Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Adfærdsmæssig vurdering af visuel funktion via optomotorisk respons og kognitiv funktion via Y-Maze hos diabetiske rotter

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61806
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1, 1,2, 1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Neuroscience, Emory University, 4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Neural degeneration i både øjne og hjerne som følge af diabetes kan observeres gennem adfærdsmæssige tests udført på gnavere. Y-labyrinten, et mål for rumlig kognition, og den optomotoriske respons, et mål for visuel funktion, giver begge indsigt i potentielle diagnoser og behandlinger.

Abstract

Den optomotoriske respons og Y-labyrinten er adfærdstest, der er nyttige til vurdering af henholdsvis visuel og kognitiv funktion. Den optomotoriske respons er et værdifuldt værktøj til at spore ændringer i rumlig frekvens (SF) og kontrast følsomhed (CS) tærskler over tid i en række retinale sygdom modeller, herunder diabetisk retinopati. På samme måde kan Y-labyrinten bruges til at overvåge rumlig kognition (målt ved spontan vekslen) og sonderende adfærd (målt ved en række indgange) i en række sygdomsmodeller, der påvirker centralnervesystemet. Fordelene ved den optomotoriske respons og Y-labyrinten omfatter følsomhed, testhastighed, brug af medfødte reaktioner (træning er ikke nødvendig) og evnen til at blive udført på vågne (ikke-bedøvede) dyr. Her er protokoller beskrevet for både optomotorisk respons og Y-labyrinten og eksempler på deres anvendelse vist i modeller af type I og type II diabetes. Metoder omfatter forberedelse af gnavere og udstyr, udførelsen af optomotorisk respons og Y-labyrinten og dataanalyse efter testen.

Introduction

Over 463 millioner mennesker lever med diabetes, hvilket gør det til en af de største globale sygdomsepidemier1. En af de alvorlige komplikationer, der opstår som følge af diabetes er diabetisk retinopati (DR), en førende årsag til blindhed for erhvervsaktive amerikanske voksne2. I de næste 30 år forventes andelen af udsatte for DR at blive fordoblet, så det er afgørende at finde nye måder at diagnosticere DR på i de tidligere faser for at forebygge og afbøde DR-udviklingen3. DR har traditionelt været anset for at være en vaskulær sygdom4,5,6. Men nu med tegn på neuronal dysfunktion og apoptose i nethinden, der går forud for vaskulær patologi, DR er defineret til at have neuronale og vaskulære komponenter4,5,6,7,8,9. En måde at diagnosticere DR ville være at undersøge neurale abnormiteter i nethinden, et væv, der kan være mere sårbare over for oxidativ stress og metabolisk stamme fra diabetes end andre neurale væv10.

Fald i kognitive og motoriske funktion også forekomme med diabetes og er ofte korreleret med retinale ændringer. Ældre personer med type II diabetes skildre dårligere baseline kognitive præstationer og viser mere forværret kognitiv tilbagegang end kontrol deltagere11. Derudover er nethinden blevet etableret som en forlængelse af centralnervesystemet og patologier kan manifestere sig i nethinden12. Klinisk, forholdet mellem nethinden og hjernen er blevet undersøgt i forbindelse med Alzheimers og andre sygdomme, men er ikke almindeligt undersøgt med diabetes12,13,14,15,16. Ændringer i hjernen og nethinden under udviklingen af diabetes kan udforskes ved hjælp af dyremodeller, herunder STZ rotte (en model af type I diabetes, hvor toksinet, streptozotocin eller STZ, bruges til at beskadige bugspytkirtel betaceller) og Goto-Kakizaki rotte (en polygen model af type II diabetes, hvor dyr udvikler hyperglykæmi spontant på omkring 3 uger). I denne protokol gives en beskrivelse af Y-labyrinten og den optomotoriske reaktion for at vurdere henholdsvis kognitive og visuelle ændringer hos diabetiske gnavere. Den optomotoriske respons (OMR) vurderer rumlig frekvens (svarende til synsskarphed) og kontrastfølsomhed ved at overvåge karakteristiske refleksive hovedsporingsbevægelser for at måle visuelle tærskler for hvert øje17. Rumlig frekvens refererer til tykkelsen eller finheden af søjlerne, og kontrastfølsomhed refererer til, hvor meget kontrast der er mellem søjlerne og baggrunden (figur 1E). I mellemtiden tester Y-labyrinten kortsigtet rumlig hukommelse og sonderende funktion, observeret gennem spontane vekslen og indgange gennem labyrintens arme.

Begge forsøg kan udføres hos vågne, ikke-bedøvede dyr og har den fordel at udnytte dyrs medfødte reaktioner, hvilket betyder, at de ikke kræver træning. Begge er relativt følsomme, idet de kan bruges til at opdage underskud tidligt i udviklingen af diabetes hos gnavere og pålidelige, idet de producerer resultater, der korrelerer med andre visuelle, retinale eller adfærdsmæssige tests. Derudover kan brug af OMR og Y-labyrinten i forbindelse med tests som elektroretinogram og optisk sammenhængstomografiscanninger give oplysninger om, hvornår retinale, strukturelle og kognitive ændringer udvikler sig i forhold til hinanden i sygdomsmodeller. Disse undersøgelser kan være nyttige til at identificere neurale degenerationer, der opstår på grund af diabetes. I sidste ende kan dette føre til nye diagnostiske metoder, der effektivt identificerer DR i de tidlige stadier af progression.

