoals het celpassagenummer, de levensvatbaarheid van de cel bij het ontdooien, de zaaiefficiëntie en de verdubbelingstijd.

3. Zaaien van NHEKs

OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor gebruik binnen een 24-well carrier plate formaat. Als andere plaatformaten nodig zijn (bijv. 12-well of 6-well formaat), moeten optimalisaties in de seeding density en medium volume worden overwogen. Figuur 1 geeft een overzicht van een voorgestelde tijdlijn voor rhe-teelt en toont de teeltomstandigheden.

Figure 1
Figuur 1: Schematische tijdlijn van het reconstitutieprotocol. Presentatie van het RhE-modelvoorbereiding, teeltproces en toepassing (blootstelling aan chemische stof). Het schema bevat de juiste celcultuurmediatypen voor elke stap. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

  1. Vul 24-putplaten voor met 1,5 ml ondergedompeld medium, idealiter met behulp van een dispenserpipet.
  2. Verwijder het basale medium uit de T75-kolven die worden gebruikt voor de kweek van de NHEKs.
  3. Spoel de cellen af door aan elke T75-kolf 5 ml voorverwarmde PBS toe te voegen.
  4. Verwijder PBS uit de kolven.
    OPMERKING: Deze stap is cruciaal, omdat het medium eiwitten en calcium bevat die de trypsineactiviteit remmen.
  5. Voeg 2-3 ml voorverwarmd 0,05% [v/v] trypsine/ethyleendiaminetetra azijnzuur (EDTA) toe aan elke T75-kolf. Zorg ervoor dat de trypsineoplossing gelijkmatig over het celkweekgebied van de kolf wordt verdeeld.
    LET OP: Het volume van 2 ml is gebaseerd op de hierboven genoemde samenvloeiing van 80%. Gebruik 3 ml voor kolven met een hogere samenvloeiing.
  6. Plaats de kolven gedurende 4 minuten in de celkweek-incubator (37 °C, 5% CO2en 95% RV). Controleer of de cellen loskomen met behulp van de microscoop bij een vergroting van 10x. Rap de kolf tegen de palm van de hand om de cellen te helpen los te komen van het oppervlak van de kolf. Losgemaakte cellen kunnen worden waargenomen als afgeronde cellen die in de trypsineoplossing zweven.
    LET OP: Incubeer de cellen in trypsine niet langer dan 6 minuten. Over-trypsinization kan de cellen beschadigen en hun therapietrouw verminderen63.
  7. Zodra alle cellen zijn losgemaakt, voegt u aan elke T75-kolf een gelijk volume (d.w.z. 2-3 ml) voorverwarmde trypsineremmer toe.
  8. Breng de celsuspensie over van de kolven naar een centrifugebuis.
  9. Spoel de kolven af met 5 ml voorverwarmde PBS en breng deze over naar de centrifugebuis met de celsuspensie.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de meeste cellen worden verzameld door het aantal restcellen in de kolven onder de microscoop te controleren. Het oppervlak van de kolf moet voor 95% leeg zijn. Als dit niet het geval is, is het mogelijk om de trypsinisatiestap (3.3-3.9) te herhalen. Merk echter op dat her trypsinisatie moet worden vermeden.
  10. Centrifugeer de geoogste cellen gedurende 5 min op 400 x g.
  11. Gooi het grootste deel van het supernatant voorzichtig weg en laat ongeveer 100-200 μL in de buis achter.
    LET OP: Aspireer de pellet niet tijdens deze procedure. 
  12. Resuspend de pellet van cellen voorzichtig in een laag volume ondergedompeld medium, pipetteer 5-10 keer op en neer om een uniforme celsuspensie te garanderen. Begin met een laag volume (d.w.z. 500 μL) om de vorming van celaggregaten te voorkomen en tel in totaal tot 1 ml ondergedompeld medium per eerste T75-kolf op.
    OPMERKING: Veeg de buis voorzichtig met de vingers om een deel van de celkorrel in het supernatant voorzichtig op te lossen.
  13. Tel de cellen in de suspensie met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode.
    1. Verdun 0,4% [v/v] trypan blauwe vlek en de celsuspensie in een verhouding van 1:1, door 10 μL van 0,4% [v/v] trypan blauwe vlek toe te voegen aan 10 μL celsuspensie. Voeg 10 μL van de oplossing toe aan een telschuif. Meet het aantal cellen onmiddellijk na het mengen van de celsuspensie met trypanblauw, omdat trypanblauw de levensvatbaarheid van de cel begint te verminderen na blootstelling langer dan 1 min65.
      LET OP: Trypan blauw bleek een potentieel mutageen, kankerverwekkend en teratogen64. Ga zorgvuldig om met de kleurstof en gooi het afval veilig weg volgens de plaatselijke laboratoriumvoorschriften.
      OPMERKING: Een alternatieve benadering van het gebruik van trypanblauw is de niet-gevaarlijke kleurstof Erythrosin B66.
  14. Verdun de celsuspensie met extra ondergedompeld medium om een concentratie van 3,525 x 105 cellen/ml in ondergedompeld medium te bereiken door het volume V2 toe te voegen zoals weergegeven in vergelijking 1:
    Equation 1
    C1 = getelde celconcentratie in de celsuspensie verkregen in 3,12 (cellen/ml)
    V1 = volume dat wordt gebruikt om de pellet van cellen in 3,12 (ml) te resuspenden
    C2 = gerichte celconcentratie in de suspensie (d.w.z. 3,525 x 105 cellen/ml)
    V2 = volume dat moet worden toegevoegd om de beoogde celconcentratie (ml) te bereiken
    OPMERKING: De oppervlakte van de aanbevolen kweekinzet is 0,47 cm2; daarom is de overeenkomstige zaaidichtheid 3,75 x 105 cellen/cm2.
  15. Voer een tweede celtelling (C3) uit van de verdunde oplossing verkregen in stap 3.14. Gebruik vergelijking 2 om het celsuspensievolume (V4) te berekenen dat in de kweekinvoeging moet worden gezaaid:
    Equation 2
    C3 = gerichte celconcentratie in de suspensie (d.w.z. 3,525 x 105 cellen/ml)
    V3 = gericht volume van de celsuspensie die in de kweekinzet moet worden gezaaid (d.w.z. 0,5 ml)
    C4 = getelde celconcentratie in de verdunde suspensie verkregen in 3,14 (cellen/ml)
    V4 = werkelijk volume van de celsuspensie die in de kweekinzet (ml) moet worden gezaaid
  16. Hang de 24 celkweekinzetstukken in de hoogste stand van de aanbevolen draagplaat en breng de draagplaat over op de 24-putplaat die voorgevuld is met ondergedompeld medium (zie 3.1).
    LET OP: Let er bij het overbrengen van de draagplaat op de multi-well plaat op dat er geen luchtbellen tussen het wisselplaatmembraan en het ondergedompelde medium uit het basale compartiment worden opgesloten, omdat dit de voeding van de cellen zal beïnvloeden en uiteindelijk de levensvatbaarheid en morfologie van de RhE in gevaar zal brengen.
  17. Voeg het bepaalde volume V4 (uit vergelijking 2) van de celsuspensie toe aan elke insert.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de omgekeerde pipettechniek te gebruiken om de celsuspensie nauwkeurig aan de kweekinzetstukken te geven.
    LET OP: Zorg ervoor dat u het membraan niet beschadigt bij het doseren van de celsuspensie in de kweekinzet. Een voorzorgsmaatregel is om de celsuspensie langs de wand van het wisselplaatsysteem af te geven zonder het oppervlak van het membraan aan te raken.
  18. Na het zaaien de 24-putplaten 10-15 minuten bij kamertemperatuur incuberen om een randeffect te overwinnen (d.w.z. niet-uniforme temperatuurverdeling tussen alle putten67). Verplaats de platen gedurende deze tijd niet.
  19. Breng de platen over naar de celkweekincubator (37 °C, 5% CO2en 95% RV). De cellen worden drie dagen onder water gehouden.
    OPMERKING: Om weefselvariabiliteit te voorkomen, moet u de platen na het zaaien niet in de incubator stapelen om ervoor te zorgen dat elke insert dezelfde hoeveelheid warmte ontvangt. Na drie dagen (d.w.z. tijdens ali-teelt) is stapelen van platen mogelijk.

4. Teelt bij Air-Liquid Interface

  1. Na een incubatie van drie dagen in de celkweek-incubator (37 °C, 5% CO2en 95% RV) stellen de cellen die zich aan het membraanoppervlak hebben vastgeklampt bloot aan de ALI door het ondergedompelde medium uit het apicale compartiment te verwijderen, bij voorkeur met behulp van een aspiratiesysteem en een glazen Pasteurpipet.
    OPMERKING: Als alternatief kan het ondergedompelde medium uit het apicale compartiment worden verwijderd met een handmatige micropipet.
  2. Vul nieuwe 24-putplaten met 1,5 ml vers voorverwarmd ALI-medium en breng de draagplaten met de kweekinzetstukken over naar de nieuwe multi-well platen.
  3. Breng de multi-well platen terug naar de celkweek incubator (37 °C, 5% CO2en 95% RV).
  4. Ververs het ALI-medium elke 2-3 dagen gedurende 14 dagen.
  5. Voer de vernieuwing in twee stappen uit: 1) maak een nieuwe plaat met 1,5 ml/put vers voorverwarmd ALI-medium en 2) breng de draagplaat over op de nieuwe plaat.
    LET OP: Tijdens de gehele reconstitutieprocedure kunt u het beste het deksel van de draagplaat niet verwijderen om de RhEs te beschermen tegen mogelijke verontreiniging.
    OPMERKING: De ALI-stap is cruciaal voor de ontwikkeling van een gelaagd epidermaal model omdat het terminale differentiatie van de keratinocyten68mogelijk maakt. Na het gaan naar ALI is een visuele controle van de inserts vereist, om te controleren of er 'lekkende weefsels' zijn: middelgrote druppeltjes op het weefseloppervlak die uit het basolaterale compartiment komen. Als de lekkage optreedt op ALI dag 3, verwijder dan voorzichtig het medium uit de kweekinzet zonder het oppervlak van het weefsel aan te raken. Als de lekkage aanhoudt, wordt aanbevolen om lekkende weefsels weg te gooien, omdat dit een indicatie is dat er geen juiste barrièrevorming is in het RhE-model.
  6. Aan het einde van het reconstitutieproces kunnen de weefsels worden blootgesteld aan verschillende stressoren om bijvoorbeeld oxidatieve stress of ontsteking te veroorzaken. Tegelijkertijd kunnen ze worden behandeld met chemische verbindingen of cosmetische ingrediënten. OPMERKING: Tijdens de blootstelling/behandeling worden weefsels meestal in ondergedompeld medium gehouden vanaf ALI D14. Wanneer weefsels naar verwachting gedurende een lange periode (d.w.z. 48-72 uur) worden blootgesteld/behandeld, wordt aanbevolen (i) de blootstelling/behandeling eerder in het ALI-teeltproces, zoals D7-D9, te starten om het dunner worden van de levensvatbare lagen en de verdikking van de SC te voorkomen, en (ii) de weefsels in ALI-medium te incuberen, om de celproliferatie te blijven stimuleren.
  7. Verzamel voor rhe-oogsten de weefsels en het celkweekmedium op het moment dat het van belang is voor histologische analyse, levensvatbaarheidstesten, eiwit/RNA-extractie en enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISAs).

Representative Results

NHEKs gekweekt in 2D tonen een traditionele morfologie met een consistente veelhoekige vorm (Figuur 2A). Zoals hierboven beschreven, worden NHEKs in kweekinzetstukken gezaaid na het bereiken van een samenvloeiing van ongeveer 80%. De morfologie van de RhEs werd geanalyseerd met behulp van H&E-kleuring en TEM. Na 15 dagen bij ALI wordt een volledig gelaagd weefsel verkregen zoals aangegeven door de vier belangrijkste epidermale lagen: de SB, de SS, de SG en de SC (Figuur 2B). In de SB-laag hebben de cellen een zuilvormige vorm. Vanaf de tweede laag naar de bovenste lagen van de RhE onderscheiden NHE's zich zoals waargenomen door de veranderingen in de celmorfologie (van een zuilvormige vorm in de SB-laag, naar een stekelige vorm in de SS-laag). In de SG-laag hebben de cellen een meer afgeplatte vorm en vertonen ze keratohyalinekorrels (KG) die worden weergegeven als paarse stippen in het cytoplasma. Hun karakteristieke ronde en stellaire vorm wordt gemarkeerd door witte pijlen op de H&E-afbeelding(figuur 2C). De cellen in de SC, zijn terminaal gedifferentieerd en zijn volledig afgeplat en missen een celkern. De gelaagde RHE's hebben een totale dikte van 84,3 ± 2,4 μm en hun SC heeft een dikte van 19,6 ± 3,2 μm (figuur 2D). Deze waarden zijn vergelijkbaar met die gerapporteerd voor de inheemse menselijke huid, d.w.z. 60-120 μm en 10-20 μm, respectievelijk69. Het aantal levensvatbare lagen is 6-7, wat lager is in vergelijking met dat van de inheemse menselijke huid, namelijk ongeveer 7-1470. Ultrastructurele analyse van RhEs op verschillende tijdstippen in het reconstitutieprotocol (d.w.z. 7, 10, 13 en 15 dagen) onthult het cornificatieproces van de RhEs met een verhoogd aantal corneocytlagen in de loop van de tijd (Figuur 2E). Na 15 dagen bij de ALI wordt de SC van het RhE-weefsel gemaakt van ongeveer 15-25 lagen, wat vergelijkbaar is met de gerapporteerde waarde voor de inheemse menselijke huid (d.w.z. 15-20 lagen)69.

Figure 2
Figuur 2: Primaire keratinocyten en gereconstrueerde menselijke epidermis. (A) Fasecontrastmicroscopiebeeld van primaire keratinocyten alvorens op inserts te zaaien. Schaalbalk is 50 μm. (B-C) H&E helder veldmicroscopiebeeld van RhE. Schaalbalk is 50 μm (B) en 25 μm (C). (D) Kwantificering van de dikte van RhE en SC (gemiddelde ± SEM, n=3). (E) Transmissie elektronenmicroscopie beelden van RhE dwarsdoorsneden na 7, 10, 13 en 15 dagen bij ALI. Schaalbalk is 4 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Volgens hun differentiatiefase vertonen NHEK's die in 3D groeien verschillende eiwitexpressieprofielen op basis van hun differentiatiefase. De expressie van eiwitten die specifiek zijn voor keratinocytdifferentiatie in een vroeg stadium (d.w.z. keratine 10), differentiatie van keratinocyt in een laat stadium (d.w.z. involucrine, loricrine en filaggrin) en keratinocytadhesie (d.w.z. desmogleine 1) in RhEs werd bepaald met behulp van IF-kleuring. Involucrine-expressie lijkt zich meer voornamelijk in deSG-laagte bevinden, omdat de expressie ervan eerder tijdens het differentiatieproces wordt geïnitieerd (figuur 3D), terwijl filaggrin en loricrine worden uitgedrukt in de bovenste lagen (figuur 3B-C ). Keratine 10-expressie werd gevonden in alle levensvatbare lagen, behalve de SB-laag (Figuur 3E). RhEs vertonen functionele desmosomale verbindingen, zoals aangegeven door de expressie van desmogleine 1 in de intercellulaire ruimte van de levensvatbare epidermale lagen (Figuur 3F). Tot slot worden alle vijf markers uitgedrukt en gelokaliseerd in de juiste epidermale lagen en vertalen ze zich naar een gezond epidermale differentiatieproces.

Figure 3
Figuur 3: Epidermale differentiatie, weefseladhesie en weefselintegriteit van gereconstrueerde menselijke epidermis. (A) H&E bright field microscopie afbeelding van RhE. Confocale fluorescentiemicroscopiebeelden van (B) filaggrin (FLG), (C) loricrine (LOR), (D) involucrine (INV), (E) keratine 10 (K10) en (F) desmogleine 1 (DSG-1) weergegeven in magenta. Nuclei staining (DAPI) wordt weergegeven in blauw. De schaalbalk is 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De barrière-eigenschappen van het RhE-model werden onderzocht door zowel de levensvatbaarheid als de integriteit van het weefsel te beoordelen. De weefselintegriteit werd na 15 dagen bepaald door de TEER te meten met behulp van een voltohmmeter. De waarden van 2567 ± 415Ω,cm 2 die voor de RhE's zijn geregistreerd, vertalen de vorming van een continue barrière (figuur 4A). Deze waarden liggen binnen het bereik van de waarden die zijn gerapporteerd voor RhE-modellen71,72,73,74. Bovendien werd de vereiste blootstellingstijd voor een cytotoxische referentiestof (d.w.z. Triton X-100) om de levensvatbaarheid van het weefsel met 50% te verminderen (ET50) bepaald met een thiazolylblauw tetrazoliumbromide (MTT) test. De ET50-waarde gemeten voor de RhE was 2,1 uur. Deze waarde valt binnen het acceptatiebereik van andere 3D-epidermale modellen die in aanmerking komen voor een betrouwbare voorspelling van irritatieclassificatie (OESO-richtsnoer 439)19.

Figure 4
Figuur 4: Barrière-eigenschappen van gereconstrueerde menselijke epidermis. (A) Weefselintegriteit gemeten met transepitheliale elektrische weerstand (gemiddelde ± SEM, n=6). (B) ET50 bepaald door het meten van de levensvatbaarheid van weefsel (d.w.z. MTT-test) bij topische blootstelling aan 78,3 μL van 1% Triton X-100 (gemiddelde ± SEM, n=3).

Responsiviteit van RhEs werd onderzocht op bekende pro-inflammatoire stimuli. RhEs werden systemisch behandeld, d.w.z. toevoeging van stimuli in het medium van het basolaterale compartiment, met behulp van 100 μg/ml Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) en 40 ng/ml tumornecrosefactor alfa (TNF-α). Na 24 uur prikkels werd het celkweekmedium verzameld. De cytotoxiciteit werd gemeten met behulp van een lactaatdehydrogenase (LDH) test en vergeleken met waarden van een bekende membraanverstoorder, het Triton X-100 reinigingsmiddel (Figuur 5). Een significante toename (p < 0,05, eenrichtings ANOVA, dunnett's meervoudige vergelijkingstest) werd aangetoond in LDH-activiteit in RhEs behandeld met Triton X-100. LPS- en TNF-α behandelingen bleken beide niet cytotoxisch te zijn.

Figure 5
Figuur 5: De cytotoxiciteit gemeten via lactaatdehydrogenase (LDH) test. Gegevens worden gepresenteerd als relatieve waarden voor controle, onbehandelde weefsels (CTRL); gemiddelde ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Significantie werd getest met eenrichtings ANOVA, dunnett's meervoudige vergelijkingstest. Asterisk geeft statistisch significant verschil aan ten opzichte van CTRL, ****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De afgifte van interleukine 1 alfa (IL-1α) en interleukine 8 (IL-8) in het RhE-medium werd gekwantificeerd met behulp van ELISAs. Figuur 6 toont zowel de gekwantificeerde als relatieve IL-1α en IL-8 release door de RhEs bij uitdaging met LPS en TNF-α. LPS-behandeling resulteerde in een statistisch significante (p < 0,05, ongepaarde Student's T-test) geïnduceerde afgifte van IL-8 (9,6 ± 1,0 voudige toename) en IL-1α (2,7 ± 1,3 voudige toename). TNF-α veroorzaakten geen significant IL-8-afgifte, hoewel een tendens van verhoogde IL-8-niveaus werd waargenomen (2,3 ± 0,8 keer toename). TNF-α echter significant (p < 0,05, onbetaalde Student's T-test) il-1α release (1,8 ± 0,5 keer toename) geactiveerd.

Figure 6
Figuur 6: Pro-inflammatoire reacties in de gereconstrueerde menselijke epidermis. Concentraties van IL-8 worden door de RhE vrijgegeven bij een 24-uurs uitdaging met LPS (A) en TNF-α (B). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van relatieve waarde in vergelijking met controle, onbehandelde weefsels (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). De concentratie van IL-1α-afgifte van de RhE bij een 24-uurs uitdaging met LPS (D) en TNF-α (E). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van de relatieve waarde in vergelijking met CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). Significantie werd getest door een ongepaarde Student's T-test. Asterisk geeft statistisch significante verschillen aan ten opzichte van CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

RhEs worden wijd gebruikt als het onderzoeken hulpmiddelen op de farmaceutische en dermato-kosmetische gebieden36,75,76,77,78. Hoewel verschillende bedrijven dergelijke RhEs commercieel beschikbaar hebben gesteld, blijven ze duur en beperken ze de mogelijkheid om de teeltparameters te variëren als dat nodig is om nieuwe onderzoeksvragen aan te pakken. Dit document beschrijft de productieprocedure van interne RhEs op een robuuste en betrouwbare manier en biedt een gedetailleerde karakterisering van de verkregen weefsels om de relevantie van het model als alternatieve benadering van dierproeven te bevestigen.

Sommige stappen in het protocol zijn cruciaal om een goede keratinocytdifferentiatie en RhE-reproduceerbaarheid te garanderen. Dit kan worden uitgevoerd door gebruik te maken van de optimale cellen, medium type(s) en teeltomstandigheden. In het voorgestelde RhE-model werden neonatale NHEK's geselecteerd op hun gebrek aan antigene blootstelling, vergeleken met volwassen NHEKs. Bovendien waren keratinocyten beperkt tot kaukasische etniciteit om variabiliteit tussen soorten te voorkomen. Primaire keratinocyten worden meestal gebruikt voor hun vermogen om te differentiëren en te stratificeren79. Ze kunnen commercieel of door interne isolatie van volwassen huid worden verkregen80. De teelt van een cellijn (d.w.z. HaCaT) op een polycarbonaatmembraan, heeft aangetoond dat differentiatie mislukt en een verminderd vermogen heeft aangetoond om lipiden te synthetiseren die nodig zijn voor barrièrevorming81. De opname van verschillende cultuurmatrices, zoals hydrogels, collageen-, fibrine- en sferoïdenculturen, resulteerde echter in de succesvolle ontwikkeling van 3D-huidmodellen78,82,83,84,85,86. De vereeuwigde cellijnen, N/TERT, zijn geschikt gebleken voor de ontwikkeling van RhEs35. Primaire keratinocyten blijven proliferatieve bij hun vierde of vijfde passage61, daarom omvat het huidige protocol het gebruik van keratinocyten in hun derde passage. De Vuyst et al. hebben aangetoond dat de celzaderijdichtheid van belang is en voldoende moet zijn (d.w.z. ≥ 2,5x105 cellen/cm2) ervoor te zorgen dat het medium uit het basolaterale compartiment niet naar het apicale compartiment verspreidt. Een onvoldoende zaaidichtheid (d.w.z. < 2.5x105 cellen/cm2) kan resulteren in een onvermogen om een goede barrière te vormen, wat wordt aangegeven door de verspreiding van medium van het basolaterale naar het apicale compartiment, wat resulteert in ondergedompelde in plaats van ALI-cultuuromstandigheden62. Serumvrij keratinocytgroeimedium (zie Tabel met materialen) de voorkeur kreeg voor reproduceerbaarheidsdoeleinden, omdat het het voordeel biedt van het werken met een chemisch gedefinieerd medium en het risico op besmetting vermindert. Dit medium heeft een lagere calciumconcentratie (d.w.z. 60 μM) en stimuleert daarom de proliferatie van keratinocyten87. Verhoging van de calciumconcentratie (d.w.z. 1,5 mM) vanaf de eerste stap van de RhE-teelt, bevordert keratinocytdifferentiatie en huidbarrièrevorming en homeostase49. Bovendien wordt het ALI-medium aangevuld met ascorbinezuur, dat cruciaal is gebleken voor de vorming van SC-lipiden en om differentiatie te bevorderen52,53,54. Het ALI-medium bevat ook KGF, een groeifactor die wordt afgescheiden door fibroblasten die zich kunnen binden aan keratinocyt transmembrane receptoren en bij activering een dubbele rol heeft bij differentiatie en wondherstel55,88. Het is belangrijk om het ALI-medium met specifieke tijdsintervallen te vernieuwen, om een constante toevoer van verse voedingsstoffen aan de RhEs te bieden. Het gebruik van een draagplaatsysteem is cruciaal voor rhe-teelt op grotere schaal (d.w.z. 24 wisselplaten/plaat). Het biedt het voordeel van tijdsbesparing, het verminderen van het risico op besmetting en laat minder ruimte over voor de introductie van menselijke fouten. Het biedt ook de mogelijkheid om RhEs te culteren in een hoog volume media (d.w.z. 1,5 ml), wat het vereiste aantal ALI-mediumvernieuwingen vermindert. Bovendien biedt het de mogelijkheid om een volledige plaat wisselplaten over te brengen naar een plaat met vers medium, contact met de inzetstukken afzonderlijk te vermijden of het deksel van de plaat bloot te leggen.

Er zijn verschillende beperkingen van het RhE-model die moeten worden opgemerkt. In de inheemse menselijke huid is er een evenwicht tussen de proliferatie van keratinocyten in de basale laag en de loslating van corneocyten in de SC (d.w.z. desquamatie)89. In vitro vindt desquamatie echter niet plaats. Daarom blijven de corneocyten gehecht aan de RhE en vormen ze een dikke SC die minder fysiologisch relevant is. Daarom is er een beperkte teelttijdspanne van RhEs. Bovendien is dit RhE-model eenvoudig en eenvoudig, omdat het bestaat uit een enkel celtype, d.w.z. de keratinocyt, het meest voorkomende celtype van de epidermis. Er zijn echter andere celtypen die in de epidermis voorkomen, zoals melanocyten, dendritische cellen (d.w.z. Langerhans-cellen), T-cellen (bijv. CD8+ cellen) en Merkel-cellen13. Om de fysiologische relevantie van het huidmodel te verbeteren, hebben onderzoekers huidmodellen complexer gemaakt door melanocyten toe te voegen38 , immuuncellen39, of van de patiënt afgeleide cellen90. Men moet in gedachten houden dat de barrière-eigenschappen van menselijke huidmodellen anders zijn in vergelijking met de inheemse menselijke huid, met name vanwege een andere SC-lipidesamenstelling en een hogere barrièredoorlaatbaarheid 91,92,93,94,95. Verschillende studies hebben echter veranderingen in barrière-eigenschappen van menselijke huidmodellen gemeld door de teelt onder hypoxie96 of verminderde relatieve vochtigheid97, de modulatie van de dermale matrix met chitosan98, en wijziging van de vrije vetzuren in het kweekmedium99. Bovendien kunnen in zowel eenvoudige als complexere RhEs de cultuuromstandigheden en de gemiddelde samenstelling worden gemoduleerd om pathologische kenmerken na te bootsen. Door het model uit te dagen met cytokinen, een abnormale morfologie100 en veranderingen in gen- en eiwitexpressieniveaus kunnen worden vastgesteld die meestal worden waargenomen bij veel voorkomende huidaandoeningen, zoals atopische dermatitis en psoriasis35,101,102,103,104,105. Het dempen van specifieke genen in keratinocyten voordat het reconstitutieproces van het 3D-model wordt gestart, is een andere benadering die wordt gebruikt om kenmerken van huidaandoeningen na te bootsen en nieuwe therapeutische oplossingen te onderzoeken106,107. Naast het modelleren van alleen een epidermale laag, kan een dermaal compartiment in het model worden opgenomen (d.w.z. benoemde menselijke huidequivalenten of modellen met volledige dikte) door fibroblasten in een collageenmatrix te verankeren voorafgaand aan RhE-reconstitutie, waardoor het fysiologisch relevanter en geschikter wordt voor verouderings- en wondgenezingsgerelateerde studies108,109,110. Bovendien zijn tumorsferoïden toegevoegd aan menselijke huidequivalenten om de progressie van melanoom te bestuderen111,112. De nieuwste ontwikkelingen op het gebied van huidmodellen zijn bioprinten en skin-on-a-chip. Meerdere onderzoeksgroepen zijn er onlangs in geslaagd om (perfusable) bio-geprinte huidequivalenten te ontwikkelen45,113,114. Het voorgestelde protocol maakt gebruik van een 24-well formaat en een draagplaat, waardoor wisselplaten niet afzonderlijk moeten worden behandeld. De studieschaal is echter nog steeds vrij beperkt en mist automatisering. Door het gebruik van bioprinten of skin-on-a-chip te implementeren, kunnen kleinere huidmodellen worden gebruikt met meer geautomatiseerde processen en op grotere schaal.

De RhE beschreven in dit protocol heeft meerdere overeenkomsten met de reeds ontwikkelde en goed gekarakteriseerde commerciële epidermale modellen. De morfologische analyse heeft aangetoond dat, hoewel het aantal levensvatbare lagen in het voorgestelde RhE-model lager is in vergelijking met dat van de inheemse menselijke huid (d.w.z. 6-7 in vergelijking met 7-14), het vergelijkbaar is met dat van het EpiDerm RhE-model (d.w.z. 8-12)70. Net als bij de Modellen EpiDerm, EpiSkin en SkinEthic toont de bovenste RhE-laag een mandweefselpatroon van dicht opeengepakte corneocytlagen28. Bovendien bleek uit tem-analyse dat het aantal SC-lagen in het voorgestelde RhE-model (d.w.z. 15-25) vergelijkbaar is met dat van EpiDerm (d.w.z. 16-25)70. Over het algemeen vertoont het voorgestelde RhE-model een vergelijkbare structuur als die van andere gecommercialiseerde epidermale modellen, die de inheemse menselijke epidermis nabootsen. De weefselintegriteit zoals gemeten door TEER ligt binnen het bereik van commerciële RhE-modellen (d.w.z. tussen 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 en andere interne RhE's (d.w.z. ongeveer 5000 Ω,cm2)74,115. Het voorgestelde RhE-model blijkt goed gedifferentieerd te zijn, zoals blijkt uit de aanwezigheid en correcte lokalisatie van differentiatie- en weefseladhesiemarkers. Bovendien blijkt het voorgestelde RhE-model te reageren op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. LPS en TNF-α).

Tot slot laat het huidige protocol zien hoe rhEs op een betrouwbare manier en op relatief grote schaal kunnen worden produceren om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers in zowel academische als particuliere instellingen. Het voorgestelde RhE-model vertoont vergelijkbare morfologie, epidermale differentiatie en biologische responsiviteit als andere bestaande commerciële modellen. Het biedt een alternatief hulpmiddel voor zowel het farmaceutische als dermato-cosmetische veld wanneer toegang tot een relevant huidmodel vereist is.

Disclosures

Marc Eeman en Benedetta Petracca zijn medewerkers van Dow Silicones Belgium. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidie met de subsidieovereenkomst nr. 765602 dit werk gefinancierd. Alle auteurs erkennen de steun van de Adolphe Merkle Foundation en de Universiteit van Ferrara en erkennen dow silicones belgium dankbaar. Dr. Miguel Spuch-Calvar wordt erkend voor het voorbereiden van de grafische afbeeldingen van het RhE-teeltproces. De auteurs danken Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati en Dr. Agnès Tessier voor hun technische ondersteuning en discussies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich A6283 Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.
Antibiotic-antimycotic (100x) Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15240062
Aqueous Eosin Y solution Sigma Aldrich HT110280 Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich or Merck C8106 or 1.02378.0500 Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C.  It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.
DAPI Roche 10236276001 Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL.
Entellan mounting medium Merck 1.07960.0500 Mounting medium for H&E staining.
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) Thermo Fisher Scientific (Gibco) MEPI500CA Contains 0.06 mM of Ca2+.
Ethanol absolute Any supplier N/A
Formalin 10% Leica Biosystems 3800770
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) Thermo Fisher Scientific (Gibco) S0015 To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.
Isopropanol Biosolve B.V. 0016264102BS
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free Merck 1.08635.0100 Mounting medium for IF staining.
Keratinocyte growth factor (KGF) R&D Systems 251-KG-050 Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. 
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit Roche 4744926001
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate  Sigma-Aldrich A8960 Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 Sigma-Aldrich L4524 Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. 
Mayer’s Haematoxylin Sigma-Aldrich MHS80
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) Lonza 00192906 Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.
Phosphate-buffered saline Thermo Fisher Scientific (Gibco) 10010056 or 10010-015 Reference numbers can vary between countries.
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) ImmunoTools 11344483 Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL
Sterile ultrapure water Any supplier N/A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93426
Trypan blue (0.4% [v/v]) Any supplier N/A
Trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific (Gibco) R007100
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) Thermo Fisher Scientific (Gibco) 25300054
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam Ab150113
Tri-sodium citrate dihydrate Merck 1.06448.0500 For antigen retrieval buffer for IF staining. 
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) Agrisera AS09 633
Filaggrin Mouse antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-53243
Involucrin Rabbit antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-33742
Keratin 10 Mouse antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-32962
Desmoglein-1 Mouse antibody  BioTechne (Novus Biologicals) MAB944
Loricrin Rabbit antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP1-33610

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Antioxidants & Redox Signaling. , (2002).
  2. Pouillot, A., Dayan, N., Polla, A. S., Polla, L. L., Polla, B. S. The stratum corneum: a double paradox. Journal of Cosmetic Dermatology. 7 (2), 143-148 (2008).
  3. Moore, K. L., Dalley, A. F. Clinically Orientated Anatomy. , (2010).
  4. Barthel, R., Aberdam, D. Epidermal stem cells. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 19 (4), 405-413 (2005).
  5. Green, K. J., Simpson, C. L. Desmosomes: new perspectives on a classic. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2499-2515 (2007).
  6. Feingold, K. R. Lamellar bodies: the key to cutaneous barrier function. Journal of Investigative Dermatology. 132 (8), 1951-1953 (2012).
  7. Elias, M. P., Feingold, K. R., Fartasch, M. The epidermal lamellar body as a multifunctional secretory organelle. Skin Barrier. , 261-272 (2006).
  8. Tobin, D. J. Biochemistry of human skin-our brain on the outside. Chemical society reviews. 35 (1), 52-67 (2006).
  9. Bouwstra, J. A., Ponec, M. The skin barrier in healthy and diseased state. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1758 (12), 2080-2095 (2006).
  10. Weinstein, G. D., McCullough, J. L., Ross, P. Cell proliferation in normal epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 623-628 (1984).
  11. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'être" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  12. Suter, M. M., et al. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Veterinary Dermatology. 20 (5-6), 515-532 (2009).
  13. McLafferty, E., Hendry, C. The integumentary system: anatomy, physiology and function of skin. Nursing Standard. 27 (7), 35-43 (2012).
  14. Monteiro-Riviere, N. A. Toxicology of the skin. , (2010).
  15. Dellambra, E., Odorisio, T., D'Arcangelo, D., Failla, C. M., Facchiano, A. Non-animal models in dermatological research. ALTEX. 36 (2), 177-202 (2019).
  16. Gordon, S., et al. Non-animal models of epithelial barriers (skin, intestine and lung) in research, industrial applications and regulatory toxicology. Altex. 32 (4), 327-378 (2015).
  17. Kandárová, H., et al. The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests - An assessment of the performance of the optimised test. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 33 (4), 351-367 (2005).
  18. Kandárová, H., et al. Assessment of the skin irritation potential of chemicals by using the SkinEthic reconstructed human epidermal model and the common skin irritation protocol evaluated in the ECVAM skin irritation validation study. Alternatives to laboratory animals : ATLA. 34 (4), 393-406 (2006).
  19. OECD. Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. , (2019).
  20. Alépée, N., Grandidier, M. H., Cotovio, J. Sub-categorisation of skin corrosive chemicals by the EpiSkinTM reconstructed human epidermis skin corrosion test method according to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicology in Vitro. 28 (2), 131-145 (2014).
  21. OECD. Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. , (2019).
  22. Mehling, A., et al. In vitro RHE skin sensitisation assays: applicability to challenging substances. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 108, 104473 (2019).
  23. SENS-IS | EURL ECVAM - TSAR. , Available from: https://tsar.jrc.ec.europa.eu/test-method/tm2011-11 (2020).
  24. Lelièvre, D., et al. The episkin phototoxicity assay (EPA): development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency. Toxicology in Vitro. 21 (6), 977-995 (2007).
  25. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  26. Pellevoisin, C., Bouez, C., Cotovio, J. Cosmetic industry requirements regarding skin models for cosmetic testing. Skin Tissue Models. , 3-37 (2018).
  27. Niehues, H., et al. 3D skin models for 3R research: the potential of 3D reconstructed skin models to study skin barrier function. Experimental Dermatology. 27 (5), 501-511 (2018).
  28. Netzlaff, F., Lehr, C. -M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin®, SkinEthic® and EpiDerm®: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 167-178 (2005).
  29. Prieux, R., Eeman, M., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G. Mimicking cigarette smoke exposure to assess cutaneous toxicity. Toxicology in Vitro. 62, 104664 (2020).
  30. Petracca, B., Rothen-Rutishauser, B., Valacchi, G., Eeman, M. Bench approaches to study the detrimental cutaneous impact of troposperic ozone. Journal of Exposure Science and Environmental Epidemiology. 31, 137-148 (2021).
  31. Dijkhoff, I. M., et al. Impact of airborne particulate matter on skin: a systematic review from epidemiology to in vitro studies. Particle and fibre toxicology. 17 (1), 35 (2020).
  32. El Ghalbzouri, A., Siamari, R., Willemze, R., Ponec, M. Leiden reconstructed human epidermal model as a tool for the evaluation of the skin corrosion and irritation potential according to the ECVAM guidelines. Toxicology in Vitro. 22 (5), 1311-1320 (2008).
  33. Chacón, M., et al. Development of an in-house reconstructed human epidermis model as an alternative method in skin corrosion assessment. Toxicology in Vitro. 65, 104779 (2020).
  34. Pedrosa, T. doN., et al. A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicology in Vitro. 42, 31-37 (2017).
  35. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838 (2017).
  36. Poumay, Y., Coquette, A. Modelling the human epidermis in vitro: tools for basic and applied research. Archives of dermatological research. 298 (8), 361-369 (2007).
  37. Rikken, G., Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Organotypic 3D skin models: human epidermal equivalent cultures from primary keratinocytes and immortalized keratinocyte cell lines. Methods in Molecular Biology. 2154, 45-61 (2020).
  38. Duval, C., et al. Human skin model containing melanocytes: essential role of keratinocyte growth factor for constitutive pigmentation-functional response to α-melanocyte stimulating hormone and forskolin. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (12), 947-957 (2012).
  39. Hutter, V., Kirton, S. B., Chau, D. Y. S. Immunocompetent human in vitro skin models. Skin Tissue Models. , 353-373 (2018).
  40. Kinsner, A., Lesiak-Cyganowska, E., Śladowski, D. In vitro reconstruction of full thickness human skin on a composite collagen material. Cell and Tissue Banking. 2 (3), 165-171 (2001).
  41. Black, A. F., Bouez, C., Perrier, E., Schlotmann, K., Chapuis, F., Damour, O. Optimization and characterization of an engineered human skin equivalent. Tissue Engineering. 11 (5-6), 723-733 (2005).
  42. Reijnders, C. M. A., et al. Development of a full-thickness human skin equivalent in vitro model derived from TERT-immortalized keratinocytes and fibroblasts. Tissue Engineering. Part A. 21 (17-18), 2448-2459 (2015).
  43. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 352-366 (2011).
  44. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  45. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. 3D cell printing of perfusable vascularized human skin equivalent composed of epidermis, dermis, and hypodermis for better structural recapitulation of native skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019 (2019).
  46. Pittelkow, M. R., Scott, R. E. New techniques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and perspectives on their use for grafting of patients with extensive burns. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 771-777 (1986).
  47. Elias, P. M., Ahn, S. K., Brown, B. E., Crumrine, D., Feingold, K. R. Origin of the epidermal calcium gradient: regulation by barrier status and role of active vs passive mechanisms. Journal of Investigative Dermatology. 119 (6), 1269-1274 (2002).
  48. Elias, P. M., et al. Modulations in epidermal calcium regulate the expression of differentiation-specific markers. Journal of Investigative Dermatology. 119 (5), 1128-1136 (2002).
  49. Lee, S. E., Lee, S. H. Skin barrier and calcium. Annals of Dermatology. 30 (3), 265-275 (2018).
  50. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  51. Poumay, Y., et al. A simple reconstructed human epidermis: preparation of the culture model and utilization in in vitro studies. Archives of Dermatological Research. 296 (5), 203-211 (2004).
  52. Ponec, M., et al. The formation of competent barrier lipids in reconstructed human epidermis requires the presence of vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  53. Savini, I., et al. Characterization of keratinocyte differentiation induced by ascorbic acid: Protein kinase C involvement and vitamin C homeostasis. Journal of Investigative Dermatology. 118 (2), 372-379 (2002).
  54. Pasonen-Seppänen, S., et al. Vitamin C enhances differentiation of a continuous keratinocyte cell line (REK) into epidermis with normal stratum corneum ultrastructure and functional permeability barrier. Histochemistry and Cell Biology. 116 (4), 287-297 (2001).
  55. Beer, H. D., et al. Expression and function of keratinocyte growth factor and activin in skin morphogenesis and cutaneous wound repair. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 34-39 (2000).
  56. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of structural biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  57. Rice, R. H., Thacher, S. M. Involucrin: a constituent of cross-linked envelopes and marker of squamous maturation. Biology of the Integument. , 752-761 (1986).
  58. Elias, P. M., Barrier Feingold, K. R. Skin Barrier. , (2011).
  59. Marionnet, C., et al. Morphogenesis of dermal-epidermal junction in a model of reconstructed skin: beneficial effects of vitamin C. Experimental Dermatology. 15 (8), 625-633 (2006).
  60. Frikke-Schmidt, H., Lykkesfeldt, J. Keeping the intracellular vitamin C at a physiologically relevant level in endothelial cell culture. Analytical Biochemistry. 397 (1), 135-137 (2010).
  61. Castro-Muñozledo, F., Hernández-Quintero, M., Marsch-Moreno, M., Kuri-Harcuch, W. Cultivation, serial transfer, and differentiation of epidermal keratinocytes in serum-free medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 236 (1), 167-172 (1997).
  62. De Vuyst, E., et al. Reconstruction of normal and pathological human epidermis on polycarbonate filter. Epidermal Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 191-201 (2013).
  63. Chen, R. H., Zhu, J., Zhang, R. Z., Wang, S. Y., Li, Y. The tolerance of human epidermal cells to trypsinization in vitro. Cell and Tissue Banking. 21 (2), 257-264 (2020).
  64. Pohanish, R. P. Sittig's Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and Carcinogens. 2, (2012).
  65. Tsaousis, K. T., et al. Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clinical and Experimental Ophthalmology. 41 (5), 484-490 (2013).
  66. Kim, S. I., et al. Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters. Analytical Biochemistry. 492, 8-12 (2016).
  67. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  68. Fartasch, M., Ponec, M. Improved barrier structure formation in air-exposed human keratinocyte culture systems. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 366-374 (1994).
  69. Bouwstra, J. A., Honeywell-Nguyen, P. L., Gooris, G. S., Ponec, M. Structure of the skin barrier and its modulation by vesicular formulations. Progress in Lipid Research. 42 (1), 1-36 (2003).
  70. Ponec, M., Boelsma, E., Gibbs, S., Mommaas, M. Characterization of reconstructed skin models. Skin Pharmacology and Physiology. 15 (1), 4-17 (2002).
  71. Hubaux, R., Wauters, A., Chrétien, A., Poumay, Y., Salmon, M. Reconstructed human epidermis response to urban particulate matter activates multiple stress-related pathways and impacts the skin barrier function. 23th IFSCC Conference. , 125-134 (2017).
  72. Lin, Y. -C., et al. Testing method development and validation for in vitro skin irritation testing (SIT) by using reconstructed human epidermis (RhE) skin equivalent - EPiTRI®. Alternatives to Animal Testing. , 8-19 (2019).
  73. Alexander, F. A., Eggert, S., Wiest, J. Skin-on-a-chip: Transepithelial electrical resistance and extracellular acidification measurements through an automated air-liquid interface. Genes. 9 (2), 114 (2018).
  74. van den Bogaard, E., et al. Perspective and consensus opinion: good practices for using organotypic skin and epidermal equivalents in experimental dermatology research. Journal of Investigative Dermatology. 141 (1), 203-205 (2021).
  75. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An in vitro skin irritation test (SIT) using the EpiDerm reconstructed human epidermal (RHE) model. Journal of Visualized Experiments. (29), e1366 (2009).
  76. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical pharmacology advances and applications. 8, 163-176 (2016).
  77. De Wever, B., Kurdykowski, S., Descargues, P. Human skin models for research applications in pharmacology and toxicology: introducing nativeSkin, the "missing link" bridging cell culture and/or reconstructed skin models and human clinical testing. Applied In Vitro Toxicology. 1 (1), 26-32 (2015).
  78. Klicks, J., von Molitor, E., Ertongur-Fauth, T., Rudolf, R., Hafner, M. In vitro skin three-dimensional models and their applications. Journal of Cellular Biotechnology. 3 (1), 21-39 (2017).
  79. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 22 (12), 695-705 (1986).
  80. Johansen, C. Generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Journal of Visualized Experiments. (130), e56863 (2017).
  81. Boelsma, E., Verhoeven, M. C. H., Ponec, M. Reconstruction of a human skin equivalent using a spontaneously transformed keratinocyte cell line (HaCaT). Journal of Investigative Dermatology. 112 (4), 489-498 (1999).
  82. Zhao, X., et al. Photocrosslinkable gelatin hydrogel for epidermal tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (1), 108-118 (2016).
  83. Peura, M., et al. Paracrine factors from fibroblast aggregates in a fibrin-matrix carrier enhance keratinocyte viability and migration. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (2), 658-664 (2010).
  84. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCat keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology. 112 (3), 343-353 (1999).
  85. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue engineering. Part C, Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  86. Alameda, J. P., et al. IKKα regulates the stratification and differentiation of the epidermis: Implications for skin cancer development. Oncotarget. 7 (47), 76779-76792 (2016).
  87. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology and Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  88. Staiano-Coico, L., et al. Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing. Journal of Experimental Medicine. 178 (3), 865-878 (1993).
  89. Egelrud, T. Desquamation in the stratum corneum. Acta Dermato-Venereologica. 80, Supp 208 44-45 (2000).
  90. Jean, J., Lapointe, M., Soucy, J., Pouliot, R. Development of an in vitro psoriatic skin model by tissue engineering. Journal of Dermatological Science. 53 (1), 19-25 (2009).
  91. Lotte, C., Patouillet, C., Zanini, M., Messager, A., Roguet, R. Permeation and skin absorption: reproducibility of various industrial reconstructed human skin models. Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 15, Suppl 1 18-30 (2002).
  92. Ponec, M., Weerheim, A., Lankhorst, P., Wertz, P. New acylceramide in native and reconstructed epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 581-588 (2003).
  93. Thakoersing, V. S., et al. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  94. Thakoersing, V. S., et al. presence of monounsaturated fatty acids in the stratum corneum of human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  95. Van Smeden, J., et al. Combined LC/MS-platform for analysis of all major stratum corneum lipids, and the profiling of skin substitutes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (1), 70-79 (2014).
  96. Mieremet, A., et al. Human skin equivalents cultured under hypoxia display enhanced epidermal morphogenesis and lipid barrier formation. Scientific Reports. 9 (1), 7811 (2019).
  97. Mieremet, A., et al. Unravelling effects of relative humidity on lipid barrier formation in human skin equivalents. Archives of Dermatological Research. 311 (9), 679-689 (2019).
  98. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., Van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by Chitosan modulated dermal matrices. PLoS ONE. 12 (3), 0174478 (2017).
  99. Mieremet, A., et al. Contribution of palmitic acid to epidermal morphogenesis and lipid barrier formation in human skin equivalents. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6069 (2019).
  100. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal fifferentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  101. De Vuyst, E., Salmon, M., Evrard, C., Lambert de Rouvroit, C., Poumay, Y. Atopic dermatitis studies through in vitro models. Frontiers in Medicine. 4, 119 (2017).
  102. Danso, M. O., et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 134 (7), 1941-1950 (2014).
  103. Soboleva, A. G., Mezentsev, A., Zolotorenko, A., Bruskin, S., Pirusian, E. Three-dimensional skin models of psoriasis. Cells Tissues Organs. 199 (5-6), 301-310 (2014).
  104. Desmet, E., Ramadhas, A., Lambert, J., Gele, M. Van In vitro psoriasis models with focus on reconstructed skin models as promising tools in psoriasis research. Experimental Biology and Medicine. 242 (11), 1158-1169 (2017).
  105. Niehues, H., van den Bogaard, E. H. Past, present and future of in vitro 3D reconstructed inflammatory skin models to study psoriasis. Experimental Dermatology. 27 (5), 512-519 (2018).
  106. Pendaries, V., et al. Knockdown of filaggrin in a three-dimensional reconstructed human epidermis impairs keratinocyte differentiation. Journal of Investigative Dermatology. 134 (12), 2938-2946 (2014).
  107. Niehues, H., et al. Epidermal equivalents of filaggrin null keratinocytes do not show impaired skin barrier function. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (6), 1979-1981 (2017).
  108. Reuter, C., Walles, H., Groeber, F. Preparation of a three-dimensional full thickness skin equivalent. Methods in Molecular Biology. 1612, 191-198 (2017).
  109. Bataillon, M., et al. Characterization of a new reconstructed full thickness skin model, t-skinTM, and its application for investigations of anti-aging compounds. International Journal of Molecular Sciences. 20 (9), 2240 (2019).
  110. Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding. Journal of Visualized Experiments. (96), e52576 (2015).
  111. Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. Journal of Visualized Experiments. (54), e2937 (2011).
  112. Müller, I., Kulms, D. A 3D organotypic melanoma spheroid skin model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57500 (2018).
  113. Wei, Z., et al. Two-dimensional cellular and three-dimensional bio-printed skin models to screen topical-use compounds for irritation potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 109 (2020).
  114. Derr, K., et al. Fully three-dimensional bioprinted skin equivalent constructs with validated morphology and barrier function. Tissue Engineering - Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  115. Frankart, A., et al. Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface. Experimental Dermatology. 21 (11), 871-875 (2012).

Tags

Bioengineering Reconstituted human epidermis human epidermal equivalents primary keratinocytes epidermis in vitro studies.
Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dijkhoff, I. M., Petracca, B.,… More

Dijkhoff, I. M., Petracca, B., Prieux, R., Valacchi, G., Rothen-Rutishauser, B., Eeman, M. Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale. J. Vis. Exp. (171), e61802, doi:10.3791/61802 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter