Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Atferdsvurdering av visuell funksjon via optomotorisk respons og kognitiv funksjon via Y-labyrint hos diabetikerrotter

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61806
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1, 1,2, 1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Neuroscience, Emory University, 4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Nevral degenerasjon i både øyne og hjerne som følge av diabetes kan observeres gjennom atferdstester utført på gnagere. Y-labyrinten, et mål på romlig kognisjon, og den optomotoriske responsen, et mål på visuell funksjon, gir begge innsikt i potensielle diagnoser og behandlinger.

Abstract

Den optomotoriske responsen og Y-labyrinten er atferdstester som er nyttige for å vurdere henholdsvis visuell og kognitiv funksjon. Den optomotoriske responsen er et verdifullt verktøy for å spore endringer i spatial frekvens (SF) og kontrastfølsomhet (CS) terskler over tid i en rekke retinal sykdomsmodeller, inkludert diabetisk retinopati. På samme måte kan Y-labyrinten brukes til å overvåke romlig kognisjon (målt ved spontan veksling) og utforskende oppførsel (målt ved en rekke oppføringer) i en rekke sykdomsmodeller som påvirker sentralnervesystemet. Fordeler med den optomotoriske responsen og Y-labyrinten inkluderer følsomhet, testhastighet, bruk av medfødte svar (trening er ikke nødvendig), og evnen til å bli utført på våken (ikke-bedøvet) dyr. Her er protokoller beskrevet for både optomotorisk respons og Y-labyrinten og eksempler på deres bruk vist i modeller av type I og type II diabetes. Metoder inkluderer forberedelse av gnagere og utstyr, ytelse av optomotorisk respons og Y-labyrinten, og dataanalyse etter test.

Introduction

Over 463 millioner mennesker lever med diabetes, noe som gjør det til en av de største globale sykdomsepidemiene1. En av de alvorlige komplikasjonene som oppstår fra diabetes er diabetisk retinopati (DR), en ledende årsak til blindhet for amerikanske voksne i arbeidsalder2. I løpet av de neste 30 årene anslås prosentandelen av befolkningen som er i fare for DR å doble seg, så det er avgjørende å finne nye måter å diagnostisere DR på i sine tidligere stadier for å forhindre og redusere DR-utvikling3. DR har konvensjonelt blitt antatt å være en vaskulær sykdom4,5,6. Men nå med bevis på nevronal dysfunksjon og apoptose i netthinnen som går foran vaskulær patologi, er DR definert til å ha nevronale og vaskulære komponenter4,5,6,7,8,9. En måte å diagnostisere DR på ville være å undersøke nevrale abnormiteter i netthinnen, et vev som kan være mer sårbart for oksidativt stress og metabolsk belastning fra diabetes enn annet nevralt vev10.

Nedgang i kognitiv og motorisk funksjon forekommer også med diabetes og er ofte korrelert med retinal endringer. Eldre personer med type II diabetes skildrer dårligere baseline kognitiv ytelse og viser mer forverret kognitiv nedgang enn kontrolldeltakere11. I tillegg har netthinnen blitt etablert som en forlengelse av sentralnervesystemet, og patologier kan manifestere seg i netthinnen12. Klinisk har forholdet mellom netthinne og hjerne blitt studert i sammenheng med Alzheimers og andre sykdommer, men er ikke ofte utforsket med diabetes12,13,14,15,16. Endringer i hjernen og netthinnen under progresjonen av diabetes kan utforskes ved hjelp av dyremodeller, inkludert STZ-rotten (en modell av type I diabetes der toksin, streptozotocin eller STZ brukes til å skade bukspyttkjertel betaceller) og Goto-Kakizaki-rotten (en polygen modell av type II diabetes der dyr utvikler hyperglykemi spontant ved rundt 3 ukers alder). I denne protokollen er det gitt en beskrivelse av Y-labyrinten og den optomotoriske responsen for å vurdere kognitive og visuelle endringer i henholdsvis diabetiske gnagere. Den optomotoriske responsen (OMR) vurderer romlig frekvens (ligner synsskarphet) og kontrastfølsomhet ved å overvåke karakteristiske refleksive hodesporingsbevegelser for å måle visuelle terskler for hvert øye17. Romlig frekvens refererer til tykkelsen eller finheten på stolpene, og kontrastfølsomhet refererer til hvor mye kontrast det er mellom stolpene og bakgrunnen (figur 1E). I mellomtiden tester Y-labyrinten kortsiktig romlig minne og utforskende funksjon, observert gjennom spontane vekslinger og oppføringer gjennom labyrintens armer.

Begge testene kan utføres hos våken, ikke-bedøvede dyr og har fordelen av å utnytte medfødte respons fra dyrene, noe som betyr at de ikke krever trening. Begge er relativt følsomme, ved at de kan brukes til å oppdage underskudd tidlig i utviklingen av diabetes hos gnagere, og pålitelig, ved at de produserer resultater som korrelerer med andre visuelle, netthinne- eller atferdstester. I tillegg kan bruk av OMR og Y-labyrinten i forbindelse med tester som elektroretinogram og optisk koherenstomografiskanning gi informasjon om når netthinne-, strukturelle og kognitive endringer utvikler seg i forhold til hverandre i sykdomsmodeller. Disse undersøkelsene kan være nyttige for å identifisere nevrale degenerasjoner som oppstår på grunn av diabetes. Til syvende og sist kan dette føre til nye diagnostiske metoder som effektivt identifiserer DR i tidlige stadier av progresjon.

OMR- og Y-labyrintsystemene som brukes til å utvikle denne protokollen, er beskrevet i materialfortegnelsen. Tidligere forskning på OMR, av Prusky et al.18, og Y-labyrinten, av Maurice et al.19, ble brukt som utgangspunkt for å utvikle denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee og i samsvar med National Institutes of Health guide for pleie og bruk av laboratoriedyr (NIH Publications, 8. utgave, oppdatert 2011).

1. Den optomotoriske responsen (OMR)

  1. Sett opp OMR-apparatet (detaljer om apparater og programvare i Materialfortegnelser)
    1. Velg riktig plattform for gnageren: mus, rotte eller stor/svekket rotte (figur 1A).
    2. Åpne OMR-programvaren, som skal åpnes til et vindu med flere faner med alternativer og en live videofeed av innsiden av OMR / virtuell trommel (figur 1B). Zoom inn eller ut med videokameraet etter behov, slik at plattformen og omgivelsene er synlige.
    3. Legg merke til ikonene langs venstre side av live-bildet (figur 1C). Klikk på stjerneikonet og ikonet for roterende striper slik at både den grønne stjernen og de grønne roterende stripene forsvinner fra live feeden.
    4. Klikk på kompassikonet slik at en grønn sirkel og to vinkelrette linjer vises. Strekk den grønne sirkelen slik at den passer perfekt til den svarte sirkelen på plattformen, noe som vil sikre at OMR er perfekt justert.
    5. Klikk på kompassikonet fordi det ikke er nødvendig å se sirkelen under testing. Klikk på det grønne stjerneikonet og det grønne roterende stripeikonet for å få disse til å dukke opp igjen. Legg merke til at de grønne stripene roterer i samme retning som stripene i trommelen, slik at forskeren kan kjenne retningen på stripene.
    6. Klikk kategorien Testing . Klikk på Psykofysikk-fanen under Testing. Velg Frekvens under Terskelverdi for å måle romlig frekvens.
      MERK: OMR-programvaren bruker et trappparadigme til automatisk å beregne romlig frekvens (SF). Kontrasten opprettholdes på 100%.
    7. Klikk kategorien Forhåndsinnstillinger under Testing. Velg standardinnstillingene for Mus18 eller Rat20.
    8. Klikk kategorien Blanking under Testing. Merk av for Tom ved sporing , som vil sette stripene på pause / tømme dataskjermene i trommelen når musen høyreklikkes.
    9. Klikk kategorien Resultater , som er der resultatene av testen vises.
  2. Vurdere romlig frekvens
    1. Plasser gnageren på den sirkulære plattformen i midten av virtual reality-kammeret som består av fire dataskjermer som viser vertikale sinusbølgegitter som sirkler rundt kammeret med en hastighet på 12 ° / s (figur 1D).
    2. Merk at videokameraet plassert øverst i kammeret projiserer gnagerens oppførsel live på dataskjermen.
    3. Se etter tilstedeværelsen eller fraværet av refleksive handlinger av gnagerens hode når gitterene beveger seg i retning med eller mot klokken. Sørg for at illustrerte stolper er synlige i programmet – disse viser retningen på gitterbevegelsen.
      1. Se etter gnagerens hode å bevege seg i samme retning som gitterene. Vent til det er en jevn jakt, ikke uberegnelige utbrudd av hodebevegelse, for å telle det som sporing.
      2. Klikk ja eller nei etter behov. Vær oppmerksom på at SF starter med 0,042 cyc/deg og justerer med hvert ja og nei for å bli enklere eller vanskeligere (figur 1E). Klikk på Tilbakestill hvis testen må tilbakestilles på grunn av utilsiktet eller feil klikking av ja og nei.
    4. Når gnageren er testet, sørg for å holde stjernen plassert over gnagerens hode.
      MERK: Dette har to effekter: 1) Den opprettholder riktig romlig frekvens. Hvis stjernen er plassert mellom skuldrene, for eksempel, vil den romlige frekvensen være lavere og stolpene blir lettere å se, noe som resulterer i en falsk høy poengsum. 2) For gnagere med små hodebevegelser gjør stjernen det lettere å måle om hodet faktisk beveger seg.
    5. Se etter systemet å si "Ferdig" når gnagerens romlige frekvens er nådd. Legg merke til at Ja- og Nei-knappene ikke lenger kan klikkes.
    6. Klikk på Resultater-fanen , som viser romlig frekvens for venstre øye, høyre øye og kombinerte øyne.
      MERK: Noen ganger er programvaren satt slik at resultatene vendes, det vil si at høyre øye rapporteres som venstre øye og venstre øye rapporteres som høyre øye. Dette ble oppdaget ved vurdering av gnagere som bare hadde ett øye lesjonert i en glaukommodell.
  3. Vurdere kontrastfølsomhet
    MERK: Testing av kontrastfølsomhet kan utføres umiddelbart etter det romlige frekvensmålingstrinnet eller alene på samme dag eller en annen dag hvis gnageren virker utmattet etter romlig frekvenstesting (følg trinn 1–2.2 hvis du bare tester kontrastfølsomhet).
    1. Klikk kategorien Testing , og klikk deretter kategorien Psykofysikk . Velg Kontrast (enkel) under Terskelverdi for å måle kontrastfølsomheten.
    2. Også ved hjelp av et trappparadigme, start gitter med SF konstant på toppen av kontrastfølsomhet (CS) kurven. For å gjøre dette, klikk på Stimulus-fanen og deretter på Gitter-fanen . I romlig frekvens-boksen skriver du inn 0,064 for rotter og 0,103 for mus.
    3. Begynn kontrasten på 100% og se etter de samme refleksive hodebevegelsene som sett under romlig frekvenstesting. Legg merke til at kontrasten vil avta etter hvert som testingen skrider frem til gnageren ikke lenger har refleksive hodebevegelser som svar på stimulansen (figur 1E).
    4. Se etter at systemet sier "Ferdig" og Ja og Nei-knappene ikke lenger kan klikkes når gnageren ikke lenger reagerer på den visuelle stimulansen og kontrastfølsomhetsterskelen er nådd. Klikk på Resultater-fanen , der kontrastfølsomheten for venstre øye, høyre øye og kombinerte øyne vil bli oppført.
  4. Utføre analyse etter testing
    1. For diabetisk retinopatistudier, hvor begge øynene forventes å ha lignende underskudd, bruk den kombinerte poengsummen (gjennomsnitt av høyre og venstre øyne) for analyse. For modeller som forårsaker differensialskader på øynene (dvs. eksplosjonsskader eller glaukom), hold venstre og høyre øyedata atskilt.
    2. For romlig frekvens bruker du råresultater (dataene fra kategorien Resultater ) for analyse og beregner gjennomsnittet av disse poengsummene sammen etter gruppe (dvs. diabetiker, kontroll osv.).
    3. For Kontrastfølsomhet bruker du råverdien til å beregne michelson-kontrastens rapporterte kontrastfølsomhet fra et tidligere mål på skjermens lystetthet.

2. Y-labyrinten

  1. Forbered gnagere for testing
    1. Tilpass gnagere til rommet i 30 min før testing.
      MERK: Forskeren kan forbli i rommet med lysene på, men bør være stille i løpet av denne tiden.
    2. Rengjør Y-labyrinten med desinfiserende løsning trygt for dyr og tørk bort all desinfiseringsløsning med papirhåndklær. Forsikre deg om at labyrinten er tørr.
  2. Utfør Y-labyrinten
    1. Merk den første armen på Y-labyrinten som B og de andre 2 armene som A og C (figur 2A). Plasser en gnager i armen nærmest forskeren (arm B) nær midten av Y-labyrinten. Når gnageren er plassert, start timeren (detaljer om labyrint og timer i materialtabellen).
      1. Tillat hver gnager å utforske Y-labyrinten i 8 min. Ta opptak i løpet av denne tiden og noter eventuelle observasjoner. Sitt noen meter unna labyrinten mens du holder den i sikte og unngå å lage støy.
      2. Registrer startstedet som A, og hver gang gnageren gjør en inngang i en ny arm, registrer den nye plasseringen av gnageren (figur 2B). Definer en oppføring som alle fire lemmer av gnageren som er i en av armene.
      3. Se etter gnagere å gjemme seg og forbli stasjonære i en arm av labyrinten. Hvis gnageren forblir på samme sted i mer enn 60 s og ikke ser ut til å vise utforskende oppførsel, flytt gnageren mot midten av Y-labyrinten, og fortsett rettssaken.
    2. Etter hver gnager, fjern avføring og rengjør labyrinten med desinfiserende løsning.
      1. Forsikre deg om at all desinfiseringsløsning tørkes bort med papirhåndklær, og labyrinten er helt tørr før du plasserer neste gnager i labyrinten.
  3. Beregn spontan veksling og utforskende atferd
    1. Beregn utforskende atferd som totalt antall oppføringer gjort i løpet av 8 min.
    2. Beregn romlig kognisjon målt ved spontan veksling:
      antall vellykkede vekslinger/(totalt antall oppføringer - 2)
      1. Definer en vellykket veksling når gnageren beveger seg inn på tre forskjellige steder sekvensielt (Eksempel: ABC, CAB, BCA, etc.). Legg merke til hver vellykkede veksling (figur 2B).
      2. Hvis bevegelsene ble registrert som ACABCABABCABC, se bort fra de to første startstedene ved beregning av spontan veksling (slik at det er 11 bevegelser i nevneren). Tell antall nøyaktige bevegelser (nøyaktige bevegelser = 8). Beregn prosentnøyaktigheten som: 8/(13 - 2) = 72,7 %.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OMR anses å være vellykket hvis romlig frekvens og kontrastfølsomhetsterskler kan fås fra en gnager. Her illustreres bruken av OMR for å vurdere romlig frekvens i naiv kontroll Brown-Norway og Long-Evans rotter, både unge (3-6 måneder) og i alderen (9-12 måneder). Brun-Norge rotter viser vanligvis en høyere baseline romlig frekvens enn Long-Evans rotter. I tillegg ble det observert en aldrende effekt på romlig frekvens hos Long-Evans rotter (figur 3A). Data ble analysert ved hjelp av en enveis ANOVA etterfulgt av Holms-Sidak post-hoc sammenligninger som de unge og aldrende resultatene kom fra forskjellige kohorter.

Bruken av OMR for å vurdere kontrastfølsomhet er illustrert i STZ-modellen for type I diabetes som fikk treningsintervensjonsbehandling. Long-Evans rotter ble tildelt en av de fire gruppene: kontroll, kontroll + aktiv, diabetiker og diabetiker + aktiv. Diabetiske rotter fikk intravenøse injeksjoner av toksinet STZ for å skade bukspyttkjertelen betaceller og indusere hyperglykemi. Aktive rotter fikk 30 min tredemølletrening, 5 dager i uken. Inaktive rotter hadde en låst tredemølle. Signifikante underskudd i kontrastfølsomhet (figur 3B) ble observert hos diabetikerrotter. Treningsbehandling reduserte disse underskuddene (figur 3B). Disse resultatene viser at OMR er nyttig både for å oppdage og spore retinal underskudd over tid og for å vurdere effekten av behandlinger og intervensjoner på retinal sykdom22. Data ble analysert ved hjelp av toveis gjentatte tiltak ANOVA etterfulgt av Holms-Sidak post-hoc sammenligninger. Vær oppmerksom på at resultatene kan presenteres som data som er normalisert for kontroll (figur 3B) eller som råverdier (figur 3A, for romlig frekvens: i sykluser/grad eller c/d; for kontrastfølsomhet: vilkårlige enheter eller a.u.). Vanligvis er 6-10 dyr, avhengig av alvorlighetsgraden av skade, nødvendig for å finne en betydelig forskjell med OMR.

Y-labyrinten anses å være vellykket hvis gnageren kommer inn i minst 5 armer av labyrinten innen 8 minutter. Her er Y-labyrintens evne til å vurdere kognitiv funksjon og utforskende oppførsel illustrert i Goto-Kakizaki-rotten, en polygen, ikke-overvektig modell av type II diabetes som utvikler moderat hyperglykemi fra 2-3 uker og krever ikke insulintilskudd. Signifikante underskudd i romlig kognisjon, målt ved spontan veksling (figur 4A) og utforskende atferd, målt ved antall oppføringer (figur 4B), ble observert hos Goto-Kakizaki-rotter sammenlignet med Wistar-kontroller fra 7 ukers alder. Kontrollrotter ser ut til å vise en nedgang i utforskende oppførsel fra 4 til 8 uker. Denne trenden observeres også i langtidsstudier (8+ måneder). Nedgangen i bevegelse kan skyldes mangel på nyhet med gjentatt labyrinteksponering eller en generell redusert bevegelse med alderen. Kontrollrotter ser ut til å vise en økning i romlig kognisjon fra 4 til 8 uker. Denne trenden observeres ikke i langsiktige studier der dyrene kjøres månedlig i stedet for ukentlig (faktisk observeres en nedgang med aldring ofte), og dermed kan denne økningen i romlig kognisjon skyldes en læringseffekt av å kjøre labyrinten en gang i uken. Data ble analysert ved hjelp av toveis gjentatte tiltak ANOVA etterfulgt av Holms-Sidak post-hoc sammenligninger. Minst 10 dyr, avhengig av alvorlighetsgraden av skade, er vanligvis nødvendig for å finne en betydelig forskjell med Y-labyrinten.

Denne protokollen genererte visuelle funksjons- og kognitive funksjonsdata i modeller av type I og type II diabetes. Skår for enkelte dyr ble gjennomsnittet sammen og brukt til å oppdage signifikante forskjeller mellom behandlingsgrupper tidlig i utviklingen av diabetes. Å utføre både retinal og kognitive vurderinger over tid i modeller av systemiske sykdommer som diabetes tillater overvåking av det tidsmessige utseendet av underskudd over tid. I Goto-Kakizaki-modellen ble det for eksempel vist seg at retinalfunksjonsunderskudd gikk foran kognitive og utforskende atferdsunderskudd23 (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Oppsett av OMR-utstyret. (A) Bilde av mus, rotte og store eller svekkede rotteplattformer. (B) Bilde av dataskjerm under testing. (C) Panel av knapper under testing. (D) Skjematisk for rotte på plattform i kammer. (E) Eksempelstigninger som viser økende romlig frekvens og kontrastfølsomhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oppsett av Y-labyrintutstyret. (A) Bilde av Y-labyrinten med armene merket. (B) Bilde av en labnotatblokk med eksempel på Y-labyrintopptaket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bruke OMR til å spore visuell funksjon. (A) Romlige frekvensterskler for unge (n = 11) og eldre (n = 15) Brown-Norway (BN) og unge (n = 20) og alderen (n = 13) Long-Evans (LE)-rotter. Dette tallet presenterer Brown-Norway data fra Feola et al., 201921. (B) Bruke OMR til å spore redusert retinal funksjon over tid og beskyttende effekter av trening i en STZ rotte modell av type I diabetes. Kontrastfølsomhetsterskler for inaktive diabetikerrotter vs. aktive diabetikerrotter og kontrollrotter. Mørkegrå stjerner representerer forskjeller mellom både kontrollgrupper og begge diabetikergruppene. Oransje stjerner representerer forskjeller mellom inaktive diabetikerrotter og aktive diabetikerrotter. Denne figuren presenterer data fra et delsett av rotter fra Allen et al., 201822. Gjennomsnitt ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bruke Y-labyrinten til å spore kognitiv funksjon og utforskende atferd over tid i Goto-Kakizaki-modellen av type II diabetes sammenlignet med Wistar-kontroller. (A) Kognitiv funksjon (spontan veksling) for Goto-Kakizaki (diabetiker) og Wistar (kontroll) rotter fra 4 til 8 uker. (B) Utforskende atferd (antall oppføringer) fra 4 til 8 ukers alder. Gjennomsnitt ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Stjerner representerer forskjeller mellom Goto-Kakizaki og Wistar rotter på hvert tidspunkt. Bare en kohort av rotter ble kjørt fra 4 uker til 8 uker (GK: n = 7; Wistar: n = 10). Alle andre kohorter ble kjørt fra 5 uker til 8 uker (GK: n = 22; Wistar: n = 23) for totalt n av 29 (GK) og 33 (Wistar) i uke 5 til og med 8. Dette tallet er endret fra Allen et al., 201923. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Tidslinje over funksjonelle endringer i Goto-Kakizaki-modellen av type II diabetes. Etter utseendet av hyperglykemi var de første endringene observert i Goto-Kakizaki-rotten i retinal funksjon, målt ved elektroretinogram (ERG), som vises ved 4 ukers alder. Kognitive og utforskende atferdsendringer dukket opp etter 6 ukers alder. Dette tallet er endret fra Allen et al., 201923. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OMR og Y-labyrinten tillater ikke-invasiv vurdering av visuell funksjon og kognitive funksjonsunderskudd hos gnagere over tid. I denne protokollen ble OMR og Y-labyrinten demonstrert for å spore visuelle og kognitive underskudd i gnagermodeller av diabetes.

Kritiske trinn i protokollen

The OMR

Noen viktige punkter å vurdere når du utfører OMR for å vurdere visuell funksjon er testparametrene som brukes, eksperimentell design og tidspunkt for testing, og erfaring fra forskeren som utfører målingene. Et av de mer kritiske trinnene i protokollen er å sørge for at parameterne er riktig angitt. I tillegg, som en del av oppsettet, bør OMR-kammeret rengjøres med desinfiseringsløsning eller et annet godkjent desinfeksjonsmiddel før og etter hver gnager. Det er også viktig at forskeren som utfører tiltakene er opplært og har erfaring med å utføre tiltakene. Beste resultater ses når gnagere er rolige og akklimatiserte til rommet ved å forlate dem i burene sine i 30 minutter før du starter eksperimentet. Det er også viktig å bestemme baseline romlig frekvens og kontrastfølsomhet når du begynner å arbeide med en ny stamme, og å merke seg at ikke alle stammer vil vise de samme baselinenivåene. Brun-Norge rotter har større baseline romlig frekvens enn Long-Evans rotter. I mellomtiden ser det ut til at noen stammer av albinorotter har kompromittert romlig frekvens24, mens andre stammer av albinorotter ikke viser sporingsadferd i det hele tatt. Mange faktorer kan bidra til begrenset respons av albino dyr på OMR: forstyrret kikkert på grunn av differensial decussation av optiske nervefibre, mangel på melanin i baksiden av øyet, og stor andel av dual opsin kjegler. Uansett kan albinorotter ikke være passende emner for OMR-testing siden ytelsen deres kan være for nær deteksjonsgrensen.

Y-labyrinten

En kritisk komponent i å utføre Y-labyrinten innebærer å minimere forstyrrelser i opptaksperioden. Den første plasseringen av gnageren i labyrinten bør bare gjøres etter at gnageren kan akklimatisere seg til rommet i 30 min. Dette gjør at gnageren kan bli justert til det nye miljøet og forhindrer at forvirrende faktorer påvirker gnagerens normale oppførsel. Det er svært viktig å minimere forstyrrelser under hver prøve. Dette inkluderer å unngå høye lyder og sørge for at forskeren er ute av syne av gnageren. Disse distraksjonene kan forårsake stress for gnageren. Det er også viktig å merke seg at veggene i rommet skal forbli så nakne som mulig med en nøytral farge. Eventuelle lyse farger på veggene eller plakatene kan distrahere gnageren og kan påvirke deres utforskende atferdsmønster.

Begrensninger ved metode og modifikasjoner og feilsøking av metoden

The OMR

En potensiell begrensning av OMR er at den kan påvirkes av eksperimenteringsbias, og forskjellige eksperimenter kan ha litt forskjellige resultater siden OMR-poengsummen er subjektiv. Det kan være lett å gå glipp av en hodebevegelse som er for subtil eller klassifiserer utforskende oppførsel som hodebevegelse. Fordi bias kan påvirke OMR-resultatene, er det best hvis eksperimentet er maskert til behandlingsgruppe og studiedesign når det er mulig. Utviklingen av en automatisk OMR eller sammenligning av resultatene fra to testere kan også bidra til å redusere eksperimenteringsbias.

Et vanlig problem som kan oppstå under OMR-testingen er når gnageren gjentatte ganger hopper av plattformen, noe som gjør det vanskelig å oppnå en visuell terskel. Hvis dette skjer, legg merke til det og legg forsiktig rotten tilbake på plattformen; det kan også være nødvendig å måle rotten igjen neste dag. I tillegg kan rotter som aldri har blitt målt før, delta i utforskende atferd når de plasseres i OMR. Hvis dette er et problem, kan det å ha et ekstra basislinjemål en uke eller så etter den første målingen bidra til å forbedre nøyaktigheten. Tester med store mengder av disse virkemåtene bør forkastes.

Andre faktorer som alder eller olfaktoriske signaler kan også bidra til uønsket aktivitet. Derfor er det viktig å designe eksperimenter i samsvar med tidslinjen for visuell systemutvikling hos rotter og å rengjøre plattformen og kammeret grundig før og etter testing av hver gnager. Tidspunktet på dagen OMR-målingene utføres bør også vurderes, da tidligere studier har vist at det er døgnrytmer i romlig frekvens25. Å kjøre rottene før middag ser ut til å være best for deres fokus (Rachael Allens lab - personlige observasjoner). Hvis rotter blir for distrahert, kan det bidra til å forsiktig trykke på utsiden av OMR.

Hastigheten som testingen utføres med, kan også påvirke resultatene. Tiltak kan bli mindre nøyaktige etter 30 minutter eller så hvis gnagere mister interessen for stimulansen. Derfor kan mer nøyaktige resultater oppnås når målinger tas på ca. ≤20 min. Varigheten av en enkelt prøveperiode (for enten SF eller CS) er 5-10 min for en ekspert og 30 min for en nybegynner. Hvis en gnager viser liten bevegelse, tilbringer mesteparten av sin tid grooming, eller på annen måte ikke ser i retning av stolpene, kan det være utmattet. Gnaven kan kjøres igjen på en annen dag. I tillegg kan SF- og CS-testing utføres på forskjellige dager, spesielt for nyere testere som kan være tregere. Hvor ofte testen utføres, kan også påvirke resultatene – hvis du utfører den ukentlig eller annenhver uke, hjelper dyrene med å holde seg akklimatiserte til testen, men å utføre den hver dag eller annenhver dag kan forårsake hyperacuity26. Vi kjører ikke mer enn en prøveperiode per dag, selv om vi ofte kjører både SF og CS på samme dag eller til og med i samme sittende. Kumulativ daglig tid for å kjøre en kohort av rotter (n = 10) er 2 timer for en ekspert.

OMR måler hvert øye uavhengig, noe som resulterer i separate visuelle score for hvert øye. I Morrison- og mikrobeadmodellene av glaukom og i en optisk nerveknusingsmodell har laboratoriet vårt ikke observert noen innvirkning av det skadede øyet på det uskadede øyet27. I en eksplosjonsmodell, med eksplosjonen rettet mot ett øye, viste det kontralaterale øyet skade, men dette kan også skyldes en delvis eksplosjonseffekt28. I kontrollrotter bør det ikke være noen forskjell i resultater mellom retninger med eller mot klokken, men noen gnagere kan ha en skjevhet; Dermed ville det være best å skifte veibeskrivelse29, hvis OMR-systemet ikke veksler automatisk.

Avhengig av sykdomsmodellen kan behandlingsgruppeforskjellene i visuell funksjon variere basert på parametrene som brukes. Hvis for eksempel den romlige frekvensen er satt til et nivå som er over den normale terskelverdien for romlig frekvens og vanskelig å løse, vil forskjellene i kontrastfølsomhet mellom grupper være små. Men hvis den romlige frekvensen er satt til et nivå som normalt er lett for rotter å se, vil forskjellene i kontrastfølsomhet mellom grupper være større30. Derfor er det viktig å vurdere studiedesign og normale romlige frekvensterskler av gnagere når du angir parametere for å utføre OMR.

Y-labyrinten

Hvis et dyr er redd, kan det fryse i ett hjørne av labyrinten. I tillegg, hvis en høy støy skjer utenfor rommet, kan et dyr bli redd og ikke bevege seg i labyrinten. For å ta hensyn til disse problemene kan forskere akklimatisere rotter til rommet først, flytte et frossent dyr til et valgpunkt, kjøre et dyr igjen på en annen dag, eller kjøre dyrene i rødt lys, noe som antas å gjøre dem mindre nervøse da de normalt er aktive i mørket (Rachael Allen's Lab - personlig kommunikasjon). Det anbefales også å kjøre Y-labyrinten til samme tid hver dag for å gjøre rede for endringer i aktivitetsnivået gjennom dagen på grunn av døgnrytme. Vi kjører vanligvis rottene før middagstid (Rachael Allen's Lab – personlige observasjoner). Varigheten av en enkelt prøveperiode er 8 min (10 min, med opprydding). Vi kjører aldri mer enn én prøveperiode per dag. Hvis en ekstra prøveperiode er nødvendig, utføres prøveperioden en annen dag. Kumulativ daglig tid for å kjøre en kohort av rotter (n = 10) er 2-3 timer. Aldersrelaterte reduksjoner i romlig veksling ble observert hos rotter ved 9-12 måneders alder og i utforskende oppførsel ved 12 måneders alder28.

Mens både utforskende oppførsel og romlig kognisjon reduseres hos diabetiske gnagere, ser de to ikke ut til å være tett korrelert, og dermed evaluerer vi ikke selvstendig lokomotorisk aktivitet før Y-labyrinttestingen.

Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder

The OMR

Andre metoder for visuell funksjonstesting, for eksempel optokinetisk sporing, er avhengige av å fikse dyrets hode på plass og spore øyebevegelser. Unrestrained optomotorisk respons (OMR) testing gir mulighet for langsgående, ikke-invasiv og pålitelig måling av visuell funksjon hos gnagere. I denne protokollen ble det beskrevet hvordan OMR kan brukes til å kvantifisere både romlige frekvens- og kontrastfølsomhetsterskler for hvert øye. Denne metoden kan være svært nyttig for å oppdage tidlig stadium nevronal dysfunksjon i sykdommer som diabetes. Andre tester som den visuelle vannoppgaven kan også brukes til å måle romlig frekvens31, men da dette innebærer å trene gnagere til å svømme mot en gradient i en modifisert Y-labyrint, er oppgaven tidkrevende og innebærer mye trening. Videre måler OMR verdier for hvert øye uavhengig, noe som er nyttig i modeller der skade er rettet mot det ene øyet og det andre øyet fungerer som en kontralateral kontroll (for eksempel mange glaukommodeller). I tillegg er OMR en sensitiv vurdering, i stand til å oppdage endringer så tidlig som 3-4 uker etter diabetes, noe som er raskere enn andre visuelle vurderinger. Elektrofysiologiske analyser er et alternativ til atferdsmessige visuelle tester. Elektroretinografi (ERG) er mer tilgjengelig enn OMR og kan bestemme underskudd i presise celletyper ved hjelp av forskjellige komponenter i ERG wave32 (a-bølger representerer fotoreseptorcellefunksjon, b-bølger representerer bipolar cellefunksjon). I mellomtiden kan OMR brukes til å bestemme et underskudd i visuell funksjon, uten å avsløre det nøyaktige sammenbruddspunktet langs banen. Imidlertid er OMR et mer følsomt mål på DR enn ERG, med OMR-underskuddene som vanligvis observeres mellom 2-4 uker etter hyperglykemi og ERG-underskudd, observert vanligvis 4-8 uker etter hyperglykemi hos gnagere. Alvorlige diabetikere kan påvirke OMR. Imidlertid vises diabetiske grå stær hos gnagere og / eller forverres under anestesi, og dermed påvirkes tester som ERG og optisk koherenstomografi som krever anestesi mye oftere at OMR, som utføres hos våken dyr.

Y-labyrinten

Y-labyrinten er avhengig av romlig kognisjon som Morris vann labyrint, men bruker ikke en sterk negativ stimulans (dvs. vann) for å motivere dyret til å utføre oppgaven. Dermed er Y-labyrinten mindre stressende for dyrene og er også lettere å utføre. Det er imidlertid mulig at Y-labyrinten kanskje ikke er så følsom som Morris vann labyrint eller Barnes labyrinten. I motsetning til Morris vann labyrint, er Y-labyrinten en automatisk oppførsel og krever ikke trening. Dermed er tidsbyrden som er involvert i å utføre Y-labyrinten mye lavere.

Konklusjoner og fremtidige anvendelser eller retninger av metoden

The OMR

OMR er nyttig for å ta målinger av visuell funksjon hos gnagere ved å spore hodebevegelser. Det er en effektiv metode, men det er oppdateringer og tillegg som kontinuerlig gjøres for å forbedre protokollen. Noen nye metoder bruker gnageren som stopper hodet som en negativ OMR-indikator kombinert med hodesporing som en positiv indikator33. Dette muliggjør raskere og mer nøyaktige mål på visuell funksjon34. En annen måte denne prosessen er endret på er å utvikle et system som automatisk vil spore hodet uten kunstige markører for å redusere inkonsekvenser som kan skyldes menneskelige testere35. Fra og med 2016 er et automatisert eller kvantitativt OMR-system kalt qOMR godt utviklet og er kommersielt tilgjengelig. I protokollen ovenfor var OMR i stand til å oppdage underskudd i romlig frekvens og kontrastfølsomhet hos diabetikerrotter, samt beskyttelse mot underskudd med behandling (trening).

Y-labyrinten

Y-labyrinten avslører informasjon om utforskende oppførsel og romlig kognisjon og ble brukt her for å oppdage atferdsunderskudd hos diabetikere gnagere etter 7 uker. Andre tester for å observere kognitiv funksjon eksisterer (dvs. Morris vann labyrint, Barnes labyrint, ny objektgjenkjenning), og det er mulig at disse testene kan være i stand til å avsløre kognitiv nedgang tidligere eller gi informasjon om ulike aspekter av kognisjon. Fremtidige retninger for Y-labyrinten inkluderer å plassere et nytt objekt eller mat stimulans i en av armene og observere det utforskende mønsteret til gnageren36. En variasjon av dette innebærer å blokkere en av armene til Y-labyrinten, slik at gnageren kan utforske de to gjenværende armene, og deretter gjenåpne tilgangen til den tredje armen og evaluere hvor lenge gnageren tilbringer i den tredje nye armen. En annen verdifull forbedring som kan gjøres angående Y-labyrinten, utvikler automatisk sporing av gnagere for å registrere bevegelsene sine. Dette ville eliminere behovet for manuell registrering av gnagernes bevegelser og ville gjøre beregninger av spontane vekslinger mer nøyaktige og effektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) til RSA og (CDA-2, RX002342) til AJF og National Institutes of Health (NIH-NICHD F31 HD097918 til DACT og NIH-NIEHS T32 ES012870 til DACT) og NEI Core Grant P30EY006360.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OptoMotry HD CerebralMechanics Inc. OMR apparatus & software
Timer Thomas Scientific 810029AR
Y-Maze apparatus San Diego Instruments 7001-043 Available specifically for rats

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. IDF. International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edn. , Available from: https://diabetesatlas.org/upload/resources/material/20200302_133351_IDFATLAfinal-web.pdf (2019).
  2. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  3. Akpek, E. K., Smith, R. A. Overview of age-related ocular conditions. The American Journal of Managed Care. 19 (5), Suppl 67-75 (2013).
  4. Urano, F. Wolfram syndrome: diagnosis, management, and treatment. Current Diabetes Reports. 16 (1), 6 (2016).
  5. Adeva-Andany, M. M., Funcasta-Calderón, R., Fernández-Fernández, C., Ameneiros-Rodríguez, E., Domínguez-Montero, A. Subclinical vascular disease in patients with diabetes is associated with insulin resistance. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews. 13 (3), 2198-2206 (2019).
  6. Chin, J. A., Sumpio, B. E. Diabetes mellitus and peripheral vascular disease: diagnosis and management. Clinics in Podiatric Medicine and Surgery. 31 (1), 11-26 (2014).
  7. Barber, A. J., Gardner, T. W., Abcouwer, S. F. The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 1156-1163 (2011).
  8. Pardue, M. T., Allen, R. S. Neuroprotective strategies for retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 65, 50-76 (2018).
  9. Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
  10. Antonetti, D. A., et al. Diabetic retinopathy: seeing beyond glucose-induced microvascular disease. Diabetes. 55 (9), 2401-2411 (2006).
  11. Logroscino, G., Kang, J. H., Grodstein, F. Prospective study of type 2 diabetes and cognitive decline in women aged 70-81 years. BMJ. 328 (7439), 548 (2004).
  12. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
  13. Archibald, N. K., Clarke, M. P., Mosimann, U. P., Burn, D. J. The retina in Parkinson's disease. Brain. 132 (5), 1128-1145 (2009).
  14. Sakai, R. E., Feller, D. J., Galetta, K. M., Galetta, S. L., Balcer, L. J. Vision in multiple sclerosis: the story, structure-function correlations, and models for neuroprotection. Journal of Neuroophthalmology. 31 (4), 362-373 (2011).
  15. Wong, T. Y., et al. Retinal microvascular abnormalities and incident stroke: the Atherosclerosis Risk in Communities Study. The Lancet. 358 (9288), 1134-1140 (2001).
  16. Marquié, M., et al. Association between retinal thickness and β-amyloid brain accumulation in individuals with subjective cognitive decline: Fundació ACE Healthy Brain Initiative. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 37 (2020).
  17. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  18. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Vision Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  19. Maurice, T., et al. Behavioral evidence for a modulating role of σ ligands in memory processes. I. Attenuation of dizocilpine (MK-801)-induced amnesia. Brain Research. 647 (1), 44-56 (1994).
  20. Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22 (5), 677-684 (2005).
  21. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  22. Allen, R. S., et al. TrkB signalling pathway mediates the protective effects of exercise in the diabetic rat retina. European Journal of Neuroscience. 47 (10), 1254-1265 (2018).
  23. Allen, R. S., et al. Retinal deficits precede cognitive and motor deficits in a rat model of type II diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
  24. Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behavioural Brain Research. 136 (2), 339-348 (2002).
  25. Hwang, C. K., et al. Circadian rhythm of contrast sensitivity is regulated by a dopamine-neuronal PAS-domain protein 2-adenylyl cyclase 1 signaling pathway in retinal ganglion cells. Journal of Neuroscience. 33 (38), 14989-14997 (2013).
  26. Mui, A. M., et al. Daily visual stimulation in the critical period enhances multiple aspects of vision through BDNF-mediated pathways in the mouse retina. PLoS One. 13 (2), 0192435 (2018).
  27. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  28. Allen, R. S., et al. Long-term functional and structural consequences of primary blast overpressure to the eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
  29. Maaswinkel, H., Li, L. Spatio-temporal frequency characteristics of the optomotor response in zebrafish. Vision Research. 43 (1), 21-30 (2003).
  30. Benkner, B., Mutter, M., Ecke, G., Münch, T. A. Characterizing visual performance in mice: an objective and automated system based on the optokinetic reflex. Behavioral Neuroscience. 127 (5), 788-796 (2013).
  31. Lehmann, K., Schmidt, K. F., Löwel, S. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restorative Neurology and Neuroscience. 30, 161-178 (2012).
  32. Leinonen, H., Tanila, H. Vision in laboratory rodents-tools to measure it and implications for behavioral research. Behavioral Brain Research. 352, 172-182 (2018).
  33. Spielmann, M., Schröger, E., Kotz, S. A., Pechmann, T., Bendixen, A. Using a staircase procedure for the objective measurement of auditory stream integration and segregation thresholds. Frontiers in Psychology. 4, 534 (2013).
  34. Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708 (2018).
  35. You, M., Yamane, T., Tomita, H., Sugano, E., Akashi, T. A novel rat head gaze determination system based on optomotor responses. PLoS One. 12 (4), 0176633 (2017).
  36. Whyte, A. J., et al. Reward-related expectations trigger dendritic spine plasticity in the mouse ventrolateral orbitofrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 39 (23), 4595-4605 (2019).

Tags

Atferd Utgave 164 diabetisk retinopati netthinne Y-labyrint optomotorisk respons utforskende oppførsel romlig frekvens kontrastfølsomhet romlig minne spontan veksling

Erratum

Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.

The author list was updated from:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

to:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

Atferdsvurdering av visuell funksjon via optomotorisk respons og kognitiv funksjon via Y-labyrint hos diabetikerrotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gudapati, K., Singh, A.,… More

Gudapati, K., Singh, A., Clarkson-Townsend, D., Phillips, S. Q., Douglass, A., Feola, A. J., Allen, R. S. Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. J. Vis. Exp. (164), e61806, doi:10.3791/61806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter