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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Cultiver un épiderme humain reconstruit tridimensionnel à grande échelle

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61802
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3,4, 1, 2
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg, 2Dow Silicones Belgium SRL, 3Department of Biomedical and Specialist Surgical Sciences, University of Ferrara, 4Department of Animal Sciences, Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

Summary

Ce protocole décrit une méthode simple pour cultiver l’épiderme humain reconstitué tridimensionnel d’une manière reproductible et robuste. En outre, il caractérise la relation structure-fonction du modèle de barrière épidermique. Les réponses biologiques de l’épiderme humain reconstitué sur des stimulus proinflammatory sont également présentées.

Abstract

Un modèle humain tridimensionnel d’épiderme reconstruit à partir des keratinocytes primaires néonatals est présenté. Ici, un protocole pour le processus de culture et la caractérisation du modèle est décrit. Les kératinocytes primaires néonatals sont cultivés immergés sur des inserts perméables en polycarbonate et portés à l’interface air-liquide trois jours après l’ensemencement. Après quatorze jours de stimulation avec des facteurs de croissance définis et de l’acide ascorbique dans un milieu de culture à haute teneur en calcium, le modèle est entièrement différencié. L’analyse histologique a indiqué un épiderme complètement stratifié, imitant la morphologie de la peau humaine indigène. Pour caractériser le modèle et ses fonctions de barrière, des niveaux de protéine et la localisation spécifiques pour la différenciation de keratinocyte de tôt-étape (c.-à-d., kératine 10), la différenciation de tard-étape (c.-à-d., involucrin, loricrin, et filaggrin) et l’adhérence de tissu (c.-à-d., desmoglein 1), ont été évalués par immunofluorescence. L’intégrité de barrière de tissu a été encore évaluée en mesurant la résistance électrique transepithelial. L’épiderme humaineconstructed de R était sensible aux stimulus proinflammatory (c.-à-d., alpha de facteur de nécrose de lipopolysaccharide et de tumeur), menant au plus grand dégagement de cytokine (c.-à-d., alpha et interleukin 8 de l’interleukin 1). Ce protocole représente une méthode in vitro simple et reproductible pour cultiver l’épiderme humain reconstruit comme outil pour évaluer des effets environnementaux et un large éventail d’études liées à la peau.

Introduction

L’épiderme est la couche la plus externe de la peau, à l’interface directe entre le corps humain et l’environnement externe. Ses principales fonctions sont d’assurer la protection et l’hydratation1. L’épiderme agit comme une barrière physique efficace contre les agents externes et empêche la perte excessive d’eau du corps. Ces fonctions cutanées dépendent principalement de la disposition cellulaire dans les couches les plus externe de la peau, de la composition et de l’organisation des lipides intercellulaires2. L’épiderme est principalement composé de kératinocytes qui migrent vers le haut vers la face externe du tissu et subissent une différenciation. Il y a 4-5 couches épidermiques qui sont caractérisées par leur stade de différenciation. De l’intérieur vers l’extérieur, les couches épidermiques commencent de l’épiderme viable, c’est-à-dire la couche basale (SB), la strate spinosum (SS) et la couche granulosum (SG), jusqu’à la couche supérieure non viable, c’est-à-dire la couche cornée (SC)3. La couche basale est principalement composée de kératinocytes enrichis en kératine proliférants, qui migrent à travers les SS lors de la différenciation4. Au cours de la maturation des kératinocytes, divers changements dans l’expression et la structure des protéines se produisent. Les kératinocytes adhèrent par la formation de jonctions desmosomales5. Dans le SG, la génération de corps lamellaires est initiée. Ils sont constitués de précurseurs lipidiques et d’enzymes qui sont cruciales pour la formation de la fonction barrière cutanée6. Le SG est également caractérisé par la présence de granules de kératohyaline dans le cytoplasme des kératinocytes. A l’interface avec le SC, la teneur en corps lamellaires est extrudée dans les espaces intercellulaires et les lipides non polaires tels que les céramides, le cholestérol, et les acides gras libres s’organisent en bicouches lipidiques lamellaires empilées pour former la matrice lipidique extracellulaire7. Dans le SC, les cellules perdent tous les organites cellulaires, y compris le noyau, en raison de processus de dégradation enzymatique et adoptent une morphologie aplati. Ils sont entourés d’une enveloppe cornifiée constituée de couches protéiques réticulées, et sont appelés cornéocytes8,9. Les composants desmosomaux sont réticulés à l’enveloppe cornifiée pour former des corneodesmosomes et lier les cornéocytes ensemble. L’épithélium résultant est continuellement renouvelé à partir de cellules souches, avec un temps de renouvellement d’environ 5-6 semaines10. Le processus de différenciation des kératinocytes, qui se traduit par un épiderme entièrement stratifié, est crucial pour la formation de la fonction barrière de la peau11.

Au cours de la blessure et de l’inflammation, les kératinocytes induisent des changements dans les molécules d’adhésion et les récepteurs de surface et déclenchent des réponses pro-inflammatoires via la sécrétion de cytokines, de chimiokines et de peptides antimicrobiens12. La peau n’est pas seulement une barrière physique contre les substances exogènes; il agit également comme un capteur immunitaire lors de l’exposition à des agents pathogènes. En outre, il régule la diffusion de plusieurs substances à travers ses couches, telles que la teneur en eau pour protéger le corps humain de la déshydratation. La peau est également impliquée dans la synthèse de la vitamine D et possède diverses autres fonctions métaboliques3,13,14.

Pour évaluer les effets nocifs des substances exogènes, les toxicologues se sont appuyés pendant des décennies sur l’expérimentation animale, mais de nos jours, ce n’est pas l’approche privilégiée. En plus d’avoir une capacité prédictive limitée pour la toxicité humaine, les modèles animaux impliquent de nombreuses questions éthiques. L’interdiction de l’expérimentation animale dans l’industrie cosmétique et la recommandation de suivre le principe 3R (c.-à-d. remplacement, réduction et raffinement) dans la recherche ont conduit à la mise au point de méthodes d’essai alternatives basées sur des approches in vitro15. Les premiers modèles de cellules de peau in vitro ont déjà été décrits dans les années 90, et un développement impressionnant de simples mono-cultures de kératinocytes humains à des modèles d’épiderme et de pleine épaisseur entièrement différenciés a été réalisé16. De nos jours, l’ingénierie tissulaire de la peau a pris de l’importance dans les domaines pharmaceutique et dermato-cosmétique. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs entreprises ont commercialisé l’épiderme humain reconstruit en trois dimensions (3D) qui représente des outils normalisés et reproductibles pour les études liées à la peau. Plusieurs modèles rhénerégaux commerciaux sont acceptés pour les essais cutanés in vitro de produits chimiques conformément aux lignes directrices de l’OCDE pour les essais d’irritation cutanée17,18 (c’est-à-dire la ligne directrice d’essai 43919)et de corrosion cutanée20 (c’est-à-dire la ligne directrice d’essai 43121). Le test in vitro de sensibilisation cutanée22 (c.-à-d. le test SENS-IS) est actuellement sur la voie de l’approbation et fait l’objet d’un examen par les pairs23. Il existe également de nombreux autres dosages développés qui utilisent des modèles rhésus commerciaux, pour évaluer la phototoxicité24,pour tester des formulations de médicaments25,des formulations cosmétiques et des principes actifs26,pour étudier la fonction barrière cutanée27 et pour tester la réponse biologique aux facteurs de stressenvironnementaux 28,29,30,31.

En plus des modèles de peau 3D disponibles dans le commerce, plusieurs groupes de recherche ont développé leurs propres RhEs32,33,34,35,36,37. Les RhEs internes offrent l’avantage de contrôler les conditions de culture en fonction du but de l’étude. Plus précisément, les chercheurs peuvent choisir le type et la source des kératinocytes à utiliser pour la reconstitution de leur modèle épidermique 3D (c.-à-d. primaire vs immortalisé, néonatal vs âgé, donneurs aléatoires célibataires vs regroupés, sexe, ethnicité, habitudes de vie individuelles telles que le tabagisme, etc.). Ils ont la possibilité de faire varier la composition du milieu de culture et d’incorporer des facteurs de croissance, des vitamines ou d’autres composés qui peuvent moduler l’expression de protéines ou de lipides cibles. Avec les RhE internes, les chercheurs peuvent également étudier les réponses biologiques et les propriétés biomécaniques en fonction de l’état de différenciation du modèle 3D. En plus de ces paramètres intuitifs, il existe des efforts continus pour augmenter la complexité des modèles cutanés 3D et les rendre physiologiquement plus pertinents, par exemple en ajoutant d’autres types de cellules épidermiques (par exemple les mélanocytes et les cellules immunitaires)38,39,en cultivant les kératinocytes au-dessus d’une matrice de collagène peuplée de fibroblastes40,41,42,et en incluant des composants du réseau vasculaire43,44,45.

Bien qu’il soit possible d’ajuster les conditions de culture en fonction de besoins spécifiques, il existe des paramètres qui doivent être respectés pour garantir à la fois la qualité et la pertinence d’un RhE. Pour cultiver des tissus rhésus, des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEKs) sont ensemencés dans des inserts de culture perméables spécifiques dont la membrane synthétique poreuse sépare les puits en deux compartiments, c’est-à-dire le compartiment apical et basolatéral. La porosité de la membrane (c.-à-d. une taille de pores de 0,4 μm) est telle qu’elle permet la formation d’une monocouche cellulaire dans le compartiment apical sans migration des cellules vers le côté de l’insert basal, et l’alimentation des kératinocytes avec des nutriments essentiels du milieu de culture contenu dans le compartiment basolatéral. Au début du processus de reconstitution, les NHEKs sont cultivés dans des conditions immergées pendant quelques jours pour permettre leur adhésion à la membrane. Le taux de calcium dans les deux compartiments est augmenté par rapport à la concentration en calcium utilisée pour la culture 2D de NHEKs afin de ralentir la prolifération des cellules et de favoriser à la place leur différenciation46. Un gradient épidermique de calcium est essentiel pour réguler la formation de la barrière et l’homéostasie47,48. Des niveaux élevés de calcium (c’est-à-dire jusqu’à 1,5 mM) favorisent la formation de jonctions intercellulaires et modulent la formation de l’enveloppe cornifiée lors de la différenciation terminale49. Une fois que les kératinocytes forment une monocouche continue et étroitement adhérente sur la membrane supportante, le milieu du compartiment apical est retiré et le processus de culture se poursuit à l’interface air-liquide (ALI) pour stimuler la stratification et établir une barrière épidermique50,51. Des conditions de culture spécifiques sont cruciales pour obtenir un épithélium entièrement stratifié36. Au cours du processus de reconstitution à ALI, le milieu dans le compartiment basolatéral est complété par un facteur de croissance kératinocytes (KGF), de l’insuline, du calcium et de l’acide ascorbique. L’acide ascorbique joue un rôle majeur dans la formation d’une barrière lipidique SC appropriée, ressemblant étroitement à celle de la peau humaine native52. Les kératinocytes cultivés en milieu ascorbique supplémenté à l’acide démontrent un phénotype différencié, avec un nombre accru de granules de kératohyaline, ainsi que des lamelles lipidiques intercellulaires organisées dans les interstices des cornéocytes52. Une telle supplémentation est essentielle pour améliorer la fonction de barrière épidermique en augmentant la teneur en enveloppe cornifiée et en évitant l’épuisement des réserves antioxydanteshydrophiles 53,54. KGF, un médiateur paracrine important de la prolifération et de la différenciation épidermiques, est utilisé pour stimuler les NHEKs55.

Les principaux inconvénients des RhE internes comprennent la perte de normalisation entre les établissements de recherche et l’augmentation de l’intensité de la main-d’œuvre et de la consommation de temps (jusqu’à 3 semaines par rapport aux modèles commerciaux prêts à l’emploi). L’objectif du présent document est de remédier à ces inconvénients, en je fixant les bases d’une production à plus grande échelle. En plus des avantages susmentionnés des RhE internes, le protocole actuel vise à réduire la variabilité intra- et inter-tissu, à réduire les risques de contamination et à rationaliser le processus de culture.

Le protocole actuel décrit une méthode reproductible et robuste pour cultiver des RhEs utilisant des NHEKs néonatals. De plus, il montre des résultats représentatifs de la caractérisation de la morphologie rhésus, de l’intégrité de la barrière et de l’expression des protéines spécifiques à la différenciation épidermique. La structure morphologique de RhEs a été examinée utilisant la souillure de hematoxylin et l’éosine (H&E) et la microscopie électronique de transmission (TEM). Pour évaluer l’intégrité de la barrière, la résistance électrique transépidermique (TEER) et le temps d’exposition à Triton X-100 pour réduire 50% de la viabilité tissulaire (ET50)ont été mesurés. La formation des jonctions desmosomal (c.-à-d., desmoglein 1) a été analysée par l’immunofluorescence (SI) pour évaluer l’adhérence de keratinocyte. La formation des protéines structurales épidermiques (c.-à-d., involucrin, loricrin, et filaggrin) a été évaluée et détectée avec L’IF. Ces protéines sont impliquées dans la formation de l’enveloppe protéique hautement réticulée qui entoure les cornéocytes SC et sont par conséquent des marqueurs importants pour la différenciation épidermique à un stade avancé56,57. En outre, IF a été employé pour analyser la kératine 10, une protéine induite dans les cellules différenciées de tôt-étape dans le SS58 et trouvé à l’intérieur de toutes les couches différenciées. En conclusion, rhE' la réponse de s aux stimulus proinflammatory (c.-à-d., alpha de facteur de nécrose de lipopolysaccharide et de tumeur) a été étudiée. Les niveaux d’interleukine 1 alpha (IL-1α) et d’interleukine 8 (IL-8) ont été mesurés dans les milieux de culture cellulaire, à l’aide d’essais immunoenzymatiques (ELISA).

Protocol

Examiner et respecter les considérations et les conditions éthiques nationales et internationales liées à l’utilisation de tissus ou de cellules humains avant de planifier et d’exécuter toute activité de recherche mettant en cause le présent protocole.
REMARQUE: Toutes les étapes de ce protocole doivent être effectuées dans des conditions aseptiques. Les pratiques de niveau de biosécurité 2 sont l’exigence minimale pour la culture des RhE. Toutes les précautions de sécurité nécessaires doivent être prises lors de la manipulation des produits chimiques/réactifs décrits dans le présent protocole.

1. Préparation des milieux de culture cellulaire

NOTA : Il existe trois types différents de milieux de culture sans sérum utilisés pour la culture des RhEs (tableau 1) : (i) le milieu basal à faible teneur en calcium (60 μMCa2+)utilisé pour la culture 2D des NHEKs; ii) le milieu immergé à haut niveau de calcium (1,5 mMCa2+) utilisé pour l’ensemencement des NHEKs dans le système d’insertion de culture cellulaire; et (iii) le milieu d’interface air-liquide (ALI) avec le niveau élevé de calcium (1.5 mM Ca2+),l’acide ascorbique, et le facteur de croissance de keratinocyte (KGF).

Douleur moyenne Informations moyennes Quantité requise
Milieu basal Milieu de croissance des kératinocytes Puits de 36 mL/24
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antibiotique-antimycotique
Milieu submergé Milieu de croissance des kératinocytes Puits de 36 mL/24
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antibiotique-antimycotique
+ 1,5 mM Ca2+
Milieu d’interface air-liquide Milieu de croissance des kératinocytes 216 mL/24 puits
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x antibiotique-antimycotique
+ 1,5 mM Ca2+
+ 50 μg/mL d’acide ascorbique
+ 10 ng/mL de facteur de croissance des kératinocytes

Tableau 1. Tableau récapitulatif des différents milieux de culture utilisés pour cultiver les RhE. Liste des différents médias de culture avec suppléments.

  1. Préparez le milieu basal.
    1. Compléter la bouteille de 500 mL de milieu de croissance des kératinocytes(Table des matériaux)avec 5 mL de suppléments de croissance des kératinocytes humains (HKGS) afin d’atteindre des concentrations finales de 0,2 % [v/v] d’extrait hypophysaire bovin (BPE), 0,2 ng/mL de facteur de croissance épidermique recombinant humain (EGF), 0,18 μg/mL d’hydrocortisone, 5 μg/mL de transferrine bovine et 0,01 μg/mL de facteur de croissance analogue à l’insuline humaine recombinante-I (IGF-I).
    2. Ajouter 5 mL de solution antibiotique-antimycotique 100x contenant 10 000 unités/mL de pénicilline, 10 000 μg/mL de streptomycine et 25 μg/mL d’amphotéricine B.
  2. Préparez le milieu submergé.
    1. Compléter la bouteille de 500 mL de milieu de croissance des kératinocytes(table des matériaux)par 5 mL de HKGS afin d’atteindre des concentrations finales de 0,2 % [v/v] de BPE, 0,2 ng/mL d’EGF recombinant humain, 0,18 μg/mL d’hydrocortisone, 5 μg/mL de transferrine bovine et 0,01 μg/mL d’IGF-I recombinant humain.
    2. Ajouter 5 mL de solution antibiotique-antimycotique 100x.
    3. Ajouter 5 mL d’une solution mère de CaCl2 (chlorure de calcium) à0,144 M pour atteindre une concentration finale de 1,5 mMCa2+.
      NOTE: La concentration en calcium est déjà augmentée au cours de la phase immergée pour stimuler la différenciation des kératinocytes et initier le processus de stratification49.
  3. Préparez le milieu d’interface air-liquide (ALI).
    1. Compléter une bouteille de 500 mL de milieu de croissance des kératinocytes (Table des matériaux) avec 5 mL de HKGS afin d’atteindre des concentrations finales de 0,2 % [v/v] de BPE, 0,2 ng/mL d’EGF recombinant humain, 0,18 μg/mL d’hydrocortisone, 5 μg/mL de transferrine bovine et 0,01 μg/mL d’IGF-I recombinant humain.
    2. Ajouter 5 mL de solution antibiotique-antimycotique 100x.
    3. Ajouter 5 mL d’une solution mère de CaCl 2 à0,144 M pour atteindre une concentration finale de 1,5 mMCa2+.
    4. Ajouter 1 mL d’une solution mère d’acide ascorbique à 25 mg/mL pour atteindre une concentration finale de 50 μg/mL d’acide ascorbique.
    5. Ajouter 50 μL d’un KGF de 100 μg/mL dans 1 % [p/v] d’albumine sérique bovine dans une solution mère saline tamponnée au phosphate (PBS) pour atteindre une concentration finale de 10 ng/mL KGF.
      REMARQUE: Étant donné que l’acide ascorbique est sensible à l’oxydation, il est recommandé d’utiliser un dérivé stable de l’acide ascorbique, tel que le magnésium l-ascorbyl-2-phosphate59 ou l’acide L-ascorbique 2-phosphate sesquimagnésium60. Si de l’acide ascorbique est utilisé, il est recommandé de compléter fraîchement le milieu ALI avec de l’acide ascorbique avant chaque rafraîchissement.

2. Culture des NHEKs

REMARQUE: Étant donné que les kératinocytes humains primaires restent prolifératifs lors de leur quatrième ou cinquième passage61,les NHEKs dans leur troisième passage sont utilisés pour la culture des RhEs. Les kératinocytes primaires doivent être manipulés très soigneusement en raison de leur sensibilité élevée. Un pipetage soigneux et lent des suspensions cellulaires à tout moment est très important, pour ne pas perturber l’état des cellules.

  1. Décongeler un flacon avec 1 X 106 NHEKs cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C, en submergeant une partie du flacon dans l’eau. Incuber le flacon pendant 1-2 minutes au bain-marie, jusqu’à ce que seul un petit éclat de glace soit visible.
    ATTENTION : Ne pas immerger tout le flacon dans le bain-marie pour éviter les contaminations. Ne décongelez pas les cellules plus de 2 minutes; cela peut réduire la viabilité cellulaire. Essuyez le flacon avec une solution d’éthanol à 70% avant de transférer le tube dans la hotte laminaire.
  2. Ressuscitez les cellules très soigneusement, en pipetant de haut en bas 2-3 fois. Transférer la suspension cellulaire dans deux fioles T75 contenant au total 15 mL de milieu de décongélation préchauffé, ce qui donne une densité d’ensemencement de 6,7 x 104 cellules/cm2.
    REMARQUE: Pour les deux premiers passages et la décongélation des NHEKs cryoconservés, le milieu de culture cellulaire est utilisé conformément aux recommandations du fournisseur.
  3. Placer les fioles dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % deCO2et 95 % d’humidité relative (HR)).
  4. Après environ 24 heures, remplacer le milieu de décongélation par le milieu basal pour éliminer le diméthylsulfoxyde (DMSO) de la solution de congélation des kératinocytes.
  5. Rafraîchissez le milieu basal tous les deux jours.
  6. Après 4-6 jours de culture, les cellules doivent être environ 80% confluentes et prêtes à être ensemencées dans des inserts pour la culture de RhEs.
    REMARQUE: Les kératinocytes doivent être cultivés à un maximum de 80% de confluence pour préserver leur capacité proliférative62. Le nombre de cellules à décongeler doit tenir compte de plusieurs paramètres, tels que le nombre de passage cellulaire, la viabilité cellulaire lors de la décongélation, l’efficacité de l’ensemencement ainsi que le temps de doublement.

3. Ensemencement des NHEKs

REMARQUE: Ce protocole est conçu pour une utilisation dans un format de plaque porteuse de 24 puits. Si d’autres formats de plaque sont requis (p. ex. format 12 puits ou 6 puits), des optimisations de la densité d’ensemencement et du volume moyen devraient être envisagées. La figure 1 résume un calendrier proposé pour la culture du RhE et montre les conditions de culture.

Figure 1
Figure 1: Chronologie schématique du protocole de reconstitution. Présentation de la préparation du modèle RhE, du processus de culture et de l’application (exposition à la substance chimique). Le schéma inclut les types de milieux de culture cellulaire appropriés pour chaque étape. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Préremmage de plaques de 24 puits avec 1,5 mL de milieu immergé, idéalement à l’aide d’une pipette de distributeur.
  2. Retirer le milieu basal des fioles T75 utilisées pour la culture des NHEKs.
  3. Rincer les cellules en ajoutant 5 mL de PBS préchauffé à chaque fiole T75.
  4. Retirer le PBS des fioles.
    REMARQUE: Cette étape est cruciale, car le milieu contient des protéines et du calcium qui inhiberont l’activité de la trypsine.
  5. Ajouter 2 à 3 mL d’acide tétraacétique (EDTA) préchauffé à 0,05 % [v/v] de trypsine/éthylène diamine (EDTA). Assurez-vous que la solution de trypsine est également répartie sur la zone de culture cellulaire du ballon.
    ATTENTION : Le volume de 2 mL est basé sur la confluence de 80% mentionnée ci-dessus. Utiliser 3 mL pour les fioles à confluence plus élevée.
  6. Placer les flacons pendant 4 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % deCO2et 95 % d’HR). Vérifiez si les cellules se détachent à l’aide du microscope à un grossissement 10x. Rapper le ballon contre la paume de la main pour aider les cellules à se libérer de la surface du ballon. Les cellules détachées peuvent être observées sous forme de cellules arrondies flottant dans la solution de trypsine.
    ATTENTION : N’incubez pas les cellules dans la trypsine pendant plus de 6 minutes. Une trypsinisation excessive peut endommager les cellules et diminuer leur adhérence63.
  7. Une fois que toutes les cellules sont détachées, ajouter un volume égal (c.-à-d. 2-3 mL) d’inhibiteur de la trypsine préchauffé à chaque fiole T75.
  8. Transférer la suspension cellulaire des fioles dans un tube à centrifuger.
  9. Rincer les fioles avec 5 mL de PBS préchauffé et le transférer dans le tube de centrifugation contenant la suspension cellulaire.
    REMARQUE: Assurez-vous que la plupart des cellules sont collectées en vérifiant le nombre de cellules résiduelles dans les flacons au microscope. La surface du ballon doit être vide à 95 %. Si ce n’est pas le cas, il est possible de répéter l’étape de trypsinisation (3.3-3.9). Notez cependant que la re-trypsinisation doit être évitée.
  10. Centrifuger les cellules récoltées à 400 x g pendant 5 min.
  11. Jetez soigneusement la majeure partie du surnageant, en laissant environ 100 à 200 μL dans le tube.
    ATTENTION: Ne pas aspirer la pastille au cours de cetteprocédure. 
  12. Remettez doucement en suspension le culot de cellules dans un faible volume de milieu submergé, pipettez de haut en bas 5 à 10 fois pour assurer une suspension uniforme des cellules. Commencez par un faible volume (c.-à-d. 500 μL) pour éviter la formation d’agrégats cellulaires et additionnez jusqu’à 1 mL de milieu submergé au total par fiole T75 initiale.
    REMARQUE: Faites glisser doucement le tube avec les doigts pour dissoudre soigneusement une partie de la pastille cellulaire dans le surnageant.
  13. Comptez les cellules de la suspension à l’aide de la méthode d’exclusion trypan blue.
    1. Diluer la tache bleue trypan de 0,4 % [v/v] et la suspension cellulaire dans un rapport de 1:1, en ajoutant 10 μL de 0,4 % [v/v] de coloration bleue trypan à 10 μL de suspension cellulaire. Ajouter 10 μL de la solution à une lame de comptage. Mesurer le nombre de cellules immédiatement après le mélange de la suspension cellulaire avec le bleu trypan, puisque le bleu trypan commence à diminuer la viabilité cellulaire après une exposition supérieure à 1 min65.
      ATTENTION : Le bleu de Trypan s’est avéré un mutagène, un cancérogène, et un tératogène potentiels64. Manipulez le colorant avec soin et éliminez les déchets en toute sécurité conformément aux réglementations locales du laboratoire.
      REMARQUE: Une approche alternative à l’utilisation du bleu trypan est le colorant non dangereux Érythrosine B66.
  14. Diluer la suspension cellulaire avec un milieu immergé supplémentaire pour atteindre une concentration de 3,525 x 105 cellules/mL en milieu immergé en ajoutant le volumeV2 comme indiqué dans l’équation 1:
    Equation 1
    C1 = concentration cellulaire comptée dans la suspension cellulaire obtenue en 3,12 (cellules/mL)
    V1 = volume utilisé pour ressusciter la pastille de cellules dans 3,12 (mL)
    C2 = concentration cellulaire ciblée dans la suspension (c.-à-d. 3,525 x 105 cellules/ml)
    V2 = volume à ajouter pour atteindre la concentration cellulaire ciblée (mL)
    NOTA : La surface de l’insert de culture recommandé est de 0,47cm2; par conséquent, la densité d’ensemencement correspondante est de 3,75 x10 5 cellules/cm2.
  15. Effectuer un second comptage cellulaire(C3)de la solution diluée obtenue à l’étape 3.14. Utilisez l’équation 2 pour calculer le volume de suspension cellulaire (V4)à ensemencer dans l’insert de culture:
    Equation 2
    C3 = concentration cellulaire ciblée dans la suspension (c.-à-d. 3,525 x 105 cellules/ml)
    V3 = volume ciblé de la suspension cellulaire à ensemencer dans l’insert de culture (c.-à-d. 0,5 mL)
    C4 = concentration cellulaire comptée dans la suspension diluée obtenue en 3.14 (cellules/mL)
    V4 = volume réel de la suspension cellulaire à ensemencer dans l’insert de culture (mL)
  16. Suspendre les 24 inserts de culture cellulaire dans la position la plus haute de la plaque porteuse recommandée et transférer la plaque porteuse sur la plaque porteuse de 24 puits préremplie de milieu immergé (cf. 3.1).
    ATTENTION: Lors du transfert de la plaque porteuse vers la plaque multi-puits, assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnée entre la membrane d’insertion et le milieu immergé du compartiment basal, car cela affectera l’alimentation des cellules et finira par compromettre la viabilité et la morphologie rhésus.
  17. Ajouter le volumeV4 déterminé (de l’équation 2) de la suspension de la cellule à chaque insert.
    REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la technique de pipetage inverse pour distribuer avec précision la suspension cellulaire aux inserts de culture.
    ATTENTION: Assurez-vous de ne pas endommager la membrane lors de la distribution de la suspension cellulaire dans l’insert de culture. Une précaution consiste à distribuer la suspension cellulaire le long de la paroi du système d’insertion sans toucher la surface de la membrane.
  18. Après l’ensemencement, incuber les plaques de 24 puits pendant 10-15 min à température ambiante, pour surmonter un effet de bord (c’est-à-dire une distribution de température non uniforme entre tous les puits67). Ne déplacez pas les plaques pendant ce temps.
  19. Transférer les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % deCO2et 95 % d’HR). Les cellules sont maintenues dans des conditions submergées pendant trois jours.
    REMARQUE: Pour éviter la variabilité tissulaire, n’empilez pas les plaques dans l’incubateur après l’ensemencement pour vous assurer que chaque insert reçoit la même quantité de chaleur. Après trois jours (c.-à-d. pendant la culture d’ALI), l’empilement des plaques est possible.

4. Culture à l’interface Air-Liquide

  1. Après une incubation de trois jours dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % deCO2et 95 % d’HR), exposer les cellules qui ont adhéré à la surface de la membrane à l’ALI en retirant le milieu immergé du compartiment apical de préférence à l’aide d’un système d’aspiration et d’une pipette Pasteur en verre.
    NOTA : Alternativement, le milieu immergé du compartiment apical peut être retiré à l’aide d’une micropipette manuelle.
  2. Remplissez les nouvelles plaques de 24 puits avec 1,5 mL de milieu ALI frais préchauffé et transférez les plaques porteuses avec les inserts de culture vers les nouvelles plaques multi-puits.
  3. Transférer les plaques multi-puits dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % deCO2et 95 % d’HR).
  4. Rafraîchissez le support ALI tous les 2-3 jours pendant 14 jours.
  5. Effectuez le rafraîchissement en deux étapes : 1) préparer une nouvelle plaque contenant 1,5 mL/puits de milieu ALI frais préchauffé et 2) transférer la plaque porteuse sur la nouvelle plaque.
    ATTENTION: Pendant toute la procédure de reconstitution, il est préférable de ne pas enlever le couvercle recouvrant la plaque porteuse pour protéger les RhEs de la contamination potentielle.
    NOTE : L’étape ALI est cruciale pour le développement d’un modèle épidermique stratifié car elle permet une différenciation terminale des kératinocytes68. Après être allé à ALI, un contrôle visuel des inserts est nécessaire, pour vérifier s’il y a des « tissus qui fuient »: des gouttelettes moyennes sur la surface du tissu provenant du compartiment basolatéral. Si la fuite se produit au jour ALI 3, retirez doucement le milieu de l’insert de culture sans toucher la surface du tissu. Si la fuite persiste, il est recommandé de jeter les tissus qui fuient car c’est une indication qu’il n’y a pas de formation correcte de barrière dans le modèle RhE.
  6. A l’issue du processus de reconstitution, les tissus peuvent être exposés à divers facteurs de stress pour induire par exemple un stress oxydatif ou une inflammation. En parallèle, ils peuvent être traités avec des composés chimiques ou des ingrédients cosmétiques. NOTA : Pendant l’exposition ou le traitement, les tissus sont habituellement maintenus en milieu immergé à partir de la LAI D14. Lorsque l’on s’attend à ce que les tissus soient exposés ou traités pendant une longue période (c.-à-d. de 48 à 72 heures), il est recommandé (i) de commencer l’exposition ou le traitement plus tôt dans le processus de culture de l’AAA, comme le D7-D9, afin d’éviter l’amincissement des couches viables et l’épaississement du SC, et (ii) d’incuber les tissus dans le milieu ALI, afin de continuer à stimuler la prolifération cellulaire.
  7. Pour la récolte de RhE, recueillir les tissus et le milieu de culture cellulaire au point d’intérêt pour l’analyse histologique, les essais de viabilité, l’extraction de protéines/ARN et les essais immunoenzymatiques liés (ELISA).

Representative Results

Les NHEKs cultivés en 2D présentent une morphologie traditionnelle avec une forme polygonale cohérente (Figure 2A). Comme décrit ci-dessus, les NHEKs sont ensemencés dans des inserts de culture après avoir atteint une confluence d’environ 80%. La morphologie des RhEs a été analysée utilisant la souillure de H&E et le TEM. Après 15 jours à l’ALI, un tissu entièrement stratifié est obtenu comme indiqué par ses quatre principales couches épidermiques : le SB, le SS, le SG, et le SC(figure 2B). Dans la couche SB, les cellules ont une forme en colonnes. À partir de la deuxième couche vers les couches supérieures du RhE, les NHEKs se différencient comme observé par les changements dans la morphologie cellulaire (d’une forme en colonnes dans la couche SB, vers une forme épineuse dans la couche SS). Dans la couche SG, les cellules ont une forme plus aplatie et présentent des granules de kératohyaline (KG) qui sont représentés sous forme de points violets dans le cytoplasme. Leur forme ronde et stellaire caractéristique est mise en évidence par des flèches blanches sur l’image H&E (Figure 2C). Les cellules dans le SC, sont terminalement différenciées et sont complètement aplatir et manquent d’un noyau cellulaire. Les RhEs stratifiés ont une épaisseur globale de 84,3 ± 2,4 μm et leur SC a une épaisseur de 19,6 ± 3,2 μm (Figure 2D). Ces valeurs sont comparables à celles rapportées pour la peau humaine indigène, c’est-à-dire 60-120 μm et 10-20 μm, respectivement69. Le nombre de couches viables est de 6-7, ce qui est inférieur à celui de la peau humaine indigène, soit environ 7-1470. L’analyse ultrastructurale des RhEs à différents moments du protocole de reconstitution (c.-à-d. 7, 10, 13 et 15 jours) révèle le processus de cornification des RhEs avec un nombre accru de couches de cornée au fil du temps (Figure 2E). Après 15 jours à la LAI, la SC du tissu RhE est composée d’environ 15 à 25 couches, ce qui est comparable à la valeur rapportée pour la peau humaine native (c.-à-d. 15 à 20 couches)69.

Figure 2
Figure 2: Kératinocytes primaires et épiderme humain reconstruit. (A)Image de microscopie à contraste de phase des kératinocytes primaires avant ensemencement sur des inserts. La barre d’échelle est de 50 μm. (B-C) Image de microscopie à champ lumineux H&E de RhE. La barre d’échelle est de 50 μm(B)et 25 μm(C). (D) Quantification de l’épaisseur de RhE et de SC (moyenne ± SEM, n=3). (E) Images de microscopie électronique de transmission des sections transversales de RhE après 7, 10, 13, et 15 jours à ALI. La barre d’échelle est de 4 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Selon leur stade de différenciation, les NHEKs se développant en 3D présentent différents profils d’expression des protéines en fonction de leur stade de différenciation. L’expression des protéines spécifiques pour la différentiation de keratinocyte de tôt-étape (c.-à-d., kératine 10), la différentiation de keratinocyte de tard-étape (c.-à-d., involucrin, loricrin, et filaggrin), et l’adhérence de keratinocyte (c.-à-d., desmoglein 1) dans RhEs a été déterminée utilisant la souillure SI. L’expression de l’involucrine apparaît plus majoritairement située dans la couche SG puisque son expression est initiée plus tôt au cours du processus de différenciation(figure 3D),tandis que la filaggrine et la loricrine sont exprimées dans les couches supérieures(figure 3B-C). L’expression de la kératine 10 a été trouvée dans toutes les couches viables, à l’exception de la couche SB (Figure 3E). Les RhEs présentent des jonctions desmosomales fonctionnelles, comme l’indique l’expression de la desmogléine 1 dans l’espace intercellulaire des couches épidermiques viables(figure 3F). Pour conclure, chacun des cinq marqueurs est exprimé et situé dans les couches épidermiques appropriées et se traduisent par un processus de différenciation épidermique sain.

Figure 3
Figure 3: Différenciation épidermique, adhérence tissulaire et intégrité tissulaire de l’épiderme humain reconstruit. (A)Image de microscopie à champ lumineux H&E de RhE. Images confocales de microscopie à fluorescence de(B)filaggrin (FLG), (C) loricrine (LOR), (D) involucrin (INV), (E) kératine 10 (K10), et (F) desmoglein 1 (DSG-1) représentés en magenta. La coloration des noyaux (DAPI) est représentée en bleu. La barre d’échelle est de 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les propriétés de barrière du modèle RhE ont été étudiées en évaluant à la fois la viabilité et l’intégrité des tissus. L’intégrité tissulaire a été déterminée après 15 jours en mesurant le TEER à l’aide d’un voltohmmètre. Les valeurs 2567 ± 415Ω,cm2 enregistrées pour les RhE traduisent la formation d’une barrière continue(figure 4A). Ces valeurs sont dans la plage avec celles rapportées pour les modèles RhE71,72,73,74. De plus, le temps d’exposition requis pour qu’un produit chimique cytotoxique de référence (c.-à-d. Triton X-100) réduise la viabilité tissulaire de 50 % (ET50)a été déterminé à l’aide d’un essai au bromure de thiazolyle bleu tétrazolium (MTT). La valeur ET50 mesurée pour le RhE était de 2,1 heures. Cette valeur se situe dans la plage d’acceptation d’autres modèles épidermiques 3D qui sont qualifiés pour une prédiction fiable de la classification de l’irritation (Ligne directrice 439 de l’OCDE)19.

Figure 4
Figure 4: Propriétés de barrière de l’épiderme humain reconstruit. (A)Intégrité tissulaire mesurée avec une résistance électrique transépithéliale (moyenne ± SEM, n=6). (B) ET50 déterminé en mesurant la viabilité des tissus (c.-à-d. essai MTT) lors d’une exposition topique à 78,3 μL de Triton X-100 à 1 % (sem moyen ±, n = 3).

La réactivité des RhEs a été étudiée sur les stimulus proinflammatory connus. Les RhEs ont été traités de manière systémique, c’est-à-dire l’addition de stimuli dans le milieu du compartiment basolatéral, en utilisant 100 μg/mL de lipopolysaccharide d’Escherichia coli (LPS) et 40 ng/mL de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Après 24 heures de stimuli, le milieu de culture cellulaire a été recueilli. La cytotoxicité a été mesurée à l’aide d’un test de lactate déshydrogénase (LDH) et comparée aux valeurs d’un perturbateur membranaire connu, le détergent Triton X-100(figure 5). Une augmentation significative (p < 0,05, ANOVA à sens unique, test de comparaison multiple de Dunnett) a été montrée dans l’activité de LDH dans RhEs traités avec Triton X-100. Les traitements de LPS et de TNF-α tous les deux n’ont pas montré être cytotoxiques.

Figure 5
Figure 5: La cytotoxicité mesurée par dosage de la lactate déshydrogénase (LDH). Les données sont présentées sous forme de valeurs relatives aux tissus témoins non traités (CTRL); moyenne ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). La signification a été testée avec l’ANOVA à sens unique, le test de comparaison multiple de Dunnett. L’astérisque indique une différence statistiquement significative par rapport à CTRL, ****p < 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La libération d’interleukine 1 alpha (IL-1α) et d’interleukine 8 (IL-8) dans le milieu RhE a été quantifiée à l’aide d’ELISAs. La figure 6 montre à la fois la libération quantifiée et relative d’IL-1α et d’IL-8 par les RhEs en cas de contestation avec LPS et TNF-α. Le traitement de LPS a eu comme conséquence une libération induite statistiquement significative (p < 0,05, unpaired Student' T-test) d’IL-8 (9,6 ± augmentation de 1,0 fois) et d’IL-1α (2,7 ± augmentation de 1,3 fois). TNF-α n’a pas induit de manière significative la libération IL-8, quoique l’on ait observé une tendance des niveaux accrus d’IL-8 (2,3 ± augmentation de 0,8 fois). Cependant, le TNF-α a déclenché de manière significative (p < 0,05, test T de Student non apparié) la libération d’IL-1α (1,8 ± augmentation de 0,5 fois).

Figure 6
Figure 6: Réponses pro-inflammatoires dans l’épiderme humain reconstruit. Concentrations d’IL-8 libéré par le RhE lors d’une contestation de 24 heures avec LPS(A)et TNF-α(B). Les données sont représentées par la moyenne ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Les données sont représentées comme la moyenne de la valeur relative par rapport au contrôle, tissus non traités (CTRL) ± SEM, n= 8 (LPS), n= 3 (TNF-α). La concentration d’IL-1α libère du RhE lors d’un défi de 24 heures avec LPS(D)et TNF-α(E). Les données sont représentées par la moyenne ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Les données sont représentées comme la moyenne de la valeur relative par rapport à CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). La signification a été testée par un étudiant non apparié' T-test. L’astérisque indique des différences statistiquement significatives par rapport à CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les RhEs sont largement utilisés comme outils de dépistage dans les domaines pharmaceutique et dermato-cosmétique36,75,76,77,78. Bien que plusieurs entreprises aient mis ces RhE à disposition dans le commerce, ils restent coûteux et limitent la possibilité de varier les paramètres de culture au besoin pour répondre aux nouvelles questions de recherche. Cet article décrit la procédure de production des RhEs internes d’une manière robuste et fiable et fournit une caractérisation détaillée des tissus obtenus pour confirmer la pertinence du modèle en tant qu’approche alternative à l’expérimentation animale.

Certaines des étapes du protocole sont cruciales pour assurer la différenciation appropriée de keratinocyte et la reproductibilité de RhE. Cela peut être réalisé en utilisant les cellules optimales, le(s) type(s) de milieu et les conditions de culture. Dans le modèle rhÉ proposé, les NHEKs néonatals ont été sélectionnés pour leur absence d’exposition antigénique, comparativement aux NHEKs adultes. En outre, les keratinocytes ont été limités à l’ethnicité caucasienne pour éviter la variabilité inter-espèces. Les kératinocytes primaires sont généralement utilisés pour leur capacité à différencier et à stratifier79. Ils peuvent être obtenus commercialement ou par isolement interne de la peau adulte80. La culture d’une lignée cellulaire (c.-à-d. HaCaT) sur une membrane en polycarbonate s’est avérée ne pas se différencier et a démontré une capacité altérée à synthétiser les lipides nécessaires à la formation de barrières81. Cependant, l’inclusion de différentes matrices de culture, telles que les hydrogels, le collagène, la fibrine et les cultures de sphéroïdes, a entraîné le développement réussi de modèles cutanés 3D78,82,83,84,85,86. Il a été démontré que les lignées cellulaires immortalisées, N/TERT, conviennent au développement des RhEs35. Les kératinocytes primaires restent prolifératifs lors de leur quatrième ou cinquième passage61, par conséquent, le protocole actuel inclut l’utilisation des kératinocytes dans leur troisième passage. De Vuyst et coll. ont démontré que la densité d’ensemencement cellulaire est importante et doit être suffisante (c.-à-d. ≥ 2,5 x 105 cellules/cm2) pour s’assurer que le milieu du compartiment basolatéral ne diffuse pas dans le compartiment apical. Une densité d’ensemencement insuffisante (c.-à-d. < 2.5x105 cellules/cm2) peut entraîner une incapacité à former une barrière appropriée, ce qui est indiqué par la diffusion du milieu du basolatéral au compartiment apical, entraînant des conditions de culture submergées au lieu d’ALI62. Milieu de croissance des kératinocytes sans sérum (voir Table des matériaux) a été préféré à des fins de reproductibilité, car il offre l’avantage de travailler avec un milieu chimiquement défini et réduit le risque de contamination. Ce milieu a une concentration de calcium plus faible (c.-à-d. 60 μM) et stimule donc la prolifération des kératinocytes87. L’augmentation de la concentration en calcium (c.-à-d. 1,5 mM) à partir de la première étape de la culture du RhE favorise la différenciation des kératinocytes et la formation de barrières cutanées et l’homéostasie49. En outre, le milieu ALI est complété par de l’acide ascorbique, qui s’est avéré crucial pour la formation de lipides SC et pour favoriser la différenciation52,53,54. Le milieu ALI contient également du KGF, qui est un facteur de croissance sécrété par les fibroblastes qui peuvent se lier aux récepteurs transmembranaires des kératinocytes et qui, lors de l’activation, a un double rôle dans la différenciation et la réparation des plaies.55,88. Il est important de rafraîchir le milieu ALI à des intervalles de temps spécifiques, pour fournir un apport constant de nutriments frais aux RhEs. L’utilisation d’un système de plaque porteuse est cruciale pour la culture du RhE à plus grande échelle (c.-à-d. 24 inserts/plaque). Il offre l’avantage de gagner du temps, de réduire le risque de contamination et laisse moins de place à l’introduction d’erreurs humaines. Il offre également la possibilité de culturer des RhEs dans un volume élevé de supports (c.-à-d. 1,5 mL), ce qui réduit le nombre requis de rafraîchissements moyens ALI. De plus, il offre la possibilité de transférer une plaque complète d’inserts sur une plaque avec un milieu frais, en évitant tout contact avec les inserts individuellement ou en découvrant le couvercle de la plaque.

Il convient de noter plusieurs limites du modèle RhE. Dans la peau humaine native, il y a un équilibre entre la prolifération des kératinocytes dans la couche basale et le détachement des cornéocytes dans le SC (c.-à-d. desquamation)89. Cependant, in vitro, la desquamation n’a pas lieu. Par conséquent, les cornéocytes restent attachés au RhE et forment un SC épais qui est physiologiquement moins pertinent. Par conséquent, il y a une durée de culture limitée des RhEs. De plus, ce modèle RhE est simple et direct, puisqu’il se compose d’un type de cellule singulier, c’est-à-dire le kératinocytes, qui est le type cellulaire le plus abondant de l’épiderme. Cependant, il existe d’autres types de cellules résidant dans l’épiderme, tels que les mélanocytes, les cellules dendritiques (c.-à-d. les cellules de Langerhans), les cellules T (p. ex. CD8+ cellules), et cellules de Merkel13. Pour améliorer la pertinence physiologique du modèle cutané, les chercheurs ont rendu les modèles cutanés plus complexes en ajoutant des mélanocytes38 , les cellules immunitaires39, ou des cellules dérivées du patient90. Il faut garder à l’esprit que les propriétés de barrière des modèles de peau humaine sont différentes de celles de la peau humaine native, en raison notamment d’une composition lipidique différente de SC et d’une perméabilité de barrière plus élevée 91,92,93,94,95. Cependant, plusieurs études ont rapporté des changements dans les propriétés de barrière des modèles de peau humaine par la culture sous hypoxie96 ou diminution de l’humidité relative97, la modulation de la matrice cutanée avec le chitosane98, et altération des acides gras libres dans le milieu de culture99. D’ailleurs, dans les RhEs simples et plus complexes, les conditions de culture et la composition moyenne peuvent être modulées pour imiter des dispositifs pathologiques. En remettant en cause le modèle avec des cytokines, une morphologie anormale100 et des altérations des niveaux d’expression des gènes et des protéines peuvent être établies qui sont généralement observées dans les troubles cutanés courants, tels que la dermatite atopique et le psoriasis35,101,102,103,104,105. Faire taire des gènes spécifiques dans les kératinocytes avant d’initier le processus de reconstitution du modèle 3D est une autre approche utilisée pour imiter les caractéristiques des troubles de la peau et étudier de nouvelles solutions thérapeutiques106,107. En plus de modéliser une couche épidermique uniquement, un compartiment cutané peut être inclus dans le modèle (c.-à-d. des équivalents de peau humaine nommés ou des modèles de pleine épaisseur) en intégrant des fibroblastes dans une matrice de collagène avant la reconstitution du RhE, ce qui le rend plus physiologiquement pertinent et adapté aux études liées au vieillissement et à la cicatrisation des plaies.108,109,110. En plus, des sphéroïdes tumoraux ont été ajoutés aux équivalents de peau humaine pour étudier la progression du mélanome111,112. Les dernières avancées dans le domaine des modèles de peau sont la bio-impression et la peau sur puce. Plusieurs groupes de recherche ont récemment réussi à développer des équivalents cutanés bio-imprimés (perfusables)45,113,114. Le protocole proposé tire parti d’un format à 24 puits et d’une plaque porteuse, évitant ainsi les inserts à manipuler individuellement. Cependant, l’échelle de l’étude est encore assez limitée et manque d’automatisation. En mettant en œuvre l’utilisation de la bio-impression ou de la peau sur puce, des modèles de peau plus petits peuvent être utilisés avec des processus plus automatisés et à plus grande échelle.

Le RhE décrit dans ce protocole a des similitudes multiples aux modèles épidermiques commerciaux déjà développés et bien caractérisés. L’analyse morphologique a démontré que bien que le nombre de couches viables dans le modèle RhE proposé soit inférieur à celui de la peau humaine indigène (c.-à-d. 6-7 par rapport à 7-14), il est comparable à celui du modèle EpiDerm RhE (c.-à-d. 8-12)70. De la même manière que les modèles EpiDerm, EpiSkin et SkinEthic, la couche rhE supérieure montre un motif de tissage de panier de couches de cornée densément emballées28. De plus, l’analyse TEM a révélé que le nombre de couches SC dans le modèle RhE proposé (c.-à-d. 15-25) est comparable à celui de l’EpiDerm (c.-à-d. 16-25)70. Dans l’ensemble, le modèle rhésus proposé démontre une structure similaire à celle d’autres modèles épidermiques commercialisés, imitant l’épiderme humain natif. L’intégrité tissulaire mesurée par TEER est dans la gamme avec les modèles rhe commerciaux (c.-à-d., entre 3000-5600Ω.cm2)71,72,73 et d’autres RhE internes (c.-à-d. environ 5000 Ω.cm2)74,115. Le modèle RhE proposé montre être bien différencié, comme indiqué par la présence et la localisation correcte des marqueurs de différenciation et d’adhésion tissulaire. De plus, le modèle rhÉ proposé montre qu’il réagit aux stimuli pro-inflammatoires (c.-à-d. LPS et TNF-α).

En conclusion, le protocole actuel montre comment produire des RhE de manière fiable et à une échelle relativement grande pour répondre aux besoins des chercheurs dans les établissements universitaires et privés. Le modèle rhÉ proposé montre avoir une morphologie, une différenciation épidermique et une réactivité biologique similaires à celles d’autres modèles commerciaux existants. Il fournit un outil alternatif pour le domaine pharmaceutique et dermato-cosmétique lorsque l’accès à un modèle de peau pertinent est requis.

Disclosures

Marc Eeman et Benedetta Petracca sont employés par Dow Silicones Belgium. Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la subvention Marie Skłodowska-Curie, avec la convention de subvention n° 765602 financé ces travaux. Tous les auteurs reconnaissent le soutien de la Fondation Adolphe Merkle et de l’Université de Ferrare et remercient Dow Silicones Belgium. Le Dr Miguel Spuch-Calvar est reconnu pour avoir préparé les images graphiques du processus de culture du RhE. Les auteurs remercient la Dre Barbara Drasler, la Dre Franco Cervellati et la Dre Agnès Tessier pour leur soutien technique et leurs discussions.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich A6283 Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.
Antibiotic-antimycotic (100x) Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15240062
Aqueous Eosin Y solution Sigma Aldrich HT110280 Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich or Merck C8106 or 1.02378.0500 Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 °C.  It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.
DAPI Roche 10236276001 Prepare a stock at 100 μg/mL and store aliquots at -20 °C. Working conditon is 1 μg/mL.
Entellan mounting medium Merck 1.07960.0500 Mounting medium for H&E staining.
EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium) Thermo Fisher Scientific (Gibco) MEPI500CA Contains 0.06 mM of Ca2+.
Ethanol absolute Any supplier N/A
Formalin 10% Leica Biosystems 3800770
Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x) Thermo Fisher Scientific (Gibco) S0015 To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 μg/mL hydrocortisone,5 μg/mL bovine transferrin, and 0.01 µg/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.
Isopropanol Biosolve B.V. 0016264102BS
Kaiser's glycerol gelatine, phenol-free Merck 1.08635.0100 Mounting medium for IF staining.
Keratinocyte growth factor (KGF) R&D Systems 251-KG-050 Reconstitute KGF protein at 100 μg/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20°C. 
Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit Roche 4744926001
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate  Sigma-Aldrich A8960 Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20°C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.
Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5 Sigma-Aldrich L4524 Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 °C. Working concentration is 100 μg/mL. 
Mayer’s Haematoxylin Sigma-Aldrich MHS80
Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) Lonza 00192906 Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.
Phosphate-buffered saline Thermo Fisher Scientific (Gibco) 10010056 or 10010-015 Reference numbers can vary between countries.
Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-α) ImmunoTools 11344483 Prepare a stock of 100 μg/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL
Sterile ultrapure water Any supplier N/A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93426
Trypan blue (0.4% [v/v]) Any supplier N/A
Trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific (Gibco) R007100
Trypsin/EDTA (0.05% [v/v]) Thermo Fisher Scientific (Gibco) 25300054
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam Ab150113
Tri-sodium citrate dihydrate Merck 1.06448.0500 For antigen retrieval buffer for IF staining. 
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Dylight 488) Agrisera AS09 633
Filaggrin Mouse antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-53243
Involucrin Rabbit antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-33742
Keratin 10 Mouse antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP2-32962
Desmoglein-1 Mouse antibody  BioTechne (Novus Biologicals) MAB944
Loricrin Rabbit antibody BioTechne (Novus Biologicals) NBP1-33610

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Bioingénierie Numéro 171 Épiderme humain reconstitué équivalents épidermiques humains kératinocytes primaires épiderme études in vitro.
Cultiver un épiderme humain reconstruit tridimensionnel à grande échelle
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