OMR og Y-labyrintsystemerne, der bruges til at udvikle denne protokol, er beskrevet i materialetabellen. Tidligere forskning om OMR, af Prusky et al.18, og Y-labyrinten, af Maurice et al.19, blev brugt som udgangspunkt for at udvikle denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee og i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af laboratoriedyr (NIH Publications, 8. udgave, opdateret 2011).

1. Den optomotoriske respons (OMR)

  1. Opsætning af OMR-apparatet (oplysninger om apparater og software i materialetabellen)
    1. Vælg den passende størrelse platform til gnaveren: mus, rotte eller stor / nedsat rotte (figur 1A).
    2. Åbn OMR-softwaren, som skal åbnes for et vindue med flere faner af muligheder og et live videofeed af indersiden af OMR/virtual drum (Figur 1B). Zoom ind eller ud med videokameraet efter behov, så platformen og dens omgivelser er synlige.
    3. Bemærk ikonerne langs venstre side af livebilledet (Figur 1C). Klik på stjerneikonet og ikonet for roterende striber, så både den grønne stjerne og de grønne roterende striber forsvinder fra live feedet.
    4. Klik på kompasikonet , så der vises en grøn cirkel og to vinkelrette linjer. Stræk den grønne cirkel, så den flugter perfekt med den sorte cirkel på platformen, hvilket sikrer, at OMR er perfekt justeret.
    5. Klik på kompasikonet, fordi det ikke er nødvendigt at se cirklen under testen. Klik på det grønne stjerneikon og ikonet for grønne roterende striber for at få dem til at dukke op igen. Bemærk, at de grønne striber roterer i samme retning som striberne i tromlen, så forskeren kan kende stribernes retning.
    6. Klik på fanen Test. Klik på fanen Psykofysik under Test. Vælg Frekvens under Tærskel for at måle rumlig frekvens.
      BEMÆRK: OMR-softwaren bruger et trappeparadigme til automatisk at beregne rumlig frekvens (SF). Kontrasten vil blive fastholdt på 100%.
    7. Klik på fanen Forudindstillinger under Test. Vælg standardindstillingerne for Mouse18 eller Rat20.
    8. Klik på fanen Blanking under Test. Markér afkrydsningsfeltet Tom ved sporing, som sætter striberne/tomme computerskærmene i tromlen på pause, når der højreklikkes på musen.
    9. Klik på fanen Resultater , hvor resultaterne af testen vises.
  2. Vurder rumlig frekvens
    1. Placer gnaveren på den cirkulære platform i midten af virtual reality-kammeret, der består af fire computerskærme, der viser lodrette sinusbølgeriste, der kredser om kammeret med en hastighed på 12 °/s (figur 1D).
    2. Bemærk, at videokameraet placeret øverst i kammeret projicerer gnaverens adfærd live på computerskærmen.
    3. Kig efter tilstedeværelsen eller fraværet af refleksive handlinger fra gnaverens hoved, da gitterene bevæger sig i uret eller mod uret retning. Sørg for, at illustrerede søjler er synlige i programmet – disse viser gitterbevægelsens retning.
      1. Hold øje med gnaverens hoved for at bevæge sig i samme retning som ristene. Vent, indtil der er en glat forfølgelse, ikke uregelmæssige byger af hovedbevægelse, for at tælle det som sporing.
      2. Klik på Ja eller Nej efter behov. Bemærk, at SF vil starte med 0,042 cyc /deg og justere med hvert ja og nej til at blive lettere eller vanskeligere (Figur 1E). Klik på Nulstil, hvis testen skal nulstilles på grund af utilsigtet eller forkert klik på ja og nej.
    4. Når gnaveren testes, skal du sørge for at holde stjernen placeret over gnaverens hoved.
      BEMÆRK: Dette har to effekter: 1) Det opretholder den korrekte rumlige frekvens. Hvis stjernen er placeret mellem skuldrene, for eksempel, vil den rumlige frekvens være lavere, og søjlerne vil være lettere at se, hvilket resulterer i en falsk høj score. 2) For gnavere med små hovedbevægelser gør stjernen det lettere at måle, om hovedet rent faktisk bevæger sig.
    5. Hold øje med, at systemet siger "Udført", når gnaverens rumlige frekvens nås. Bemærk, at knapperne Ja og Nej ikke længere kan klikkes.
    6. Klik på fanen Resultater , som vil vise den rumlige frekvens for venstre øje, højre øje, og kombinerede øjne.
      BEMÆRK: Nogle gange er softwaren indstillet sådan, at resultaterne er vendt, dvs. det højre øje rapporteres som venstre øje, og venstre øje rapporteres som det højre øje. Dette blev opdaget ved vurderingen af gnavere, der kun havde et øje læsioneret i en grøn stær model.
  3. Vurder kontrastfølsomhed
    BEMÆRK: Kontrastfølsomhedstest kan udføres umiddelbart efter det rumlige frekvensmålingstrin eller alene på samme dag eller en anden dag, hvis gnaveren fremstår træt efter rumlig frekvenstest (følg trin 1-2.2, hvis det kun testes kontrastfølsomhed).
    1. Klik på fanen Test og derefter på fanen Psykofysik. Vælg Kontrast (enkelt) under Tærskel for at måle kontrastfølsomhed.
    2. Også ved hjælp af en trappe paradigme, start riste med SF konstant på toppen af kontrast følsomhed (CS) kurve. Det kan du gøre ved at klikke på fanen Stimulus og derefter under fanen Riste . I feltet Rumlig frekvens skal du skrive 0,064 for rotter og 0,103 til mus.
    3. Begynd kontrasten ved 100% og kig efter de samme refleksive hovedbevægelser som set under rumlig frekvenstest. Bemærk, at kontrasten vil falde, efterhånden som testen skrider frem, indtil gnaveren ikke længere har refleksive hovedbevægelser som reaktion på stimulusen (figur 1E).
    4. Hold øje med, at systemet siger "Udført" og ja - og nejknapperne ikke længere kan klikkes, når gnaveren ikke længere reagerer på den visuelle stimulus, og kontrastfølsomhedstærsklen er nået. Klik på fanen Resultater , hvor kontrastfølsomheden for venstre øje, højre øje og kombinerede øjne vises.
  4. Udfør analyse efter test
    1. For diabetisk retinopati undersøgelser, hvor begge øjne forventes at have lignende underskud, bruge den kombinerede score (gennemsnit af højre og venstre øjne) til analyse. For modeller, der forårsager differentialskader på øjnene (dvs. blast skade eller grøn stær), holde venstre og højre øje data adskilt.
    2. For rumlig frekvens skal du bruge rå scorer (dataene fra fanen Resultater ) til analyse og gennemsnit af disse scorer sammen efter gruppe (dvs. diabetiker, kontrol osv.).
    3. For kontrastfølsomhed skal du bruge den rå værdi til at beregne Michelson-kontrastens rapporterede kontrastfølsomhed ud fra en tidligere måling af skærmens luminans.

2. Y-labyrinten

  1. Forbered gnavere til test
    1. Tilpas gnavere til rummet i 30 minutter før test.
      BEMÆRK: Forskeren kan forblive i rummet med lysene tændt, men bør forblive tavs i løbet af denne tid.
    2. Rengør Y-labyrinten med afsprit løsning sikkert for dyr og tørre væk alle desinficerende løsning med papirhåndklæder. Sørg for, at labyrinten er tør.
  2. Udfør Y-labyrinten
    1. Mærk den oprindelige arm af Y-labyrinten som B og de andre 2 arme som A og C (figur 2A). Placer en gnaver i armen tættest på forskeren (arm B) nær midten af Y-labyrinten. Når gnaveren er placeret, skal du starte timeren (detaljer om labyrint og timer i Materialetabel).
      1. Tillad hver gnaver at udforske Y-labyrinten i 8 min. Tag optagelser i løbet af denne tid og bemærk eventuelle observationer. Sid flere meter væk fra labyrinten, mens du holder den i syne og undgå at lave støj.
      2. Registrer startstedet som A, og hver gang gnaveren kommer ind i en ny arm, skal du registrere gnaverens nye placering (figur 2B). Definer en indgang som alle fire lemmer af gnaveren, der er i en af armene.
      3. Hold øje med gnavere at skjule og forblive stationære i den ene arm af labyrinten. Hvis gnaveren forbliver på samme sted i mere end 60 s og ikke ser ud til at vise sonderende adfærd, skal du flytte gnaveren mod midten af Y-labyrinten og fortsætte forsøget.
    2. Efter hver gnaver skal du fjerne afføring og rense labyrinten med desinficerende opløsning.
      1. Sørg for, at al afspritopløsning tørres væk med papirhåndklæder, og labyrinten er helt tør, før du placerer den næste gnaver i labyrinten.
  3. Beregn spontan vekslen og sonderende adfærd
    1. Beregn sonderende adfærd som det samlede antal poster, der er foretaget i løbet af 8 min.
    2. Beregn rumlig kognition målt ved spontan vekslen:
      antallet af vellykkede generatorer/(det samlede antal poster - 2)
      1. Definer en vellykket vekslen, når gnaveren bevæger sig ind på tre forskellige steder sekventielt (Eksempel: ABC, CAB, BCA osv.). Bemærk hver vellykket vekslen (figur 2B).
      2. Hvis bevægelserne blev registreret som ACABCABABCABC, skal du se bort fra de to oprindelige startsteder ved beregning af spontan vekslen (således at der er 11 bevægelser i nævneren). Tæl antallet af nøjagtige bevægelser (nøjagtige bevægelser = 8). Beregn procentens nøjagtighed som: 8/(13 - 2) = 72,7%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OMR betragtes som vellykket, hvis rumlige frekvens- og kontrastfølsomhedstærskler kan opnås fra en gnaver. Her illustreres brugen af OMR til at vurdere rumlig frekvens i naiv kontrol Brown-Norway og Long-Evans rotter, både unge (3-6 måneder) og alderen (9-12 måneder). Brown-Norway rotter viser typisk en højere baseline rumlig frekvens end Long-Evans rotter. Derudover blev der observeret en aldrende effekt på rumlig frekvens hos Long-Evans rotterne (figur 3A). Data blev analyseret ved hjælp af en envejs ANOVA efterfulgt af Holms-Sidak post-hoc sammenligninger, da de unge og ældre resultater kom fra forskellige kohorter.

Brugen af OMR til at vurdere kontrastfølsomhed er illustreret i STZ-modellen af type I-diabetes, der modtog træningsinterventionsbehandling. Long-Evans rotter blev tildelt en af de fire grupper: kontrol, kontrol + aktiv, diabetiker, og diabetiker + aktiv. Diabetiske rotter fik intravenøse injektioner af toksinet STZ at beskadige bugspytkirtlen betaceller og fremkalde hyperglykæmi. Aktive rotter fik 30 min løbebåndsøvelse, 5 dage om ugen. Inaktive rotter havde et aflåst løbebånd. Der blev observeret betydelige underskud i kontrastfølsomhed (figur 3B) hos diabetiske rotter. Motion behandling reduceret disse underskud (figur 3B). Disse resultater viser, at OMR er nyttig både til påvisning og sporing af retinale underskud over tid og til vurdering af virkningerne af behandlinger og interventioner på retinal sygdom22. Data blev analyseret ved hjælp af en tovejs gentagne foranstaltninger ANOVA efterfulgt af Holms-Sidak post-hoc sammenligninger. Bemærk, at resultaterne kan præsenteres som data, der er normaliseret til kontrol (figur 3B) eller som råværdier (figur 3A; for rumlig frekvens: i cyklusser/grad eller c/d; for kontrastfølsomhed: vilkårlige enheder eller a.u.). Typisk, 6-10 dyr, afhængigt af sværhedsgraden af skade, er nødvendige for at finde en betydelig forskel med OMR.

Y-labyrinten betragtes som vellykket, hvis gnaveren kommer ind i mindst 5 arme af labyrinten inden for 8 minutter. Her illustreres Y-labyrintens evne til at vurdere kognitiv funktion og sonderende adfærd i Goto-Kakizaki-rotten, en polygen, ikke-overvægtig model af type II-diabetes, der udvikler moderat hyperglykæmi, der begynder ved 2-3 uger og ikke kræver insulintilskud. Signifikante underskud i rumlig kognition, målt ved spontan vekslen (Figur 4A), og sonderende adfærd, målt ved antallet af indgange (Figur 4B), blev observeret hos Goto-Kakizaki rotter sammenlignet med Wistar kontrol begynder ved 7 uger. Kontrol rotter synes at vise et fald i sonderende adfærd fra 4 til 8 uger. Denne tendens ses også i langtidsundersøgelser (8+ måneder). Faldet i bevægelse kan skyldes manglende nyhed med gentagen labyrint eksponering eller en generel nedsat bevægelse med alderen. Kontrolrotter ser ud til at vise en stigning i rumlig kognition fra 4 til 8 uger. Denne tendens observeres ikke i langsigtede undersøgelser, hvor dyrene køres månedligt i stedet for ugentligt (faktisk observeres et fald med aldring ofte), og dermed kan denne stigning i rumlig kognition skyldes en læringseffekt ved at køre labyrinten en gang om ugen. Data blev analyseret ved hjælp af en tovejs gentagne foranstaltninger ANOVA efterfulgt af Holms-Sidak post-hoc sammenligninger. Mindst 10 dyr, afhængigt af sværhedsgraden af skade, er typisk nødvendige for at finde en betydelig forskel med Y-labyrinten.

Denne protokol genererede visuelle funktions- og kognitive funktionsdata i modeller af type I- og type II-diabetes. Scores for individuelle dyr blev i gennemsnit sammen og bruges til at opdage betydelige forskelle mellem behandlingsgrupper tidligt i udviklingen af diabetes. Udførelse af både retinale og kognitive vurderinger over tid i modeller af systemiske sygdomme som diabetes giver mulighed for overvågning af det tidsmæssige udseende af underskud over tid. For eksempel, i Goto-Kakizaki model, retinale funktion underskud viste sig at gå forud kognitive og sonderende adfærd underskud23 (Figur 5).

Figure 1
Figur 1: Opsætning af OMR-udstyret. (A) Billede af mus, rotte og store eller svækkede rotteplatforme. (B) Billede af computerskærmen under testen. (C) Panel af knapper under afprøvning. (D) Skematisk af rotte på platform i kammer. (E) Eksempelgradienter, der viser stigende rumlig frekvens og kontrastfølsomhed. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Opsætning af Y-labyrint udstyr. (A) Billede af Y-labyrinten med våben mærket. (B) Billede af en laboratorienotesbog med eksempel på Y-labyrintoptagelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Brug af OMR til at spore visuel funktion. (A) Geografisk frekvenstærskler for unge (n = 11) og ældre (n = 15) Brun-Norge (BN) og unge (n = 20) og ældre (n = 13) Langdampningsrotter (LE). Dette tal præsenterer Brown-Norway data fra Feola et al., 201921. (B) Brug af OMR til at spore reduceret retinal funktion over tid og beskyttende virkninger af motion i en STZ rotte model af type I diabetes. Kontrast følsomhed tærskler for inaktive diabetiske rotter vs aktive diabetiske rotter og kontrol rotter. Mørkegrå stjerner repræsenterer forskelle mellem både kontrolgrupper og begge diabetiske grupper. Orange stjerner repræsenterer forskelle mellem inaktive diabetiske rotter og aktive diabetiske rotter. Dette tal viser data fra en delmængde af rotter fra Allen et al., 201822. Gennemsnitlig ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Brug af Y-labyrinten til at spore kognitiv funktion og sonderende adfærd over tid i Goto-Kakizaki-modellen af type II-diabetes sammenlignet med Wistar-kontroller. (A) Kognitiv funktion (spontan vekslen) for Goto-Kakizaki (diabetiker) og Wistar (kontrol) rotter fra 4 til 8 uger. (B) Sonderende adfærd (antal indgange) fra 4 til 8 uger. Gennemsnitlig ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Stjerner repræsenterer forskelle mellem Goto-Kakizaki og Wistar rotter på hvert tidspunkt. Kun én kohorte rotter blev kørt fra 4 uger til 8 uger (GK: n = 7; Wistar: n = 10). Alle andre kohorter blev kørt fra 5 uger til 8 uger (GK: n = 22; Wistar: n = 23) for i alt n 29 (GK) og 33 (Wistar) i uge 5 til 8. Dette tal er ændret fra Allen et al., 201923. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Tidslinje over funktionelle ændringer i Goto-Kakizaki-modellen af type II-diabetes. Efter fremkomsten af hyperglykæmi var de første ændringer, der blev observeret i Goto-Kakizaki-rotten, i retinal funktion, målt ved elektroretinogram (ERG), der optrådte ved 4 uger. Kognitive og sonderende adfærdsændringer dukkede op efter 6 uger. Dette tal er ændret fra Allen et al., 201923. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OMR og Y-labyrinten giver mulighed for ikke-invasiv vurdering af visuel funktion og kognitive funktionsunderskud hos gnavere over tid. I denne protokol blev OMR og Y-labyrinten demonstreret for at spore visuelle og kognitive underskud i gnavermodeller af diabetes.

Kritiske trin i protokollen

The OMR

Nogle vigtige punkter at overveje, når du udfører OMR at vurdere visuel funktion er de anvendte testparametre, eksperimentel design og timing af test, og erfaring med forskeren udfører målingerne. Et af de mere kritiske trin i protokollen er at sikre, at parametrene er angivet korrekt. Derudover skal OMR-kammeret som en del af opsætningen rengøres med afspritningsopløsning eller et andet godkendt desinfektionsmiddel før og efter hver gnaver. Det er også vigtigt, at forskeren, der udfører foranstaltningerne, er blevet uddannet og har erfaring med at udføre foranstaltningerne. De bedste resultater ses, når gnavere er rolige og akklimatiserede til rummet ved at forlade dem i deres bure i 30 minutter, før de starter eksperimentet. Det er også vigtigt at bestemme baseline rumlige frekvens og kontrast følsomhed, når du begynder at arbejde med en ny stamme og at bemærke, at ikke alle stammer vil udvise de samme baseline niveauer. Brown-Norge rotter har større baseline rumlige frekvens end Long-Evans rotter. I mellemtiden, nogle stammer af albino rotter synes at have kompromitteret rumlige frekvens24, mens andre stammer af albino rotter ikke udviser sporing adfærd på alle. Mange faktorer kan bidrage til den begrænsede respons af albino dyr på OMR: forstyrret kikkert på grund af differentialdecussation af optiske nervefibre, mangel på melanin i bagsiden af øjet, og en stor andel af dobbelt opsin kegler. Uanset hvad, albino rotter kan ikke være egnede forsøgspersoner til OMR test, da deres præstationer kan være for tæt på grænsen for påvisning.

Y-labyrinten

En kritisk komponent i udførelsen af Y-labyrinten indebærer minimering af forstyrrelser i løbet af optagelsesperioden. Den indledende placering af gnaveren i labyrinten bør kun ske efter at have tilladt gnaveren at akklimatisere sig til rummet i 30 minutter. Dette gør det muligt for gnaveren at blive tilpasset det nye miljø og forhindrer, at forvirrende faktorer påvirker gnaverens normale adfærd. Det er meget vigtigt at minimere forstyrrelser under hvert forsøg. Dette omfatter at undgå høje lyde og sørge for, at forskeren er ude af syne af gnaveren. Disse distraktioner kan forårsage stress for gnaveren. Det er også vigtigt at bemærke, at væggene i rummet skal forblive så nøgne som muligt med en neutral farve. Enhver lyse farver på væggene eller plakater kan distrahere gnaveren og kan påvirke deres sonderende adfærdsmønster.

Begrænsninger af metoden og ændringer og fejlfinding af metoden

The OMR

En potentiel begrænsning af OMR er, at det kan blive påvirket af experimenter bias, og forskellige eksperimentatorer kan have lidt forskellige resultater, da OMR scoring er subjektiv. Det kan være let at gå glip af et hoved bevægelse, der er for subtil eller klassificere sonderende adfærd som et hoved bevægelse. Fordi bias kan påvirke OMR resultater, er det bedst, hvis eksperimentatoren er maskeret til behandling gruppe og undersøgelse design, når det er muligt. Udviklingen af en automatisk OMR eller sammenligning af resultaterne af to testere kan også bidrage til at mindske eksperimentator bias.

Et almindeligt problem, der kan opstå under OMR-testen, er, når gnaveren gentagne gange hopper ud af platformen, hvilket gør det vanskeligt at opnå en visuel tærskel. Hvis dette sker, skal du være opmærksom på det og forsigtigt placere rotten tilbage på platformen; det kan også være nødvendigt at måle rotten igen den følgende dag. Derudover kan rotter, der aldrig er blevet målt før, engagere sig i sonderende adfærd, når de placeres i OMR. Hvis dette er et problem, kan det at have en ekstra baseline-måling om ugen efter den første måling hjælpe med at forbedre nøjagtigheden. Test med store mængder af disse adfærdsmønstre bør kasseres.

Andre faktorer såsom alder eller olfaktoriske signaler kan også bidrage til uønsket aktivitet. Derfor er det vigtigt at designe eksperimenter i overensstemmelse med tidslinjen for visuel systemudvikling hos rotter og at rengøre platformen og kammeret grundigt før og efter test af hver gnaver. Tidspunktet på dagen, hvor OMR-målingerne udføres, bør også overvejes, da tidligere undersøgelser har vist, at der er døgnrytmer i rumlig frekvens25. At køre rotterne før middag synes at være bedst for deres fokus (Rachael Allens laboratorium - personlige observationer). Hvis rotter bliver for distraheret, kan det hjælpe med forsigtigt at trykke på ydersiden af OMR.

Den hastighed, hvormed testen udføres, kan også påvirke resultaterne. Foranstaltninger kan blive mindre nøjagtige efter 30 minutter eller deromkring, hvis gnavere mister interessen for stimulus. Derfor kan der opnås mere nøjagtige resultater, når målingerne foretages i ca. ≤20 min. Varigheden af et enkelt forsøg (for enten SF eller CS) er 5-10 min for en ekspert og 30 min for en nybegynder. Hvis en gnaver viser lidt bevægelse, bruger det meste af sin tid på at pleje eller på anden måde ikke ser i retning af søjlerne, kan den være træt. Gnaveren kan køres igen på en anden dag. Derudover kan SF og CS test udføres på forskellige dage, især for nyere testere, der kan være langsommere. Den hyppighed, hvormed testen udføres, kan også påvirke resultaterne - at udføre den ugentligt eller hver anden uge hjælper dyrene med at forblive akklimatiserede til testen, men at udføre det hver dag eller hver anden dag kan forårsage hyperacuity26. Vi kører ikke mere end én prøve om dagen, selvom vi ofte kører både SF og CS på samme dag eller endda i samme møde. Kumulativ daglig tid til at køre en kohorte af rotter (n = 10) er 2 timer for en ekspert.

OMR måler hvert øje uafhængigt, hvilket resulterer i separate visuelle scorer for hvert øje. I Morrison og mikroperle modeller af grøn stær og i en synsnerve knuse model, har vores laboratorium ikke observeret nogen indvirkning af det beskadigede øje på ubeskadigede eye27. I en blast model, med blast rettet mod det ene øje, det kontralaterale øje viste skader, men dette kan også skyldes en delvis blast effekt28. I kontrolrotter bør der ikke være nogen forskel i resultater mellem uret eller mod uret retninger, men nogle gnavere kan have en bias; Det ville derfor være bedst at skifte retning29, hvis OMR-systemet ikke veksler automatisk.

Afhængigt af sygdomsmodellen kan behandlingsgruppeforskelle i visuel funktion variere afhængigt af de anvendte parametre. For eksempel, når man tester kontrastfølsomhed, hvis den rumlige frekvens er indstillet til et niveau, der er over den normale rumlige frekvenstærskel og vanskelig at løse, vil forskellene i kontrastfølsomhed mellem grupper være små. Men hvis den rumlige frekvens er indstillet til et niveau, der normalt er let for rotter at se, vil forskellene i kontrastfølsomhed mellem grupper være større30. Derfor er det vigtigt at overveje undersøgelsesdesign og normale rumlige frekvenstærskler for gnavere, når der fastsættes parametre for udførelse af OMR.

Y-labyrinten

Hvis et dyr er bange, kan det fryse i et hjørne af labyrinten. Derudover, hvis der sker en høj støj uden for rummet, kan et dyr blive bange og ikke bevæge sig i labyrinten. For at tage højde for disse problemer kan forskere akklimatificer rotter til rummet først, flytte et frosset dyr til et valgpunkt, køre et dyr igen på en anden dag eller køre dyrene i rødt lys, hvilket menes at gøre dem mindre nervøse, da de normalt er aktive i mørke (Rachael Allens Lab - personlig kommunikation). Det anbefales også at køre Y-labyrinten på samme tid hver dag for at tage højde for ændringer i aktivitetsniveauet hele dagen på grund af døgnrytmer. Vi kører typisk rotterne før middag (Rachael Allens Lab - personlige observationer). Varigheden af et enkelt forsøg er 8 min (10 min, med oprydning). Vi kører aldrig mere end en retssag om dagen. Hvis der er behov for et yderligere forsøg, udføres forsøget på en anden dag. Kumulativ daglig tid til at køre en kohorte af rotter (n = 10) er 2-3 timer. Aldersrelaterede fald i rumlig vekslen blev observeret hos rotter i alderen 9-12 måneder og i sonderende adfærd ved 12 måneders alderen28.

Mens både sonderende adfærd og rumlig kognition falder hos diabetiske gnavere, synes de to ikke at være tæt korrelerede, og derfor evaluerer vi ikke selvstændigt lokomotorisk aktivitet forud for Y-labyrinttesten.

Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder

The OMR

Andre metoder til visuel funktionstest, såsom optokinetisk sporing, er afhængige af at fastgøre dyrets hoved på plads og spore øjenbevægelser. Uhæmmet optomotorisk respons (OMR) test giver mulighed for langsgående, ikke-invasiv og pålidelig måling af visuel funktion hos gnavere. I denne protokol blev det beskrevet, hvordan OMR kan bruges til at kvantificere både rumlige frekvens- og kontrastfølsomhedstærskler for hvert øje. Denne metode kan være meget nyttig til påvisning af tidlig fase neuronal dysfunktion i sygdomme som diabetes. Andre tests såsom den visuelle vandopgave kan også bruges til at måle rumlig frekvens31, men da dette indebærer træning gnavere til at svømme mod en gradient i en modificeret Y-labyrint, er opgaven tidskrævende og involverer en masse træning. Endvidere måler OMR værdier for hvert øje uafhængigt, hvilket er nyttigt i modeller, hvor skaden er rettet mod det ene øje, og det andet øje fungerer som en kontralateral kontrol (for eksempel mange glaukommodeller). Derudover er OMR en følsom vurdering, der er i stand til at opdage ændringer så tidligt som 3-4 uger efter diabetes, hvilket er hurtigere end andre visuelle vurderinger. Elektrofysiologiske analyser er et alternativ til adfærdsmæssige visuelle tests. Elektroretinografi (ERG) er mere tilgængelig end OMR og kan bestemme underskud i præcise celletyper ved hjælp af forskellige komponenter i ERG-bølgen32 (a- bølger repræsenterer fotoreceptorcellefunktion, b- bølger repræsenterer bipolar cellefunktion). I mellemtiden kan OMR bruges til at bestemme et underskud i visuel funktion uden at afsløre det præcise opdelingspunkt langs stien. OMR er imidlertid et mere følsomt mål for DR end ERG, med OMR-underskud, der typisk observeres mellem 2-4 uger efter hyperglykæmi og ERG-underskud, der typisk observeres 4-8 uger efter hyperglykæmi hos gnavere. Alvorlige diabetiske grå stær kan påvirke OMR. Diabetiske grå stær hos gnavere forekommer og/eller forværres under anæstesi, og dermed påvirkes test som ERG og optisk sammenhængstomografi, der kræver anæstesi, meget oftere, at OMR, som udføres hos vågne dyr.

Y-labyrinten

Y-labyrinten er afhængig af rumlig kognition som Morris vandlabyrinten, men bruger ikke en stærk negativ stimulus (dvs. vand) til at motivere dyret til at udføre opgaven. Således er Y-labyrinten mindre stressende for dyrene og er også lettere at udføre. Det er dog muligt, at Y-labyrinten måske ikke er så følsom som Morris-vandlabyrinten eller Barnes labyrinten. I modsætning til Morris vand labyrint, Y-labyrint er en automatisk adfærd og kræver ikke uddannelse. Således er tidsbyrden forbundet med at udføre Y-labyrinten meget lavere.

Konklusioner og fremtidige anvendelser eller anvisninger på metoden

The OMR

OMR er nyttig til at tage målinger af visuel funktion hos gnavere ved at spore hovedbevægelser. Det er en effektiv metode, men der er opdateringer og tilføjelser, der løbende foretages for at forbedre protokollen. Nogle nye metoder udnytter gnaveren, der sætter hovedet på pause som en negativ OMR-indikator kombineret med hovedsporing som en positiv indikator33. Dette muliggør hurtigere og mere præcise mål for visuel funktion34. En anden måde denne proces er blevet ændret, er at udvikle et system, der automatisk vil spore hovedet uden kunstige markører for at reducere uoverensstemmelser, der kan følge af menneskelige testere35. Fra 2016 er et automatiseret eller kvantitativt OMR-system kaldet qOMR blevet veludviklet og er kommercielt tilgængeligt. I ovennævnte protokol var OMR i stand til at opdage underskud i rumlig frekvens og kontrastfølsomhed hos diabetiske rotter samt beskyttelse mod underskud med en behandling (øvelse).

Y-labyrinten

Y-labyrinten afslører oplysninger om sonderende adfærd og rumlig kognition og blev brugt her til at opdage adfærdsmæssige underskud hos diabetiske gnavere på 7 uger. Andre tests for at observere kognitiv funktion findes (dvs. Morris vand labyrint, Barnes labyrint, nye objekt anerkendelse), og det er muligt, at disse tests kan være i stand til at afsløre kognitiv tilbagegang tidligere eller give oplysninger om forskellige aspekter af kognition. Fremtidige retninger for Y-labyrinten omfatter placering af et nyt objekt eller mad stimulus i en af armene og observere det sonderende mønster af gnaveren36. En variation af dette indebærer blokering af en af armene på Y-labyrinten, så gnaveren kan udforske de to resterende arme og derefter genåbne adgangen til den tredje arm og vurdere, hvor længe gnaveren tilbringer i den tredje nye arm. En anden værdifuld forbedring, der kunne foretages med hensyn til Y-labyrinten, er at udvikle automatisk sporing af gnavere for at registrere deres bevægelser. Dette ville fjerne behovet for manuel registrering af gnaverens bevægelser og gøre beregningerne af de spontane vekslen mere nøjagtige og effektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Department of Veterans Affairs Rehab R &D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) til RSA og (CDA-2, RX002342) til AJF og National Institutes of Health (NIH-NICHD F31 HD097918 til DACT og NIH-NIEHS T32 ES012870 til DACT) og NEI Core Grant P30EY006360.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OptoMotry HD CerebralMechanics Inc. OMR apparatus & software
Timer Thomas Scientific 810029AR
Y-Maze apparatus San Diego Instruments 7001-043 Available specifically for rats

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. IDF. International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edn. , Available from: https://diabetesatlas.org/upload/resources/material/20200302_133351_IDFATLAfinal-web.pdf (2019).
  2. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  3. Akpek, E. K., Smith, R. A. Overview of age-related ocular conditions. The American Journal of Managed Care. 19 (5), Suppl 67-75 (2013).
  4. Urano, F. Wolfram syndrome: diagnosis, management, and treatment. Current Diabetes Reports. 16 (1), 6 (2016).
  5. Adeva-Andany, M. M., Funcasta-Calderón, R., Fernández-Fernández, C., Ameneiros-Rodríguez, E., Domínguez-Montero, A. Subclinical vascular disease in patients with diabetes is associated with insulin resistance. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews. 13 (3), 2198-2206 (2019).
  6. Chin, J. A., Sumpio, B. E. Diabetes mellitus and peripheral vascular disease: diagnosis and management. Clinics in Podiatric Medicine and Surgery. 31 (1), 11-26 (2014).
  7. Barber, A. J., Gardner, T. W., Abcouwer, S. F. The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 1156-1163 (2011).
  8. Pardue, M. T., Allen, R. S. Neuroprotective strategies for retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 65, 50-76 (2018).
  9. Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
  10. Antonetti, D. A., et al. Diabetic retinopathy: seeing beyond glucose-induced microvascular disease. Diabetes. 55 (9), 2401-2411 (2006).
  11. Logroscino, G., Kang, J. H., Grodstein, F. Prospective study of type 2 diabetes and cognitive decline in women aged 70-81 years. BMJ. 328 (7439), 548 (2004).
  12. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
  13. Archibald, N. K., Clarke, M. P., Mosimann, U. P., Burn, D. J. The retina in Parkinson's disease. Brain. 132 (5), 1128-1145 (2009).
  14. Sakai, R. E., Feller, D. J., Galetta, K. M., Galetta, S. L., Balcer, L. J. Vision in multiple sclerosis: the story, structure-function correlations, and models for neuroprotection. Journal of Neuroophthalmology. 31 (4), 362-373 (2011).
  15. Wong, T. Y., et al. Retinal microvascular abnormalities and incident stroke: the Atherosclerosis Risk in Communities Study. The Lancet. 358 (9288), 1134-1140 (2001).
  16. Marquié, M., et al. Association between retinal thickness and β-amyloid brain accumulation in individuals with subjective cognitive decline: Fundació ACE Healthy Brain Initiative. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 37 (2020).
  17. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  18. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Vision Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  19. Maurice, T., et al. Behavioral evidence for a modulating role of σ ligands in memory processes. I. Attenuation of dizocilpine (MK-801)-induced amnesia. Brain Research. 647 (1), 44-56 (1994).
  20. Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22 (5), 677-684 (2005).
  21. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  22. Allen, R. S., et al. TrkB signalling pathway mediates the protective effects of exercise in the diabetic rat retina. European Journal of Neuroscience. 47 (10), 1254-1265 (2018).
  23. Allen, R. S., et al. Retinal deficits precede cognitive and motor deficits in a rat model of type II diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
  24. Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behavioural Brain Research. 136 (2), 339-348 (2002).
  25. Hwang, C. K., et al. Circadian rhythm of contrast sensitivity is regulated by a dopamine-neuronal PAS-domain protein 2-adenylyl cyclase 1 signaling pathway in retinal ganglion cells. Journal of Neuroscience. 33 (38), 14989-14997 (2013).
  26. Mui, A. M., et al. Daily visual stimulation in the critical period enhances multiple aspects of vision through BDNF-mediated pathways in the mouse retina. PLoS One. 13 (2), 0192435 (2018).
  27. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  28. Allen, R. S., et al. Long-term functional and structural consequences of primary blast overpressure to the eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
  29. Maaswinkel, H., Li, L. Spatio-temporal frequency characteristics of the optomotor response in zebrafish. Vision Research. 43 (1), 21-30 (2003).
  30. Benkner, B., Mutter, M., Ecke, G., Münch, T. A. Characterizing visual performance in mice: an objective and automated system based on the optokinetic reflex. Behavioral Neuroscience. 127 (5), 788-796 (2013).
  31. Lehmann, K., Schmidt, K. F., Löwel, S. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restorative Neurology and Neuroscience. 30, 161-178 (2012).
  32. Leinonen, H., Tanila, H. Vision in laboratory rodents-tools to measure it and implications for behavioral research. Behavioral Brain Research. 352, 172-182 (2018).
  33. Spielmann, M., Schröger, E., Kotz, S. A., Pechmann, T., Bendixen, A. Using a staircase procedure for the objective measurement of auditory stream integration and segregation thresholds. Frontiers in Psychology. 4, 534 (2013).
  34. Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708 (2018).
  35. You, M., Yamane, T., Tomita, H., Sugano, E., Akashi, T. A novel rat head gaze determination system based on optomotor responses. PLoS One. 12 (4), 0176633 (2017).
  36. Whyte, A. J., et al. Reward-related expectations trigger dendritic spine plasticity in the mouse ventrolateral orbitofrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 39 (23), 4595-4605 (2019).

Tags

Adfærd Problem 164 diabetisk retinopati nethinde Y-labyrint optomotorisk respons sonderende adfærd rumlig frekvens kontrastfølsomhed rumlig hukommelse spontan vekslen

Erratum

Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.

The author list was updated from:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

to:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

Adfærdsmæssig vurdering af visuel funktion via optomotorisk respons og kognitiv funktion via Y-Maze hos diabetiske rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gudapati, K., Singh, A.,… More

Gudapati, K., Singh, A., Clarkson-Townsend, D., Phillips, S. Q., Douglass, A., Feola, A. J., Allen, R. S. Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. J. Vis. Exp. (164), e61806, doi:10.3791/61806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter